Name: אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: למדו איך לייצר דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות Salmonella Typhimurium. מודל זה מאפשר חקירת תגובות דלקתיות ומחקר מנגנוני ספסיס לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למתקן המרכזי לבעלי חיים, IISc על שסיפק לנו עכברים למחקר. מחקר זה מומן על ידי מענקים ל- DpN מהמחלקה לביוטכנולוגיה ומועצת מחקר מדע והנדסה, ממשלת הודו. התמיכה התשתיתית מתוכנית DBT-IISc ומענקי DST-FIST זוכה להכרה רבה. אנו מודים לכל החברים הקודמים והנוכחיים במעבדת DpN על תמיכתם.

כל הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום נערכו במתקני ביו בטיחות ברמה 2 (BSL-2). יש להקפיד על שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE), להבטיח בטיחות ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים, IISc. עכברים גודלו והוחזקו במתקן המרכזי לבעלי חיים של IISc (מספר רישום: 48/1999/CPCSEA, מיום 1/3/1999), שאושר על ידי המשרד לאיכות הסביבה והיער, ממשלת הודו. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה למטרה ובקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים עם מספר ההיתר המאושר CAF/Ethics/797/2020.
הגדרת BSL2: דירוג BSL2 מייצג כי הסוכנים הביו-האזרדיים מהווים איום מתון על הסביבה ועל צוות המעבדה5.
1. הכנת תרבות של סלמונלה טיפימוריום         
<ol><li>הוסף 100 μL של סלמונלה טיפימוריום NCTC 12023 מלאי גליצרול ל 3 מ"ל של מרק לוריא ברטאני (LB). הדגירו את התרבות ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>פזרו 50 μL מתרבית הלילה שגדלה בציר LB על צלחת אגר סלמונלה שיגלה (SS) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-12 שעות. אחסנו את צלחת האגר של SS עם מושבות החיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים לפני ניסוי הזיהום in vivo .</li>
	<li>בחרו מושבה בודדת מתוך צלחת האגר של האס-אס המפוספסת באמצעות מיקרוטיפ. פלטו את המיקרו-טייפ ל-3 מ"ל של מרק ותרבית LB ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס בלילה.</li>
	<li>הוסיפו 0.1 מ"ל מתרבית החיידקים ל-50 מ"ל של ציר LB ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר ב-160 סל"ד למשך 3-4 שעות כדי להגיע לשלב הלוגריתמי של הצמיחה. דיללו את התרבות בפקטור של 2 באמצעות ציר LB. הערה: במהלך השלב הלוגריתמי, תאי החיידקים נמצאים במצב בריאותי הטוב ביותר שלהם והם מתחלקים באופן פעיל.</li>
	<li>מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבית באורך גל של 600 ננומטר של אור בספקטרופוטומטר או בקורא מיקרו-לוחיות. ברגע שה-OD מגיע ל-1.0, הכינו שני אליקוטים של 1 מ"ל של תרבית בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור עם 1 מ"ל של 1x PBS 2x. צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות.</li>
	<li>בצעו החייאה של הכדור ב-0.5 מ"ל של 1x PBS בשני צינורות מיקרו-פוג' שונים של 1.5 מ"ל. שלב את המתלים משני הצינורות לצינור אחד של 1.5 מ"ל המכיל כעת כ-2 × 108 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/mL.</li>
	<li>הכינו תרחיף של תאי חיידקים של 1 × 106 CFU/mL על ידי דילול תמיסת מלאי זו. אזהרה: מטב את ה- CFU המתאים ל- OD בתנאי מעבדה ספציפיים כדי לקבוע את ה- CFU עבור OD 1.0 לפני תחילת הניסויים.</li>
</ol>2. עכברים וזיהומים
<ol><li>ביתו זכר בן 8-10 שבועות C57BL/6 עכברים במשקל של כ-20 גרם בחדר האוויר הנקי של מתקן החיות במשך מספר ימים לצורך התאקלמות.</li>
	<li>ביום ההדבקה, החזיקו את העכבר ביד אחת, נגבו את עור הבטן ב-70% אתנול ופרשו את הרגליים האחוריות לנגישות טובה יותר של דופן הבטן.</li>
	<li>הזריקו 0.5 מ"ל של 1 × 106 CFU/mL תרחיף חיידקי תוך-צפק בעזרת מזרק של 1 מ"ל. לכן, כל עכבר מקבל 5 × 105 CFU. שליטה, עכברים לא נגועים מקבלים 0.5 מ"ל של PBS בלבד. לאחר ההדבקה, צלחת את התרבית כדי לבדוק את ה- CFU בפועל מוזרק, אשר עשוי לנוע בין 0.2-0.8 מיליון CFU / 0.5 מ"ל.</li>
	<li>החזירו את העכברים לכלובים כפי שהוקצו.</li>
	<li>הקרב את העכברים באמצעות חנק CO2 ~ 12-18 שעות לאחר ההדבקה לקבלת התגובה הטובה ביותר. בדרך כלל, כל העכברים הנגועים מתים תוך 96 שעות. תחת כמה התערבויות ניסיוניות, חלק מהעכברים עשויים לשרוד. המתת עכברים אלה לאחר 96 שעות. כמו כן, המתת כל עכבר עם טמפרטורת גוף מתחת ל -33.2 מעלות צלזיוס ומצוקה חריפה בשעה 96 כנקודת קצה הומאנית. הערה: במודל זה, חלק מהעכברים עלולים להתחיל למות לאחר 12 שעות של הזרקת סלמונלה . לכן, תכננו ניסויים בצורה נכונה הכוללים מספר נקודות זמן.</li>
</ol>3. הערכת CFU של איברים
