Name: חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: חקור את שיטת CLARITY לניקוי רקמות מוח בעכברים לחשיפת אינטראקציות מרחביות בין אסטרוציטים לנוירונים בהיפוקמפוס. טכניקה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציית תא בודד לחקירת ארגון תאי מוחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 803589), מהקרן הישראלית למדע (מענק ISF מס' 1815/18) ומענקי קנדה-ישראל (CIHR-ISF, מענק מס' 2591/18). אנו מודים לנחמה נוביק על ההערה על כתב היד כולו.

פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה העברית ועמדו בהנחיות המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.
1. התמרה וקטורית ויראלית
הערה: התמרה וקטורית נגיפית משמשת לביטוי פלואורופורים במוח.
<ol><li>השתמש באטלס (למשל, אטלס המוח של אלן) כדי לאתר את התיאום הרלוונטי של אזור המטרה. הערה: אטלסים תלת-ממדיים ניתן למצוא באינטרנט (למשל, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).</li>
	<li>באמצעות ניתוח סטריאוטקטי, להזריק את הווקטורים הנגיפיים למבנה המוח הרלוונטי. ראה9 לפרוטוקול מפורט.</li>
	<li>יש להמתין 3-6 שבועות לביטוי פלואורופור. הערה: פרק זמן קצר מספיק אם יש לסמן רק את גופי התאים. יהיה צורך בפרק זמן ארוך אם התחזיות האקסונאליות רלוונטיות לשאלה, שכן לוקח זמן רב יותר לפלואורופורים להתבטא באקסונים, שיכולים להיות באורך של כמה מילימטרים.</li>
	<li>אמתו את הספציפיות והחדירה של ביטוי פלואורופור (הן של ביטוי נגיפי והן של חיות TG) לפני כן (איור 1A). לפני שתמשיכו בהליך CLARITY, ייעדו לפחות מוח אחד לפרוסות דקות וודאו שהביטוי הפלואורופור הוא גם חזק וגם ספציפי לתכונת תא המטרה.</li>
</ol>2. בהירות
הערה: שיטה זו הופכת את המוח לשקוף תוך 2-6 שבועות.
<ol><li>בצעו זלוף טרנס-גולגולתי על בעלי חיים באמצעות מי מלח קרים עם תפרחת פוספט (PBS) ואחריה 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS. הסר את המוח ושמור אותו ב- PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור 50 מ"ל או במיכל דומה. הערה: לפני ביצוע זלוף טרנס-גולגולתי, החיה חייבת להיות מורדמת עמוקות. בדוגמאות שהוצגו בפרוטוקול זה, כל בעלי החיים הורדו באמצעות קטמין וקסילאזין (90% ו -10%, בהתאמה).</li>
	<li>החלף את ה-PFA בתמיסת הידרוג'ל (HS; ראה טבלה 1) למשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הערה: אין לאפשר לחומרים להתחמם יותר מטמפרטורת הקירור (4-8 מעלות צלזיוס) בשלב זה, אחרת ההידרוג'ל יתפלמר. HS המשמש בפרוטוקול זה מכיל 2% אקרילאמיד, בניגוד לפרוטוקולים קודמים המציעים 4%22 או 1%17. היתרון של 2% מפורט בסעיף הדיון. בעת הכנת HS, לעבוד על משטח קר כקרח. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>דגה הערה: מטרת שלב זה היא להסיר את כל החמצן החופשי מהרקמה מכיוון ש- O2 מפריע לתהליך הפילמור. ניתן להשתמש בכל גז שאינוO2 (למשל, N2, CO2); N2 מומלץ.<ol>
<li>העבר את ה-N2 מהמיכל באמצעות צינור גמיש בקוטר 5 מ"מ (פנימי), המחובר למחט של 19 גרם בקצהו (איור 1B).</li>
		<li>צרו שני חורים קטנים (ברוחב המחט) בפקק של הצינור: האחד כדי להכניס את הגז והשני כדי לאפשר לאוויר לצאת מהצינור (איור 1C).</li>
