חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים
31 במרץ 2022
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.
טכניקת הבהירות שתוארה לראשונה בשנת 2013 היא טכניקת ניקוי רקמות המאפשרת דגימות של כמויות גדולות יותר של תאים, כלי דם, כך שאפילו חלבונים כאלה ברזולוציה של תא בודד בפרוסות מוח עבות. טכניקה זו מאפשרת לחקור מבנים מיקרוסקופיים שלמים על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף. פרוטוקול זה הוא שבב פשוט וצינור פשוט עבור רקמות ברורות.
טכניקה זו יכולה לשמש לפינוי רקמות במערכות אחרות בנוסף לרקמות המוח. כדי להתחיל, אטמו את הצינור ואת המכסה באמצעות פרפילם ונקבו שני חורים בכובע. לאחר מכן להעביר גז חנקן מהמיכל באמצעות צינור גמיש עם קוטר פנימי של חמישה מילימטרים ומחט של 19 מד המחוברת בקצהו.
התחילו לגזע על ידי חיבור הצינור לצינור ואפשרו חילופי גזים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נתקו את הצינור ומיד אטמו את החורים בחימר דוגמנות. לאחר מכן מעבירים את הצינורות האטומים של דגה לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 1/2 שעות כדי לפלמל את תמיסת ההידרוג'ל.
הוציאו את המוח מהצינור. באמצעות מגבוני מעבדה, הסר את ההידרוג'ל הפולימרי סביב המוח כדי להבטיח שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של המוח. חלקו את המוח לפרוסות עבות המכילות את כל תחומי העניין.
מכניסים את הפרוסות לתמיסת הניקוי הראשונה ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. בינתיים, הכינו צינור מחורר כדי למקם את המוח. שים את הצינור המחורר בכוס מלאה בתמיסת ניקוי שנייה במכשיר ערבוב.
לאחר מכן הניחו את המוח בכוס ואטמו אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה. לאחר שהרקמה הופכת שקופה, העבירו את המוח ל-PBST באינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. החליפו את התמיסה ב-PBST טרי והמשיכו את הדגירה עוד 24 שעות.
לאחר מכן העבירו את המוח ל-PBS בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר את המוח מ- PBS והעבר אותו לתמיסת התאמת מקדם שבירה. הדגירה של המוח ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
ראשית, מקם את הדגימה באמצע השקופית. באמצעות דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות.
כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח אחת עד שתי טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות. בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלקה העליונה בהחלקת כיסוי, הניחו אותו באופן שווה ככל האפשר ואז מלאו את התא בתמיסת ההתאמה של מקדם השבירה. סגרו את הפער בדבק חם.
אם דפנות הדבק החם משתרעות מעבר לגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים. אם מטרת טבילת שמן משמשת להדמיה, הוסיפו עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל החלקת הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תפונה.
פרוסות מוח ברורות הוכנו באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין אוכלוסיות של אסטרוציטים ותאי עצב באזור CA1 של היפוקמפוס עכבר. כל האסטרוציטים ביטאו tdTomato ותאי עצב מעוררים ביטאו H2B-GFP בגרעינים שלהם. התא שהוכן עבור הרקמה המובהקת היה אופטימלי להדמיה תחת שני פוטון או מיקרוסקופ קונפוקלי.
באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, נצפו יותר מ-300 אסטרוציטים בקטע מנוקה של אזור CA1 של היפוקמפוס העכבר. האסטרוציטים ההיפוקמפוסים בתאים אדומים ופירמידאליים, סומטה בירוק היו גלויים ועבים, רקמה שקופה המייצגת את הקרבה המרחבית בין שני סוגי התאים הללו. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר סורק, צרורות אקסונאליים מתאי עצב מעוררים אותרו על פני חצי כדור שלם.
צרורות ירוקים אותרו מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופות הסופר-מימיות. הצרורים האדומים אותרו מגופי המאמילרים לעבר מקורם בהיפוקמפוס האוורור. גורמים, כגון טמפרטורה, ריכוזים וזמן דגירה השפיעו על תוצאות הליך הבהירות.
לכן, הדיוק בכל שלב של הפרוטוקול חיוני להצלחת השגת רקמה ברורה. באמצעות טכניקה זו, אנו מודדים את המרחקים בין נוירונים לאסטרוציטים בכמה מבני מוח. פרוטוקול זה איפשר ניתוח של שניים עד שלושה סדרי גודל של יותר תאים מאשר במחקרים קודמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש בשיטת CLARITY בשילוב עם טרנסדוקציה של וקטורים ויראליים כדי לבחון את מערכות היחסים המרחביות בין נוירונים לאסטרוציטים בהיפוקמפוס של עכבר. באמצעות הפיכת הרקמה לשקופה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור מספר רב יותר של תאים, ובכך לחשוף תובנות לגבי הארגון והאינטראקציות התאיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות להשקיפות רקמות
- דימוי תאי
רקע
- טכניקת ה-CLARITY מאפשרת ויזואליזציה של רקמת מוח ברמה התאית.
- היא מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות גדולות של נוירונים ואסטרוציטים ברקמות שלמות.