<ol><li>להקריב את העכבר הנגוע על ידי חנק CO2 , ולנגב את הבטן עם חתיכת כותנה טבולה ב 70% אתנול. חותכים את עור הבטן. עיין במאמר של ריי ודיטל לקבלת פרוטוקול וידאו כיצד לאסוף נוזל שטיפה פריטוניאלי6. חותכים לפתוח את חלל הצפק ולאסוף את האיברים המעניינים בצינורות מיקרופוגה. בנוסף, מכיוון שהדם בעכברים עם אלח דם נקרע במהירות והכמויות נמוכות, אספו אותו במהירות לאחר ההקרבה. הערה: סרטון זה מדגים את הספירה של CFU של איברים מהכבד כאשר הכבד עובר נזק היסטופתולוגי נרחב במודל זה של אלח דם.</li>
	<li>חותכים חתיכה קטנה מהכבד ומניחים אותה בצינור מיקרופוגה. הערה: ניתן לאחסן זאת על קרח למשך 2-3 שעות לכל היותר לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
	<li>שוקלים ומעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה. רצוי לחתוך חתיכות במשקל של כ-10-15 מ"ג להומוגניזציה נכונה. השתמש באיברים שלמים במקרה של קטנים יותר כגון בלוטות הלימפה המזנטריות (MLNs) או תימוס.</li>
	<li>הוסיפו 0.5 מ"ל של 1x PBS לצינור והומוגניזציה של האיברים באמצעות הומוגנייזר ידני. ודא כי האיברים הם הומוגניים לחלוטין. התאם את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1x PBS.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 200 × g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).</li>
	<li>אספו את ה-supernatant לצינורות מיקרו-פוג'ים טריים והכינו דילולים של 1 × 10−1 ו-10−2 בצלחת של 96 בארות.</li>
	<li>מורחים 50 μL של מדולל על צלחות אגר SS טריות ודגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.</li>
	<li>ספרו את מספר המושבות המופיעות בכל מצב ונרמלו את הנתונים עם משקל האיבר באמצעות משוואה (1): CFU/mg = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) הערה: המספר 20 משמש בנוסחה להמרת המושבות לכל לוח ל- CFU / mL. מספר זה מגיע על ידי חלוקת 1 מ"ל בסכום של נפח נתון של התרבית המצופה - במקרה זה, 50 μL. לדוגמה, אם 100 מושבות נמצאות בצלחת אגר SS, שבה מתפשט 50 μL של 1 × 10-1 דילול של איבר הומוגני במשקל 10 מ"ג, אז CFU/mg = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>4. ניתוח ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בהפרשה פריטוניאלית
<ol><li>אסוף את תאי הצפק כפי שתוארו קודם לכן על ידי ריי ודיטל6.</li>
	<li>יש להחיות את גלולת התאים מנוזל שטיפת הצפק ב-1 מ"ל של RPMI בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). ציין את מספרי התאים הכוללים בשטיפת הצפק באמצעות המוציטומטר. התאם את מספר התא כך שכל צינור יקבל 0.2-0.5 מיליון תאים. הערה: שטיפת פריטונאל בעכברים עם אלח דם עשויה להכיל RBCs, אשר כנראה מופיעים עקב דימום. הקפידו לא לכלול RBCs בעת ספירת תאי הצפק. במיקרוסקופ הבהיר, RBCs נראים קטנים בהרבה מתאי החיסון. אלה מופיעים כדיסקים שטוחים או סופגניות, עגולים, עם כניסה במרכז, אך לא חלולים. ניתן להוסיף שלב ל-LYSE RBCs7.</li>
	<li>סובבו את התאים כלפי מטה ב-200 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים פי 1 עם 1x PBS קר. צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.</li>
	<li>חסום את קולטני ה-Fc ב-PECs באמצעות חוסם FcR (דילול של 1:400), שהוכן במאגר חסימה המורכב מ-5% FBS ו-0.02% נתרן אזיד ב-PBS. דגירה על קרח במשך 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה התאים ב 200 × גרם ב 4 °C (64 °F) במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט. דיללו את הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום בעלי עניין בחסימת מאגר. השתמש בדילול של 1:500 של LY6G נגד עכברים כדי להכתים את הנויטרופילים. הערה: ניתן לזהות אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון גם באמצעות, לדוגמה, B220 נגד עכברים עבור תאי B, CD3 נגד עכבר עבור תאי T, ו- F4/80 נגד עכברים עבור מקרופאגים.</li>
	<li>הדגירה של כ-0.2 מיליון תאים ב-200 μL של התמיסות המדוללות של נוגדנים בצינורות נפרדים. כבקרה שלילית, הניחו בצד צינור אחד בכל סוג פלואורואורוכרום עבור הבקרה הלא מוכתמת כדי לדגום את התאים עם 200 μL של חיץ חוסם ללא נוגדנים.</li>
	<li>דגירו את הדגימות על הקרח במשך 45 דקות עם הקשה לסירוגין כל 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנאטנט. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך ~ 15 דקות בטמפרטורת החדר אם הם צריכים להיות מאוחסנים במשך מספר ימים. עם זאת, עדיף להשיג נתונים מדגימות מוכתמות טריות בציטומטר זרימה.</li>
	<li>בצעו החייאה של התאים ב-200 μL של מאגר צביעת FACS (2% FBS ב-PBS). רכוש את הנתונים בציטומטר זרימה.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מאמר זה מתאר שיטה של גרימת צורה חמורה של אלח דם חיידקי על ידי הזרקה תוך צפקית של סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי, ולכן, פתוגני מאוד, מחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאיות הדלקתיות והקטלניות8 ואת ההשפעות של התערבות טיפולית בהחלשת אלח דם.
במער...