		<li>חברו את הצינור מגז N2 לצינור והחליפו את הגזים למשך כ-30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הסירו את הצינור ואטמו מיד את החורים בחימר מידול על כל צינור (איור 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים את הצינורות האטומים הפגועים לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3.5 שעות כדי לפלמל את ה-HS, שיהפוך לג'ל. היזהרו לא לנער את הצינורות (איור 1E).</li>
	<li>הוציאו את המוח מהצינור והסירו בעדינות את הג'ל הפולימרי מסביבו באמצעות מגבוני מעבדה. וודאו שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של הרקמה, שכן היא עלולה להגיב עם התמיסה בשלבים הבאים, ולעכב את תהליך ניקוי הרקמה (איור 1F). הערה: מכיוון שהג'ל הכיל PFA, המיצוי צריך להיעשות מתחת למכסה אדים.</li>
	<li>פרוסים את המוח אם השאלה העומדת על הפרק דורשת רק חלק ממנו. מחלקים אותו לחצי או לפרוסות עבות מאוד שמכילות את כל תחומי העניין (איור 1G).</li>
	<li>מניחים את הפרוסות בפתרון הניקוי הראשון (CS1, ראו טבלה 2) במיכל חדש ומנערים ב-70 סל"ד למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בצע את השלבים המתוארים להלן כדי להעביר את המוח מ- CS1 לפתרון הסליקה השני (CS2, ראה טבלה 2).<ol>
<li>הכינו מראש צינור מחורר למוח (איור 1H).</li>
		<li>מחממים מראש את CS2 ל-40-45 מעלות צלזיוס בכוס גדולה מספיק כדי להכיל את הצינור. עשו זאת על פלטה חמה עם מערבל. ודא שהטמפרטורה אינה מגיעה ל -55 מעלות צלזיוס כדי למנוע הלבנה של החלבונים המבוטאים.</li>
		<li>הניחו את הכוס המלאה ב-CS2 ואת הצינור המחורר על מכשיר ערבוב (כוס 2 ליטר באיור 1I). קבעו קצב ערבוב מתון שיגרום לנוזל לזרום מבלי לעוות את הרקמה. הערה: תוך 2-6 שבועות, הרקמה תהפוך לשקופה (התהליך מתחיל בפריפריה ונע פנימה לכיוון מבני המוח המרכזיים). ההחלטה מתי הרקמה "ברורה מספיק" תלויה בשיקול דעת אישי. המוח צריך להיות שקוף מספיק להדמיה מתחת למיקרוסקופ ללא הפרעה (איור 1J לא מספיק ברור; איור 1K ברור מספיק). מעבר לנקודה שבה הרקמה ברורה מספיק עלול לגרום לאובדן קשיחות הרקמה.</li>
	</ol></li>
	<li>העברה מ-CS2 ל-PBST (0.5% טריטון X-100 ב-PBS, ראו טבלה 2) במיכל חדש ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות (70 סל"ד) למשך 24 שעות. הערה: ב-PBST, הרקמה תהפוך ללבנה (איור 1L). הבהירות תחזור (ותשתפר) כאשר תוטמע בפתרון התאמת מקדם השבירה (RIMS, ראה שלב 2.14).</li>
	<li>החלף את ה- PBST ב- PBST חדש. יש לשמור באותם תנאים (37 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות) במשך 24 שעות נוספות.</li>
	<li>החלף שוב את PBST ב- PBST חדש ושמור על RT למשך 24 שעות.</li>
	<li>העבר ל- PBS ב- RT למשך 24 שעות.</li>
	<li>החלף את ה- PBS והשאר ב- RT למשך 24 שעות נוספות.</li>
	<li>הסר את המוח מ- PBS והעביר אותו ל- RIMS ב- 37 °C ב- 37 °C במשך הלילה. הערה: בתחילה, אדוות ב- RIMS עשויות להקיף את המוח. פרוטוקול זה תוכנן ואומת באמצעות שני RIMS מסחריים ספציפיים (ראה טבלה 3). עם זאת, הפרוטוקול לא צריך להיות שונה בעת שימוש ב- RIMS אחרים (מסחריים או מתוצרת עצמית).</li>
	<li>שמור את הרקמה ב-RT למשך 24 שעות נוספות או עד שהתמיסה תגיע לשיווי משקל מלא, כלומר כאשר הרקמה הופכת שקופה, והתמיסה אינה מכילה עוד אדוות נראות לעין (איור 1M).</li>
	<li>אם הרקמה שקופה, המשך להכנת התא. אם בשלב זה, הרקמה הופכת לבנה במקום שקופה (עקב אגרגטים של מולקולות SDS שיוריות), נקו את הדגימה שוב על ידי חזרה על שלבים 2.9 ו-2.10, והעבירו את הרקמה ל-CS2 (שלב 2.8) למשך מספר ימים, ולאחר מכן את כל השלבים עד שלב 2.15.</li>
