אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של זיהום או נזק. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו, במהלך מגיפת COVID-19. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מוות של אלח דם, ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים כמעט 20% מכלל מקרי המוות בעולם.

כצפוי, רוב המקרים הם בבתי חולים. למעשה, מחקר מצא כי כמעט 62% מהבודדים החיוביים מחולים ביחידות טיפול נמרץ עם אלח דם, היו אורגניזמים גראם שליליים. ישנם מספר מודלים, וכמה מהמודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי LPS, מודל קשירת cecal ונקב, ומערכות מודל זיהום מונובקטריאלי.

במעבדה שלנו, תיקנו מערכת מודל של עכבר, כדי לגרום לאלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים, כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם דלקת הצפק במודל זה, היא מערכתית עם 100% תמותה, בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה.

לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות המארח הדלקתי. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון CFU של סלמונלה טיפימוריום, בעכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר, על ידי הערכת נטל חיידקי איברים, כ 16 שעות לאחר ההדבקה.

הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום, דורשים מתקן BSL-2, ועמידה בהנחיות BSL-2. יש להקפיד על שימוש ב-PPE תקין, וכדי להבטיח בטיחות, ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים.

הכנת תרבות של סלמונלה טיפימוריום. הוסף מאה מיקרוליטר של סלמונלה טיפימוריום NCTC 12023 מלאי גליצרול, לתוך 3 מ"ל של מרק LB. דגירו את התרבות ב-160 סיבובים לדקה, ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה.

פזרו 50 מיקרוליטר מתרבית הלילה שגדלה בציר LB, על צלחת אגר סלמונלה שיגלה, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. בחרו מושבה בודדת מתוך צלחת ה-SS אגר המפוספסת, באמצעות מיקרוטיפ. פולטים את המיקרו-טייפ ל-3 מ"ל של ציר LB, ואת תרבית ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס בלילה.

מוסיפים 0.1 מ"ל מתרבית החיידקים ל-50 מ"ל של ציר LB, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, באינקובטור שייקר ב-160 סל"ד, למשך שלוש עד ארבע שעות, כדי להגיע לשלב הלוגריתמי של הצמיחה. דיללו את התרבות בפקטור של שניים באמצעות ציר LB. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 ננומטר של אור בספקטרופוטומטר.

ברגע שה-OD מגיע לאחד, הכינו שני אליקוטים של 1 מ"ל של תרבית, בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה הצינורות ב 7, 750 G במשך 15 דקות. השליכו את חומר העל הזה, ושטפו את הכדור עם 1 מ"ל של 1XPBS פעמיים.

צנטריפוגה הצינורות ב 7, 750 G במשך 15 דקות. בצעו שימוש חוזר בכדור ב-0.5 מ"ל של 1XPBS, בשני צינורות מיקרו-פוג' שונים של 1.5 מ"ל. שלבו את המתלים משני הצינורות, לצינור אחד של 1.5 מ"ל, המכיל כעת, כשני כפול שניים כפול 10 מוגבהים להספק של שמונה יחידות יוצרות מושבה לכל מ"ל.

הכינו תרחיף של תאי חיידקים בהספק של 10 הספק של שישה CFU/מ"ל, על ידי דילול תמיסת המלאי. הערה חשובה, מטב את ה- CFU המתאים ל- OD במעבדה שלך, כדי לקבוע את ה- CFU עבור OD אחד, לפני תחילת הניסויים. עכברים וזיהומים.

ביום ההדבקה, החזיקו את העכבר ביד אחת, נגבו את עור הבטן ב-70% אתנול ופרשו את הרגליים האחוריות לנגישות טובה יותר של דופן הבטן. הזריקו 0.5 מ"ל מתוך 10 בעוצמה של שישה תרחיפים חיידקיים מסוג CFU/mL באופן תוך-צפקי, בעזרת מזרק של 1 מ"ל. לאחר ההדבקה, צלחו את התרבית כדי לבדוק את ה-CFU בפועל שהוזרק, שעשוי לנוע בין 0.2 ל-0.8 מיליון CFU לכל 0.5 מ"ל.

הערכת CFU של איברים. העכבר הוקרב באמצעות חנק פחמן דו חמצני. לאחר הקרבת העכבר הנגוע, נגבו את הבטן בחתיכת כותנה, טבולה ב-70% אתנול.

חותכים את עור הבטן. עיין במאמר של ריי ודיטל, לפרוטוקול וידאו, על איך לאסוף נוזל שטיפה פריטוניאלי. חותכים לפתוח את חלל הצפק ולאסוף את איבר העניין.

בסרטון זה אנו מדגימים את הספירה של CFU איברים מהכבד. הכבד עובר נזק היסטופתולוגי נרחב, במודל זה של אלח דם. חותכים חתיכת כבד קטנה ומניחים אותה בצינור מיקרופוגה.

זה יכול להיות מאוחסן בקרח במשך שעתיים עד שלוש שעות, לפני שממשיכים לשלב הבא. שקלו את החתיכה והעבירו אותה לצינור מיקרו-פוגה. רצוי, לחתוך את החלקים במשקל סביב 10 עד 15 מ"ג, עבור הומוגניזציה נכונה.

הוסף 0.5 מ"ל של 1XPBS בצינור והומוגניזציה של האיברים באמצעות הומוגנייזר ידני. ודא כי האיברים הם הומוגניים לחלוטין. השלם את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל, על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1XPBS.

צנטריפוגה של הצינורות ב-200 G במשך חמש דקות, בארבע מעלות צלזיוס. אספו את ה-supernatant לתוך צינורות מיקרו-פוג'ים טריים. הכינו דילולים של 10 להספק מינוס אחד, ו-10 להספק מינוס שתיים, בלוחית באר של 96.