אלח דם מוגדר כתגובה דלקתית מערכתית ומערכתית לא מווסתת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים המרוחקים ממקום ההדבקה או הנזק. הלם ספטי הוא תת-קבוצה של אלח דם המאופיינת בלחץ דם הנמשך במהלך החייאה נפחית, עם סיכון מוגבר באופן משמעותי לתמותה1. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו במהלך מגיפת COVID-19. למרות התמותה הגבוהה הקשורה אליו, נתונים אפידמיולוגיים מקיפים על הנטל העולמי של אלח דם חסרים בגלל המורכבות של האבחנה שלו. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מקרים של אלח דם ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים 19.7% מכלל מקרי המוות בעולם2. יתר על כן, מחקר על השכיחות המורחבת של זיהום ואלח דם קשור בחולי יחידות טיפול נמרץ מצא כי 62% מהבודדים החיוביים מהחולים היו אורגניזמים גראם שליליים3.
בתחילה, החקירות על אלח דם התמקדו בתיחום פתוגנזה מיקרוביאלית. עם זאת, הבנת "השערת הסכנה", המכתיבה כיצד המארח מבחין בין העצמי ללא-עצמי, הובילה להטיית מאזן חקר אלח הדם לעבר הבנת תגובת המארח לפתוגן פולש. המודלים הנפוצים של אלח דם בעכברים כוללים את מודל האנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), מודלים של אלח דם פולימיקרוביאלי, קשירת cecal ונקב (CLP) ומודלים של דלקת צפק מסוג stent scendens (CASP) של המעי הגס ומודלים של זיהום חד-בקטריאלי4.
תיקנו מערכת מודל עכבר על ידי גרימת אלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כי סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון יחידות יוצרות מושבה (CFU) של סלמונלה טיפימוריום לתוך עכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר על ידי הערכת נטל חיידקי איברים ~ 16 שעות לאחר ההדבקה. מאמר זה מדגים אלח דם של דלקת הצפק הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום בעכברים, מאפיין את השינויים הנובעים מכך בהרכב תאי הצפק, ומכמת את עומס החיידקים באיברים שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק סטרילי עם מחט 26 גרם</td><td>בקטון דיקינסון, סינגפור</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>טרסונס, ארה"ב</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי 10 מ"ל עם מחט 21 גרם</td><td>בקטון דיקינסון, ספרד</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל בקבוק חרוטי</td><td>טרסונס, ארה"ב</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה מדורג</td><td>, ארה"ב</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה בוגר</td><td>טרסונס, ארה"ב</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>מפזר תאים</td><td>VWR, ארה"ב</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ</td><td>מלח HiMedia, מומבאי, הודו</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>חוסם FcR</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC חולדה נגד עכבר Ly6G (שיבוט 1A8)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר מבוסס יד</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>המוציטומטר (תא ספירת נויבאואר)</td> <td>רוהם, הודו</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>HiMedia, מומבאי, הודו</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Tarsons, ארה"ב</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, מומבאי, הודו</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>סלמונלה-שיגלה אגר</td><td>HiMedia, מומבאי, הודו</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>ציטומטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זרימה</td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td> מכונת שקילה <td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של הזיהום או הנזק. נכון לעכשיו, המודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), קשירת צקל וניקוב (CLP) ומערכות מודל לזיהום חד-בקטריאלי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את תגובות המארח במהלך דלקת הצפק הספיגה הנגרמת על ידי זיהום סלמונלה טיפימוריום בעכברים. ב. טיפימוריום, פתוגן תוך-תאי גראם-שלילי, גורם למחלה דמוית טיפוס בעכברים.
פרוטוקול זה מפרט את הכנת התרבית, אינדוקציה של דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, ושיטות לחקר תגובות פונדקאיות סיסטמיות. יתר על כן, מוצגת הערכת נטל החיידקים באיברים שונים והניתוח הציטומטרי של הזרימה של מספרי נויטרופילים מוגברים בשטף הצפק. סלמונלה אלח דם הנגרם על ידי טיפימוריום בעכברים מוביל לעלייה בציטוקינים פרו-דלקתיים ולחדירה מהירה של נויטרופילים בחלל הצפק, מה שמוביל להישרדות נמוכה יותר.
כל שלב בפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה, וכתוצאה מכך שכפול גבוה של הפתוגנזה של דלקת הצפק הספיגה. מודל זה שימושי לחקר תגובות אימונולוגיות במהלך אלח דם חיידקי, את התפקידים של גנים שונים בהתקדמות המחלה, ואת ההשפעות של תרופות כדי להחליש אלח דם.