</ol>3. הכנה קאמרית
הערה: כל דגימה דורשת שקופית עם תא הדמיה שבו תוצב הדגימה.
<ol><li>מקם את הדגימה באמצע השקופית.</li>
	<li>באמצעות אקדח דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר רווח קטן (כ-5 מ"מ) באחת הפינות (איור 2A,B).</li>
	<li>יש למרוח 1-2 טיפות של ה-RIMS על הדגימה כדי לשמור על המשטח העליון לח ולמנוע היווצרות בועות בין הכיסוי לרקמה.</li>
	<li>מיד לאחר מריחת טיפות ה-RIMS, הוסיפו את השכבה האחרונה של הדבק החם לדפנות (כך שיגיעו לגובה המוח/פרוסה) והתקדמו מיד (בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי) לשלב 3.5.</li>
	<li>אטמו את החלק העליון בכיסוי, והניחו אותו באופן שווה ככל האפשר בחלק העליון של שכבת הדבק החם שעדיין חמה (איור 2C).</li>
	<li>מלאו את התא ב-RIMS דרך הרווח שנותר בדפנות הדבק החמות (איור 2D,E).</li>
	<li>סגרו את הפער בדבק חם. אל תשאירו אוויר בפנים (איור 2F).</li>
	<li>אם דפנות הדבק החמות חורגות מגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים (איור 2G).</li>
	<li>אם המטרה המשמשת להדמיה שקועה, הוסיפו עוד 2-3 מ"מ של דבק לקירות שמעל הכיסוי, כך שפתרון הטבילה יחזיק מעמד תקופה ארוכה יותר (איור 2H).</li>
</ol>4. הדמיה (קונפוקלית או דו-פוטונית)
<ol><li>בדוק אם הבמה יכולה להחזיק את התא, שכן עובי התא יכול להגיע למספר מילימטרים. הערה: לדוגמה, המיקרוסקופ הקונפוקלי (ראה טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה מצויד במספר שלבים (למשל, עגול, מלבני). כל שלב שייבחר להחזיק את התא אינו רלוונטי כל עוד הפרמטרים שלו מתאימים לגדלים של התא.</li>
	<li>עבודה עם מטרה עם מרחק עבודה מספיק, כלומר, מרחק עבודה מינימלי ≥3 מ"מ, מכיוון שאזור העניין במוח עשוי להיות בעומק של כמה מילימטרים, וייתכן שהכיסוי אינו ישר לחלוטין כפי שהוא הונח באופן ידני. הערה: כהדגמה, התוצאות שהוצגו באיור 1, וידאו 1 ווידאו 2 התקבלו תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים באמצעות מטרת טבילת מים 16x עם מרחק עבודה של 3 מ"מ והגדלה של 2.4 כדי להשיג שדה ראייה של 652 x 483 מיקרומטר וערימה z עם מרווחי 0.937 מיקרומטר בין המישורים.</li>
	<li>בצע הדמיה מרובת אזורים, שעשויה להימשך מספר שעות ואף ימים. ודא שיש מספיק אחסון פנוי במחשב מכיוון שגודלה של כל תמונה יכול להגיע לעשרות ג'יגה-ביטים עד עשרות ג'יגה-ביט. הערה: הדמיית CLARITY עשויה לגרום לעומק משמעותי יותר של קטעי תמונה. לכן, העוצמות המשמשות ללכידת הביטוי צריכות להיות נמוכות יחסית כדי למנוע ביטוי יתר במהלך סיכום התמונה.</li>
	<li>למטרות טבילה, בדקו את הנוזל באופן שגרתי בזמן ההדמיה והוסיפו תוסף עם נוזל נוסף במידת הצורך. הערה: במהלך ההדמיה של הנתונים שהוצגו בסרטון 3, נוספו מים לפני השטח של התא כל 6-8 שעות כדי להילחם בהתאדות.</li>
	<li>לאחר רכישת התמונה, הצג ונתח אותה באמצעות מספר חבילות תוכנה שונות. הערה: התוכנה המומלצת כוללת את Imaris ו- SyGlass הן להדמיה והן לניתוח. הצינור המדויק לשחזור אופטימלי של אסטרוציטים באמצעות תוכנת אימריס תואר בעבר9. בקיצור, תכונות האימאריס ששימשו במחקר זה היו פילמנטים לשחזור מלא של מבני תאים ונקודות כדי לחלץ את המיקום בחלל של כל הסומטה.</li>
</ol>