- שיטה זו משפרת את השקיפות של פרוסות מוח עבות בהשוואה לשיטות דימות מסורתיות.
- המחקר מדגיש את תפקידה של שקיפות הרקמה בהבנת הארכיטקטורה הנוירונלית.
מטרת המחקר
- לבחון את הקשרים המבניים בין אסטרוציטים לנוירונים בהיפוקמפוס של עכבר.
- למדוד מרחקים בין סוגי תאים שונים במבני מוח מגוונים.
- להדגים את יעילותה של שיטת CLARITY לדימוי תאי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- במחקר נעשה שימוש בטכניקת CLARITY להבהרה של רקמות בחתכי מוח.
- רקמה מהיפוקמפוס של עכבר שימשה להדמיה של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים.
- לא הוזכרו תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- שלבי המפתח כללו ניקוי גזים, פולימריזציה של הידרוג'ל ודגירה בתמיסורי הבהרה.
- הרקמה הודמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופיית דו-פוטון.
תוצאות עיקריות
- מעל 300 אסטרוציטים הודגמו בחתכים של היפוקמפוס שעברו הבהרה.
- ההקשר המרחבי של האסטרוציטים והנוירונים העשירים (excitatory neurons) נקבע, ובכך הודגש הקרבה ביניהם.
- נצפו צרורים אקסוניים משמעותיים בין אוכלוסיות נוירונים ברקמות שהובהרו.
- גורמים שונים השפיעו על מידת השקיפות של הרקמות, דבר המדגיש את הצורך במתודולוגיה מדויקת.
מסקנות
- מחקר זה מדגים כי שיטת ה-CLARITY יכולה לשפר באופן משמעותי את הוויזואליזציה של קשרים תאיים במוח.
- הממצאים מאפשרים הבנה טובה יותר של הארגון המרחבי של נוירונים ותאי גליה.
- לתובנות שהתקבלו משיטה זו עשויות להיות השלכות על מחקר של מנגנונים נוירונליים ומודלים פוטנציאליים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות מרחביות בין אסטרוציטים לנוירונים ברקמת מוח שלמה נותן מענה לפער קריטי בתיקוף יעדים מוקדם במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובצמצום סיכונים מכניסטיים. שילוב של סימון באמצעות וקטורים ויראליים עם הבהרה של רקמות בשיטת CLARITY מאפשר ניתוח כמותי ורחב-היקף של דומיינים תאיים, התומך בביטחון חיזוי בגילויים נוירוביולוגיים. יכולת זו משפרת את תהליך מיון הפורטפוליו על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים להרחבה על אינטראקציות בין סוגי תאים הרלוונטיות למודלי מחלות ותיעדוף יעדים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של יחסי המרחב בין אסטרוציטים לנוירונים באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת גבולות הדומיין התאי ומדדי קרבה.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות סימון ודימות של סוגי תאים המוגדרים גנטית.
- מספק נתונים בעלי תוכן גבוה לביטחון חיזוי בבחירת מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות רקמת מוח שלמות ומאומתות עבור בדיקות מבוססות דימוג בהמשך התהליך.
- מנstandardיז את הכנת הדגימה למדידות מרחביות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר דימוג בר-הרחבה של מאות עד אלפי תאים לדגימה עבור סריקה רחבה (screening).
- תומך בפיתוח בדיקות להערכת תרכובות המכוונות לאינטראקציות בין נוירונים לגליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי המיפוי המרחבי למודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הרלוונטיים למחלה, לצורך רציפות תרגומית.
- מאפשרת התקדמות מותאמת סיכונים על ידי אספקת מדדים כמותיים לאינטראקציות בין סוגי תאים.
- תומכת בגילוי סמנים ביולוגיים באמצעות מיפוי ברזולוציה גבוהה של דומיינים תאיים.
- מסייעת להמשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני בפורטפוליו של נוירוביולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח מרחבי עתיר תוכן של אוכלוסיות תאי מוח המוגדרות גנטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים ומבהירה נתיבים מכניסטיים ברקמות של ה-CNS.
- סריקה: מספקת קריאות מרחביות כמותיות הניתנות לשחזור עבור מוכנות של בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדדי קרבה תאית ותפוסת דומיין לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני מיפוי מרחבי למודלים של מחלות ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים כאשר המערכת תומכת בכך.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת זרימת עבודה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור הבהרה והדמיה של רקמות CNS במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הבהרת רקמות והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטאות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור הפקה של נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים נוירוביולוגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהחדרה (transduction) של וקטורים ויראליים, ביריקה של רקמות (tissue clearing) ובמיקרוסקופיה מתקדמת.
- נדרשת גישה לפלטפורמות דימוי דו-פוטוני או קונפוקלי ולתשתית אנליטית.
- נחייב סטנדרטיזציה קפדנית של הפרוטוקול כדי להבטיח הדירות בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש לבצע התאמות עבור אזורי מוח שונים או מערכות מודל שונות.
- דיוק בפרוטוקול הוא קריטי; הטמפרטורה, ריכוזי הרכיבים והתזמון משפיעים ישירות על איכות הנתונים.