אפיון מפורט של התגובה החיסונית של המארח באמצעות מודל מסוים זה מוצג בפרסומים קודמים 8,9. כמה תוצאות מייצגות של הפרוטוקול המתואר מתוארות בסעיף זה. מודל זה נועד לגרום לזיהום מערכתי של S. טיפימוריום על ידי הזרקה תוך-צפקית של תרבית החיידקים כדי לגרום לאלח דם. כדי לאשר את הזיהום, התפשטו הליזטים של הכבד והטחול מעכברים ספיגה על צלחות אגר של SS, ומספר המושבות נספר. באיור 1, התמונות של לוחות אגר SS מצביעות על נטל ה-CFU של האיברים בכבד...

פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של זיהום או נזק. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו, במהלך מגיפת COVID-19. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מוות של אלח דם, ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים כמעט 20% מכלל מקרי המוות בעולם.כצפוי, רוב המקרים הם בבתי חולים. למעשה, מחקר מצא כי כמעט 62% מהבודדים החיוביים מחולים ביחידות טיפול נמרץ עם אלח דם, היו אורגניזמים גראם שליליים. ישנם מספר מודלים, וכמה מהמודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי LPS, מודל קשירת cecal ונקב, ומערכות מודל זיהום מונובקטריאלי.במעבדה שלנו, תיקנו מערכת מודל של עכבר, כדי לגרום לאלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים, כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם דלקת הצפק במודל זה, היא מערכתית עם 100% תמותה, בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה.לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות המארח הדלקתי. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון CFU של סלמונלה טיפימוריום, בעכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר, על ידי הערכת נטל חיידקי איברים, כ 16 שעות לאחר ההדבקה.הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום, דורשים מתקן BSL-2, ועמידה בהנחיות BSL-2. יש להקפיד על שימוש ב-PPE תקין, וכדי להבטיח בטיחות, ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים.הכנת תרבות של סלמונלה טיפימוריום. הוסף מאה מיקרוליטר של סלמונלה טיפימוריום NCTC 12023 מלאי גליצרול, לתוך 3 מ"ל של מרק LB. דגירו את התרבות ב-160 סיבובים לדקה, ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה.פזרו 50 מיקרוליטר מתרבית הלילה שגדלה בציר LB, על צלחת אגר סלמונלה שיגלה, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. בחרו מושבה בודדת מתוך צלחת ה-SS אגר המפוספסת, באמצעות מיקרוטיפ. פולטים את המיקרו-טייפ ל-3 מ"ל של ציר LB, ואת תרבית ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס בלילה.מוסיפים 0.1 מ"ל מתרבית החיידקים ל-50 מ"ל של ציר LB, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, באינקובטור שייקר ב-160 סל"ד, למשך שלוש עד ארבע שעות, כדי להגיע לשלב הלוגריתמי של הצמיחה. דיללו את התרבות בפקטור של שניים באמצעות ציר LB. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 ננומטר של אור בספקטרופוטומטר.ברגע שה-OD מגיע לאחד, הכינו שני אליקוטים של 1 מ"ל של תרבית, בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה הצינורות ב 7, 750 G במשך 15 דקות. השליכו את חומר העל הזה, ושטפו את הכדור עם 1 מ"ל של 1XPBS פעמיים.