<ol><li>Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+astrocytes+process+and+control+synaptic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information.</a> Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).</li>
<li>Ciappelloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+surface+trafficking+regulates+astrocytic+process+motility+and+synaptic+activity+in+health+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease.</a> Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).</li>
<li>Sylvain, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+trifluoperazine+on+brain+edema%2C+aquaporin-4+expression+and+metabolic+markers+during+the+acute+phase+of+stroke+using+photothrombotic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).</li>
<li>Kitchen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aquaporin-4+subcellular+localization+to+treat+central+nervous+system+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema.</a> Cell. 181 (4), 784-799 (2020).</li>
<li>Adamsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+activation+generates+de+novo+neuronal+potentiation+and+memory+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement.</a> Cell. 174 (1), 59-71 (2018).</li>
<li>Adamsky, A., Goshen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+in+memory+function%3A+pioneering+findings+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions.</a> Neuroscience. 370, 14-26 (2018).</li>
<li>Nagai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviorally+consequential+astrocytic+regulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits.</a> Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>Refaeli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+hippocampal+astrocytic+domains+and+their+spatial+relation+to+excitatory+and+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons.</a> Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).</li>
<li>Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+morphology+is+confined+by+cortical+functional+boundaries+in+mammals+ranging+from+mice+to+human%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human.</a> eLife. 5, 15915(2016).</li>
<li>Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+astrocyte+morphology+and+the+establishment+of+astrocyte+domains+during+postnatal+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+relationship+between+astrocyte+morphology+and+laminar+boundaries+in+the+molecular+layer+of+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus.</a> Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Chai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit-specialized+astrocytes%3A+transcriptomic%2C+proteomic%2C+morphological%2C+and+functional+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence.</a> Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>DeNardo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+cortical+ensembles+promoting+remote+memory+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+and+molecular+features+of+prefrontal+ensembles+representing+distinct+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences.</a> Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