מורחים 50 מיקרוליטר של המדולל, על צלחות אגר אס-אס טריות, ומדגרים את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. ספרו את מספר המושבות המופיעות בכל מצב, ונרמלו את הנתונים עם משקל האיבר, באמצעות הנוסחה הבאה. CFU/mg שווה למספר המושבות, כפול 20, כפול גורם הדילול, כולו מחולק לפי משקל האיברים במ"ג.

שים לב, המספר 20 משמש בנוסחה, כדי להמיר את המושבות לכל לוח ל- CFU / mL. מספר זה מגיע, על ידי חלוקת 1 מ"ל של כמות של נפח נתון של תרבות מצופה. במקרה זה, 50 מיקרוליטר.

לדוגמה, אם אתה מוצא מאה מושבות בצלחת אגר SS, שבה 50 מיקרוליטר של 10 כוח מינוס דילול אחד של איבר הומוגני, במשקל 10 מ"ג מתפשט, אז CFU / mg יהיה שווה 100 כפול 20, כפול 10, כפול 10, את כל חלקי 10, אשר שווה 2000 CFU / mg. ניתוח ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיות שונות של תאי מערכת החיסון בהפרשת הצפק. אסוף את תאי הצפק כפי שתואר קודם לכן, על ידי ריי ודיטל.

יש להחיות את גלולת התאים מנוזל שטיפת הצפק, ב-1 מ"ל של RPMI בתוספת 10% FBS. ספירת מספרי התאים הכוללים בשטיפת הצפק, באמצעות המוציטומטר. התאם את מספר התא באופן כזה, שכל צינור יקבל שניים עד חמישה כפול 10 המוגבהים לעוצמה של חמישה תאים.

סובבו את התאים כלפי מטה ב-200 G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט. שטפו את התאים פעם אחת עם 1XPBS.

צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם למשך 10 דקות. חסום את קולטני Fc באמצעות חוסם FcR. האחת היא ל-400 דילול, שהוכן במאגר חסימה, המורכב מ-5% FBS ו-0.02% נתרן אזיד ב-PBS.

דגירה על קרח במשך 15 דקות. צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט.

דילול הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום בעלי עניין בחסימת מאגר. כאן, אנו משתמשים באחד הוא 500 דילול של Ly6G נגד עכבר, כדי להכתים נויטרופילים. שימו לב, ניתן גם להראות אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון, באמצעות B220 נגד עכבר עבור תאי B, CD3 נגד עכבר עבור תאי T, F4/80 נגד עכבר עבור מקרופאגים וכו '.

דגירה של כ-0.2 מיליון תאים ב-200 מיקרוליטרים של תמיסות מדוללות של נוגדנים, בצינורות נפרדים. כבקרה שלילית, הניחו בצד צינור אחד בכל סוג פלואורוכרום, לשליטה לא מוכתמת. בצינור זה, לדגום את התאים עם 200 microliter של מאגר חוסם ללא נוגדנים.

הדגירו את הדגימות על קרח למשך 45 דקות, תוך הקשה לסירוגין כל 15 דקות. צנטריפוגה של התאים ב-200 גרם במשך 10 דקות, בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט.

תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, אם יש צורך לאחסן במשך מספר ימים. בצעו החייאה של התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעת FACS, 2%FBS ב-PBS. רכוש את הנתונים בציטומטר הזרימה.

התמונות של לוחות אגר SS המוצגים כאן, מצביעות על נטל ה- CFU האיברי בכבד ובטחול של עכברי ספיגה. האיבר ההומוגני Lys6 התפשט בדילול של 10 בחזקת מינוס אחת, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס. מושבות S.Typhimurium בעלות הפיגמנט השחור הופיעו לאחר כ-12 שעות לאחר הדגירה.

חלק מהצלחת מוצג כאן ככניסה מוגדלת כדי להדגיש את המושבות. תוצאות אלה מצביעות על כך שהפתוגן התפשט בהצלחה באופן שיטתי, והתיישב באיברים הפנימיים. נתון זה מראה את הסרה המבודדת מעכברים בריאים וספגניים.

נפח הדם הניתן לאיסוף מעכברים ספטיים קטן יותר משליטים בריאים, ולכן הסרום המתקבל קטן יותר. זה קורה בגלל קרישה מוגברת באלח דם. גם הסרה מעכברי ספיגה, מראים צבע אדום מובהק, המציין את התרחשותה של המוליזה נרחבת.

האיור מראה חלקות ציטומטריות של תאי פריטוניאל מעכברים בריאים וספגניים, מוכתמים בנוגדן אנטי-Ly6G. תמונות אלה מייצגות עכבר אחד בריא ושני עכברים נגועים. עכברים ספטיים ראו חדירה מוגברת של נויטרופילים לחלל הצפק.

בסרטון זה הראינו שיטה לגרימת אלח דם חיידקי בעכברים, על ידי הזרקה תוך-צפקית של סלמונלה טיפימוריום. זהו מודל שימושי לחקר ההשפעות של התערבויות טיפוליות בהחלשת אלח דם. במערכת מודל זו, ההרכב התאי של חלל הצפק משתנה באופן דרמטי על מנת להילחם בפתוגן.

לכן, זהו מודל שימושי, בחקר השינויים הקינטיים בהרכבי תאי מערכת החיסון ובתפקודיהם במהלך אלח דם. המודל שימושי גם להבנת העלייה במינים של חמצן תגובתי בין-תאי, רמות ציטוקינים פרו-דלקתיות, המוליזה וקרישת דם, שכולם מתרחשים במהלך אלח דם.