צנטריפוגה הצינורות ב 7, 750 G במשך 15 דקות. בצעו שימוש חוזר בכדור ב-0.5 מ"ל של 1XPBS, בשני צינורות מיקרו-פוג' שונים של 1.5 מ"ל. שלבו את המתלים משני הצינורות, לצינור אחד של 1.5 מ"ל, המכיל כעת, כשני כפול שניים כפול 10 מוגבהים להספק של שמונה יחידות יוצרות מושבה לכל מ"ל.הכינו תרחיף של תאי חיידקים בהספק של 10 הספק של שישה CFU/מ"ל, על ידי דילול תמיסת המלאי. הערה חשובה, מטב את ה- CFU המתאים ל- OD במעבדה שלך, כדי לקבוע את ה- CFU עבור OD אחד, לפני תחילת הניסויים. עכברים וזיהומים.ביום ההדבקה, החזיקו את העכבר ביד אחת, נגבו את עור הבטן ב-70% אתנול ופרשו את הרגליים האחוריות לנגישות טובה יותר של דופן הבטן. הזריקו 0.5 מ"ל מתוך 10 בעוצמה של שישה תרחיפים חיידקיים מסוג CFU/mL באופן תוך-צפקי, בעזרת מזרק של 1 מ"ל. לאחר ההדבקה, צלחו את התרבית כדי לבדוק את ה-CFU בפועל שהוזרק, שעשוי לנוע בין 0.2 ל-0.8 מיליון CFU לכל 0.5 מ"ל.הערכת CFU של איברים. העכבר הוקרב באמצעות חנק פחמן דו חמצני. לאחר הקרבת העכבר הנגוע, נגבו את הבטן בחתיכת כותנה, טבולה ב-70% אתנול.חותכים את עור הבטן. עיין במאמר של ריי ודיטל, לפרוטוקול וידאו, על איך לאסוף נוזל שטיפה פריטוניאלי. חותכים לפתוח את חלל הצפק ולאסוף את איבר העניין.בסרטון זה אנו מדגימים את הספירה של CFU איברים מהכבד. הכבד עובר נזק היסטופתולוגי נרחב, במודל זה של אלח דם. חותכים חתיכת כבד קטנה ומניחים אותה בצינור מיקרופוגה.זה יכול להיות מאוחסן בקרח במשך שעתיים עד שלוש שעות, לפני שממשיכים לשלב הבא. שקלו את החתיכה והעבירו אותה לצינור מיקרו-פוגה. רצוי, לחתוך את החלקים במשקל סביב 10 עד 15 מ"ג, עבור הומוגניזציה נכונה.הוסף 0.5 מ"ל של 1XPBS בצינור והומוגניזציה של האיברים באמצעות הומוגנייזר ידני. ודא כי האיברים הם הומוגניים לחלוטין. השלם את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל, על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1XPBS.צנטריפוגה של הצינורות ב-200 G במשך חמש דקות, בארבע מעלות צלזיוס. אספו את ה-supernatant לתוך צינורות מיקרו-פוג'ים טריים. הכינו דילולים של 10 להספק מינוס אחד, ו-10 להספק מינוס שתיים, בלוחית באר של 96.מורחים 50 מיקרוליטר של המדולל, על צלחות אגר אס-אס טריות, ומדגרים את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. ספרו את מספר המושבות המופיעות בכל מצב, ונרמלו את הנתונים עם משקל האיבר, באמצעות הנוסחה הבאה. CFU/mg שווה למספר המושבות, כפול 20, כפול גורם הדילול, כולו מחולק לפי משקל האיברים במ"ג.שים לב, המספר 20 משמש בנוסחה, כדי להמיר את המושבות לכל לוח ל- CFU / mL. מספר זה מגיע, על ידי חלוקת 1 מ"ל של כמות של נפח נתון של תרבות מצופה. במקרה זה, 50 מיקרוליטר.לדוגמה, אם אתה מוצא מאה מושבות בצלחת אגר SS, שבה 50 מיקרוליטר של 10 כוח מינוס דילול אחד של איבר הומוגני, במשקל 10 מ"ג מתפשט, אז CFU / mg יהיה שווה 100 כפול 20, כפול 10, כפול 10, את כל חלקי 10, אשר שווה 2000 CFU / mg. ניתוח ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיות שונות של תאי מערכת החיסון בהפרשת הצפק. אסוף את תאי הצפק כפי שתואר קודם לכן, על ידי ריי ודיטל.יש להחיות את גלולת התאים מנוזל שטיפת הצפק, ב-1 מ"ל של RPMI בתוספת 10% FBS. ספירת מספרי התאים הכוללים בשטיפת הצפק, באמצעות המוציטומטר. התאם את מספר התא באופן כזה, שכל צינור יקבל שניים עד חמישה כפול 10 המוגבהים לעוצמה של חמישה תאים.