שיטות לניקוי רקמות מהוות כלי מהפכני בחקר המוח, ומזמינות שאלות שלא ניתן היה לשאול קודם לכן. מהתמקדות בתכונות של קבוצה קטנה של תאים, תא בודד או אפילו סינפסה בודדת, CLARITY מאפשרת כעת מיקוד של אוכלוסיות תאים כוללות או תכונות קישוריות ארוכות טווח באמצעות פלואורופורים רלוונטיים.
התוצאה של ביטוי הפלואורופור ושילוב הליך CLARITY אינה בינארית; גורמים רבים עלולים להפריע להליך ולהוביל לתוצאות לא אופטימליות. ראשית, יש לאמת מראש את ביטוי הפלואורופור. מכיוון שהליך CLARITY גורם לאובדן מידע מסוים, ביטוי מספיק...

בשנים האחרונות, הידע על תפקוד האסטרוציטים וכיצד הם מתקשרים עם מעגלים עצביים גדל באופן דרמטי. אסטרוציטים יכולים להשפיע על פלסטיות 1,2, לסייע בהתאוששות עצבית לאחר הלידה 3,4, ואפילו לגרום לפוטנציה עצבית דה נובו, כאשר מחקרים אחרונים מראים את החשיבות של אסטרוציטים ברכישה ותגמול של זיכרון, שנחשבו בעבר לתפקודים עצביים גרידא 5,6,7 . מאפיין שמעניין במיוחד בחקר האסטרוציטים הוא הסידור המרחבי של התאים, השומרים על ארגונים מרחביים ייחודיים בהיפוקמפוס ובמבני מוח אחרים 8,9,10. שלא כמו הדנדריטים העצביים המשתלבים בין סומטה של התאים, אסטרוציטים בהיפוקמפוס מאכלסים טריטוריות הניתנות להבחנה חזותית עם חפיפה קלה בין התהליכים שלהם, ויוצרים תחומים נפרדים 8,11,12,13. הראיות התומכות בהשתתפותם של אסטרוציטים במעגלים עצביים אינן תומכות בהיעדר תיאור אנטומי מפורט של אוכלוסיות כאלה ושל תאי העצב בתחומם14.
הליכי התמרה וקטורית נגיפית, יחד עם בעלי חיים מהונדסים (TG), זכו לפופולריות כמערכת כלים לחקר מבנים מוחיים, תפקודים ואינטראקציות בין תאים15,16. השימוש במקדמים שונים מאפשר מיקוד של תאים ספציפיים על פי תכונותיהם הגנטיות, רמות ההפעלה17,18 או יעדי ההקרנה שלהם. וירוסים שונים יכולים לבטא פלואורופורים בצבעים שונים באוכלוסיות שונות. ניתן לשלב נגיף עם ביטוי אנדוגני של פלואורופורים ב- TG, או שניתן להשתמש בחיות TG ללא צורך בנגיפים. טכניקות אלה נמצאות בשימוש נרחב לסימון עצבי, וכמה מעבדות החלו להשתמש בהן עם שינויים המתמחים בהתמקדות בסוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים 5,9,19.
טכניקת CLARITY, שתוארה לראשונה בשנת 2013 20,21, מאפשרת לחקור פרוסות מוח עבות על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף תוך השארת המבנים המיקרוסקופיים שלמים. על ידי שילוב שתי השיטות - התמרה וקטורית נגיפית וניקוי רקמות - האפשרות לבחון את האינטראקציות המרחביות בין אוכלוסיות שונות של סוגי תאים זמינה כעת. רוב מחקרי האינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירונים בוצעו על פרוסות מוח דקות, וכתוצאה מכך תמונות של אסטרוציטים לא שלמים בשל תחומיהם הגדולים, ובכך הגבילו באופן קיצוני את מספר התאים שנותחו. השימוש בטכניקת CLARITY מאפשר אפיון ברזולוציה של תא יחיד של אוכלוסיות תאים בכמויות גדולות בו-זמנית. הדמיה של אוכלוסיות תאים המתויגות באופן פלואורסצנטי במוחות צלולים אינה מספקת רזולוציה סינפטית, אלא מאפשרת אפיון יסודי של האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים למגוון סוגי תאים עצביים.
מסיבה זו, רתמנו את הטכניקות המתקדמות האלה כדי לחקור את התכונות של אסטרוציטים לאורך CA1 הגבי, תוך הדמיה של כל הלמינה (Stratum Radiatum, שכבת הפירמידה ו-Stratum Oriens). מדדנו עשרות אלפי אסטרוציטים (עם חדירה נגיפית של >96%5), ובכך ניתחנו את המידע של כל האוכלוסייה האסטרוציטית סביב CA1. בעזרת חדירה יעילה של הסמנים העצביים, נוכל לתעד את האינטראקציות בין כל האוכלוסייה של אסטרוציטים CA1 לבין ארבעת הסוגים של תאים עצביים-פרוואלבומין (PV), סומטוסטטין (SST), נוירונים מעכבי VIP ותאים פירמידליים מעוררים9.
מספר ניסויים בוצעו באמצעות שילוב של פלואורסצנציה מחיות TG וווקטורים נגיפיים בצבעים שונים (כולם תאים מעכבים), בעוד שאחרים (מעוררים) השתמשו בשני וקטורים ויראליים המבטאים פלואורופורים שונים תחת מקדמים שונים9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט, הכולל תיוג של התאים הרצויים במוח, מה שהופך את המוח לשקוף באמצעות הליך CLARITY שונה, כמו גם הדמיה וניתוח של מבנים מוחיים שלמים, באמצעות נהלים ותוכנות שונות.