סובבו את התאים כלפי מטה ב-200 G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט. שטפו את התאים פעם אחת עם 1XPBS.צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם למשך 10 דקות. חסום את קולטני Fc באמצעות חוסם FcR. האחת היא ל-400 דילול, שהוכן במאגר חסימה, המורכב מ-5% FBS ו-0.02% נתרן אזיד ב-PBS.דגירה על קרח במשך 15 דקות. צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט.דילול הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום בעלי עניין בחסימת מאגר. כאן, אנו משתמשים באחד הוא 500 דילול של Ly6G נגד עכבר, כדי להכתים נויטרופילים. שימו לב, ניתן גם להראות אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון, באמצעות B220 נגד עכבר עבור תאי B, CD3 נגד עכבר עבור תאי T, F4/80 נגד עכבר עבור מקרופאגים וכו '.דגירה של כ-0.2 מיליון תאים ב-200 מיקרוליטרים של תמיסות מדוללות של נוגדנים, בצינורות נפרדים. כבקרה שלילית, הניחו בצד צינור אחד בכל סוג פלואורוכרום, לשליטה לא מוכתמת. בצינור זה, לדגום את התאים עם 200 microliter של מאגר חוסם ללא נוגדנים.הדגירו את הדגימות על קרח למשך 45 דקות, תוך הקשה לסירוגין כל 15 דקות. צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם במשך 10 דקות, בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט.תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, אם יש צורך לאחסן במשך מספר ימים. בצעו החייאה של התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעת FACS, 2%FBS ב-PBS. רכוש את הנתונים בציטומטר הזרימה.התמונות של לוחות אגר SS המוצגים כאן, מצביעות על נטל ה- CFU האיברי בכבד ובטחול של עכברי ספיגה. האיבר ההומוגני Lys6 התפשט בדילול של 10 בחזקת מינוס אחת, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס. מושבות S.Typhimurium בעלות הפיגמנט השחור הופיעו לאחר כ-12 שעות לאחר הדגירה.חלק מהצלחת מוצג כאן ככניסה מוגדלת כדי להדגיש את המושבות. תוצאות אלה מצביעות על כך שהפתוגן התפשט בהצלחה באופן שיטתי, והתיישב באיברים הפנימיים. נתון זה מראה את הסרה המבודדת מעכברים בריאים וספגניים.נפח הדם הניתן לאיסוף מעכברים ספטיים קטן יותר משליטים בריאים, ולכן הסרום המתקבל קטן יותר. זה קורה בגלל קרישה מוגברת באלח דם. גם הסרה מעכברי ספיגה, מראים צבע אדום מובהק, המציין את התרחשותה של המוליזה נרחבת.האיור מראה חלקות ציטומטריות של תאי פריטוניאל מעכברים בריאים וספגניים, מוכתמים בנוגדן אנטי-Ly6G. תמונות אלה מייצגות עכבר אחד בריא ושני עכברים נגועים. עכברים ספטיים ראו חדירה מוגברת של נויטרופילים לחלל הצפק.בסרטון זה הראינו שיטה לגרימת אלח דם חיידקי בעכברים, על ידי הזרקה תוך-צפקית של סלמונלה טיפימוריום. זהו מודל שימושי לחקר ההשפעות של התערבויות טיפוליות בהחלשת אלח דם. במערכת מודל זו, ההרכב התאי של חלל הצפק משתנה באופן דרמטי על מנת להילחם בפתוגן.לכן, זהו מודל שימושי, בחקר השינויים הקינטיים בהרכבי תאי מערכת החיסון ובתפקודיהם במהלך אלח דם. המודל שימושי גם להבנת העלייה במינים של חמצן תגובתי בין-תאי, רמות ציטוקינים פרו-דלקתיות, המוליזה וקרישת דם, שכולם מתרחשים במהלך אלח דם.

characterizing-salmonella-typhimurium-induced-septic-peritonitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

לבסס מודל כרוני חיידקי עכבר נגוע...

כרוני סלמונלה עכבר אינפקטד דגם

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

מקור: לו, ב. ס. ואחרים. זיהום כרוני בסלמונלה פיברוזיס במעי. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון מדגים את כימות העומס החיידקי במודל עכבר של זיהום כרוני בסלמונלה טיפימוריום עמידה לסטרפטומיצין. לאחר המתת חסד וניתוח סטרילי, רקמות ציקלי וטחול נקצרות, הומוגניות עם חרוזי פלדה לשחרור חיידקים, ומדוללות באופן סדרתי. הדילול מצופה על אגר סלקטיבי, ומושבות נראות נספרות להערכת עומס חיידקי לגרם רקמה באתרים מעיים ומערכתיים.

כימות עומס חיידקי רקמה במודל עכבר של זיהום כרוני במעי

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

Assay תפוקה גבוהה לסלמונלה במבחנה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה, ושכפול בתאי phagocytic עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח. השיטה הועסקה כדי להעריך זנים מוטנטים נוקאאוט גן סלמונלה למעורבותם באינטראקציות מאכסן לפתוגן.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ Enterica סלמונלה Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

פרוטוקול זה מספק את הצעדים הדרושים כדי ליצור ולהעריך אלח דם neonatal בעכברים בן יום-7.

דגם עכבר מבוקר Neonatal אלח דם Polymicrobial

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

סלמונלה פולשת ומשתכפלת בתוך תאי אפיתל מעיים הן בוואקולות ספציפיות לסלמונלה והן בחינם בציטוזול (היפר-שכפול). פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה מתואר כאן כדי לכמת את הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה על ידי שני ניתוחי תמונה משלימים באמצעות ImageJ, המגיעים לרזולוציה של תא בודד וניקוד.

ניתוח אוטומטי של פנוטיפים תוך תאיים של סלמונלה באמצעות ImageJ

קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) הוא מודל סטנדרטי ביותר עבור אלח דם בטן polymicrobial במכרסמים. מאמר זה מתאר את הליך כירורגי של CASP. המודל CASP גירסאותיה, לאפשר חקירה שיטתית של בעיות שונות לגבי הנושא של אלח דם.

קולון Ascendens סטנט דלקת הצפק (CASP) - מודל סטנדרטי עבור אלח דם בטן Polymicrobial

למדו איך לייצר דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות Salmonella Typhimurium. מודל זה מאפשר חקירת תגובות דלקתיות ומחקר מנגנוני ספסיס לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

גלה סרטונים נוספים