<table><tbody><tr><td>AAV1-GFAP::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>וקטור ויראלי המשמש לאיתור אסטרוציטים</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>וקטור ויראלי המשמש לאיתור נוירונים</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::H2B-eGFP</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>וקטור ויראלי המשמש לאיתור גרעיני עצב</td></tr><tr><td>AAV5-CaMKII::TdTomato</td><td>ELSC Vector Core Facility (EVCF)</td><td></td><td>וקטור ויראלי המשמש לזיהוי נוירונים</td></tr><tr><td>אקרילאמיד (40%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%)</td><td>Bio-rad</td><td>#161-0142</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא</td><td>#B7901</td><td>משקל מולקולרי - 61.83 גרם/מול</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי, סריקה, FV1000</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>4x אובייקטיבי (UPlanSApo, 0.16 NA)</td></tr><tr><td>תוכנת</td> <td>אימאריסBitplane, בריטניה</td><td></td><td>תוכנה המאפשרת ניתוח תלת מימד של תמונות</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S5881</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>EMS</td><td>#15710</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin lab</td><td>#RC147002</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear CS</td><td>SunJin lab</td><td>#RCCS002</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>#L3771</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> SyGlass <td>תוכנה המאפשרת ניתוח תלת מימד של תמונות באמצעות מציאות מדומה</td></tr><tr><td>Tris base 1 M</td><td>Bio-rad</td><td>#002009239100</td><td>משקל מולקולרי - 121.14 גרם/מול</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ChemCruz</td><td>#sc-29112A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שני פוטונים</td><td>Neurolabware</td><td></td><td>Ti:לייזר ספיר (Chameleon Discovery TPC, קוהרנטי), צינורות מכפיל צילום GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), מסנן פס פס (Semrock), טבילה במים 16x אובייקט (Nikon, 0.8 NA)&nbsp;</td></tr><tr><td>VA-044 יוזם</td><td>Wako</td><td>#011-19365</td><td></td></tr></tbody></table>

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית ופינוי רקמות בשיטת CLARITY מאפשר לחקור בו-זמנית מספר סוגים של תאי מוח ואת האינטראקציות ביניהם. התמרה וקטורית נגיפית מאפשרת סימון של סוגי תאים מגוונים בצבעים פלואורסצנטיים שונים בתוך אותה רקמה. ניתן לזהות תאים מבחינה גנטית על ידי פעילות או הקרנה. באמצעות פרוטוקול CLARITY שונה, גודל המדגם הפוטנציאלי של אסטרוציטים ותאי עצב גדל ב-2-3 סדרי גודל. השימוש ב- CLARITY מאפשר הדמיה של אסטרוציטים שלמים, שהם גדולים מכדי להתאים לשלמותם בפרוסות, ובדיקת הסומטה עם כל התהליכים שלהם. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות לחקור את האינטראקציה המרחבית בין אסטרוציטים לסוגי תאים עצביים שונים, כלומר, מספר הנוירונים הפירמידליים בכל תחום אסטרוציטי או הקרבה בין אסטרוציטים לאוכלוסיות נוירונים מעכבות ספציפיות. מאמר זה מתאר, בפירוט, כיצד יש ליישם שיטות אלה.

ניקוי מוצלח של פרוסות רקמת מוח עבות מביא למגוון חדש של שאלות שניתן לשאול לגבי התכונות של אוכלוסיות תאים גדולות, בניגוד לתכונות של תאים בודדים או קבוצות תאים שכנות. כדי להשיג תוצאות מוצלחות, יש להקפיד על פרוטוקול CLARITY, שכן יש מגוון רחב של פרמטרים שיש לקחת בחשבון כדי להפחית את השונות בין הדגימות (למשל, אחוז הבהירות, מידע פלואורסצנטי, פרמטרים של נפיחות).
איור 1 מתאר את כל תהליך הסליקה מאימות ביטוי חלבונים פלואורסצנטי דרך כל שלבי שיטת הסליקה. א...

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

טכניקת הבהירות שתוארה לראשונה בשנת 2013 היא טכניקת ניקוי רקמות המאפשרת דגימות של כמויות גדולות יותר של תאים, כלי דם, כך שאפילו חלבונים כאלה ברזולוציה של תא בודד בפרוסות מוח עבות. טכניקה זו מאפשרת לחקור מבנים מיקרוסקופיים שלמים על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף. פרוטוקול זה הוא שבב פשוט וצינור פשוט עבור רקמות ברורות.טכניקה זו יכולה לשמש לפינוי רקמות במערכות אחרות בנוסף לרקמות המוח. כדי להתחיל, אטמו את הצינור ואת המכסה באמצעות פרפילם ונקבו שני חורים בכובע. לאחר מכן להעביר גז חנקן מהמיכל באמצעות צינור גמיש עם קוטר פנימי של חמישה מילימטרים ומחט של 19 מד המחוברת בקצהו.התחילו לגזע על ידי חיבור הצינור לצינור ואפשרו חילופי גזים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נתקו את הצינור ומיד אטמו את החורים בחימר דוגמנות. לאחר מכן מעבירים את הצינורות האטומים של דגה לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 1/2 שעות כדי לפלמל את תמיסת ההידרוג'ל.הוציאו את המוח מהצינור. באמצעות מגבוני מעבדה, הסר את ההידרוג'ל הפולימרי סביב המוח כדי להבטיח שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של המוח. חלקו את המוח לפרוסות עבות המכילות את כל תחומי העניין.מכניסים את הפרוסות לתמיסת הניקוי הראשונה ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. בינתיים, הכינו צינור מחורר כדי למקם את המוח. שים את הצינור המחורר בכוס מלאה בתמיסת ניקוי שנייה במכשיר ערבוב.לאחר מכן הניחו את המוח בכוס ואטמו אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה. לאחר שהרקמה הופכת שקופה, העבירו את המוח ל-PBST באינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. החליפו את התמיסה ב-PBST טרי והמשיכו את הדגירה עוד 24 שעות.לאחר מכן העבירו את המוח ל-PBS בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר את המוח מ- PBS והעבר אותו לתמיסת התאמת מקדם שבירה. הדגירה של המוח ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.ראשית, מקם את הדגימה באמצע השקופית. באמצעות דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות.כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח אחת עד שתי טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות. בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלקה העליונה בהחלקת כיסוי, הניחו אותו באופן שווה ככל האפשר ואז מלאו את התא בתמיסת ההתאמה של מקדם השבירה. סגרו את הפער בדבק חם.אם דפנות הדבק החם משתרעות מעבר לגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים. אם מטרת טבילת שמן משמשת להדמיה, הוסיפו עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל החלקת הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תפונה.פרוסות מוח ברורות הוכנו באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין אוכלוסיות של אסטרוציטים ותאי עצב באזור CA1 של היפוקמפוס עכבר. כל האסטרוציטים ביטאו tdTomato ותאי עצב מעוררים ביטאו H2B-GFP בגרעינים שלהם. התא שהוכן עבור הרקמה המובהקת היה אופטימלי להדמיה תחת שני פוטון או מיקרוסקופ קונפוקלי.באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, נצפו יותר מ-300 אסטרוציטים בקטע מנוקה של אזור CA1 של היפוקמפוס העכבר. האסטרוציטים ההיפוקמפוסים בתאים אדומים ופירמידאליים, סומטה בירוק היו גלויים ועבים, רקמה שקופה המייצגת את הקרבה המרחבית בין שני סוגי התאים הללו. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר סורק, צרורות אקסונאליים מתאי עצב מעוררים אותרו על פני חצי כדור שלם.צרורות ירוקים אותרו מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופות הסופר-מימיות. הצרורים האדומים אותרו מגופי המאמילרים לעבר מקורם בהיפוקמפוס האוורור. גורמים, כגון טמפרטורה, ריכוזים וזמן דגירה השפיעו על תוצאות הליך הבהירות.לכן, הדיוק בכל שלב של הפרוטוקול חיוני להצלחת השגת רקמה ברורה. באמצעות טכניקה זו, אנו מודדים את המרחקים בין נוירונים לאסטרוציטים בכמה מבני מוח. פרוטוקול זה איפשר ניתוח של שניים עד שלושה סדרי גודל של יותר תאים מאשר במחקרים קודמים.

investigation-spatial-interaction-between-astrocytes-neurons-cleared

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס תרבית משותפת עקיפה של נוירון-אסטרוציטים באמצעות גישה ממודרת. במערך זה, נוירונים ואסטרוציטים מופרדים מרחבית אך חולקים תווך מותנה. גורמים נוירוטרופיים המשוחררים על ידי אסטרוציטים מקדמים התמיינות נוירונים ויצירת קשרים סינפטיים, דבר המצביע על אינטראקציות נוירון-גליה.

טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

מקור: }Refaeli, R., et al.}, חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים ונוירונים במוח נקי. J. Vis. exp. (2022)} }הסרטון מדגים את ההכנה של תא והדמיה מוחית של רקמת היפוקמפוס של עכבר מנוקה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני כדי להמחיש את האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים המסומנים פלואורסצנטית ונוירונים מעוררים.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים ברקמת היפוקמפוס של עכבר מנוקה

אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

קו הצינור המתואר מיועד לפילוח של נתונים מיקרוסקופ אלקטרונים הגדולים יותר מאשר ג'יגה-בתים, כדי לחלץ מורפולוגיות תא שלם. לאחר התאים משוחזרים ב-3D, תוכנה מותאמת אישית שתוכננה סביב צרכים בודדים ניתן להשתמש כדי לבצע ניתוח איכותי כמותי ישירות ב-3D, גם באמצעות מציאות וירטואלית כדי להתגבר על החסימה השקפה.

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

חקור את שיטת CLARITY לניקוי רקמות מוח בעכברים לחשיפת אינטראקציות מרחביות בין אסטרוציטים לנוירונים בהיפוקמפוס. טכניקה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציית תא בודד לחקירת ארגון תאי מוחי.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

גלה סרטונים נוספים