Name: טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: למד שיטה חדשה למתן תרופות אנטי-רטרו-ויראליות דרך הפה בעכברים מושבאים עם HIV-1. השיטה מדכאת שכפול RNA ויראלי ביעילות תוך הקטנת מתח בבעלי החיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר רומאס גלזיונאס ולג'ף מורי ולאנשים בגיליאד על אספקת התרופות האנטי-רטרו-ויראליות ששימשו במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי NCI 1R01CA239261-01 (למטבח), מענקי NIH P30AI28697 (ליבת הווירולוגיה של UCLA CFAR, ליבת הטיפול בגנים ותאים, וליבת עכבר אנושית), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (לג'ן), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (קאריו). עבודה זו נתמכה גם על ידי מכון האיידס של UCLA, קרן הצדקה על שם ג'יימס ב. פנדלטון וקרן משפחת מקארתי.

רקמת עובר אנושית אנונימית נרכשה באופן מסחרי. המחקר בבעלי חיים בוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, וועדת המחקר בבעלי חיים (UCLA) (ARC) בהתאם לכל ההנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות. באופן ספציפי, כל הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות ולהנחיות לדיור וטיפול בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והאגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AALAC) הבינלאומי תחת פרוטוקול ARC מספר UCLA 2010-038-02B. כל הניתוחים בוצעו תחת קטמין (100 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (5 מ"ג/ק"ג) והרדמה איזופלורן (2-3 וולט%) וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הכאב ואי הנוחות של בעלי החיים.
1. עכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1
הערה: עכברים אנושיים נבנו כפי שתואר קודם לכןב-30,31,49. הפרוטוקול מתואר בקצרה להלן.
<ol><li>לטהר את CD34+ תאי אב המטופויאטיים מהכבד העוברי האנושי באמצעות מיקרובים אנטי-CD34 בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>להרדים עכברים זכרים ונקבות בני 6-8 שבועות מסוג NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) ולהקרין באופן תת-קטלני (2.7 Gy) לפני הניתוח.</li>
	<li>שתל תימוס, המופק מאותו תורם כמו כבד העובר, מתחת לכמוסת הכליה יחד עם הכבד.</li>
	<li>לאחר ההשתלה, הזריקו לעכברים 0.5 מיליון עד מיליון תאי CD34+, דרך הווריד.</li>
	<li>לאחר 8-10 שבועות, אסוף 100 μL של דם עכבר באמצעות דימום רטרו-אורביטלי50 לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 5 μL של EDTA וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 3 דקות.</li>
	<li>אחסן את הפלזמה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לפקח על העומס הנגיפי לאחר שהעכבר נדבק ב- HIV-1. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת NH4C 83% ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ללזות תאי דם אדומים.</li>
	<li>יש להוסיף 10 מ"ל של RPMI עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את התזה. סובב ב 300 x גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשאוף סופרנטנט. תאי כתם עם פאנל נוגדנים (ראו טבלת חומרים) ונתחו על ידי ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את השתלת תאי החיסון האנושיים.</li>
	<li>להדביק עכברים המציגים יותר מ-50% מתאי CD45+ במחזור הדם על ידי הזרקת ורידים רטרו-אורביטליים51,52 עם לפחות 200 ננוגרם של p24 של זן HIV-1 (כלומר, NFNSXSL9 30,53,54) באמצעות מזרק אינסולין. לאסוף דם דו שבועי לניתוח ציטומטריה זרימה ולמדוד את העומס הנגיפי.</li>
</ol>2. הכנת תרופות ART
<ol><li>לשקול תרופות בודדות; לדוגמה, כדי להכין 10 כוסות מזון עם cART, השתמש במגרדי תאים סטריליים כדי לשקול 250 מ"ג של FTC (Emtricitabine), 375 מ"ג של TDF ו-500 מ"ג של RAL או ELV לצינורות צנטריפוגה סטריליים בודדים של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 250 מ"ג צינור FTC (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), הוסף 1.5 מ"ל של DMSO לתוך 375 מ"ג TDF צינור (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), והוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 500 מ"ג RAL או צינור ELV (ריכוז סופי של 500 מ"ג / מ"ל). מערבבים או מקטרים את תערובת התרופות עד להמסה מלאה ומתקבל פתרון ברור.</li>
	<li>השתמש במסנן קרום PVDF הידרופילי בגודל 0.22 μM כדי לעקר תמיסות באמצעות מזרק סטרילי. פתרונות סמים בודדים ניתן לאחסן ב -20 °C (75 °F) במשך 12 שבועות.</li>
	<li>כאשר הוא מוכן לשימוש, יש להפשיר אליקוט אחד של כל תמיסת תרופה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהפתרון מתבהר. מערבבים היטב באמצעות פיפט.</li>
	<li>שלבו תרופות וערבבו היטב כדי ליצור תערובת מאסטר: 1 מ"ל של FTC ב-DMSO, 1.5 מ"ל של TDF ב-DMSO, ו-1 מ"ל של ELV או RAL ב-DMSO. הערה: כמות זו תכין 10 כוסות מזון.</li>
	<li>הוסיפו 350 מיקרון של תמיסת תערובת מאסטר cART לכוס אחת כדי להכין cART אחת של DietGel Boost.</li>
	<li>הוסיפו לכוס 0.75 מ"ל של טרימתופרים-סולפאמתוקסזול (ריכוז סופי של 0.48 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>מערבבים היטב באמצעות 1 מ"ל קצוות פיפטה סטריליים.</li>
	<li>אליקוט את המזון המכילה cART מהכוס המקורית עם מיקרו מרית על צלחת פטרי 60 מ"מ לפי הצורך. שקלו את המזון בסולם כדי לחשב את כמות המזון המכילה cART עבור כל כלוב בהתאם למספר העכברים.</li>
</ol>3. מתן תרופות ART לעכברים נגועים ב- HIV-1
<ol><li>הוציאו צ'או רגיל מהכלוב והחליפו אותו בכוס מזון המכילה cART. הערה: בממוצע, עכבר יאכל עד 5 גרם מזון ביום. ניתן לתת בערך מזון אחת לחמישה עכברים למשך יומיים.</li>
	<li>רעננו את האוכל של cART שלוש פעמים בשבוע.</li>
	<li>שקלו כוסות משומשות כדי לעקוב אחר הצריכת. שקלו עכברים מדי שבוע כדי לאשר את הצריכה.</li>
</ol>4. עקוב אחר עומס ויראלי על ידי PCR בזמן אמת
<ol><li>הערך את תאי מערכת החיסון האנושית (רמות תאי T מסוג CD4 ו-CD8) ואת שכפול ה-HIV-1 בעכברי BLT כל שבועיים על-ידי דימום רטרו-אורביטלי. קציר פלזמה על ידי ביצוע ההוראות בשלבים 1.5-1.8.</li>
	<li>עקוב אחר עומסים נגיפיים בפלזמה של עכברים הנגועים ב- HIV-1 לפני ובמהלך מתן cART דרך הפה במשך 8 שבועות. חלצו RNA נגיפי פלזמה מפלזמה באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית וכמתו על ידי PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים וגששים (ראו טבלת חומרים) כפי שתואר קודם לכן 27,30,31. השתמש בפרוטוקול המחזור הבא: 48 °C (15 דקות), 95 °C (10 דקות), ולאחר מכן רכיבה על אופניים 95 °C (15 שניות), 60 °C (דקה אחת) במשך 45 מחזורים.</li>
</ol>5. הערך את יחסי CD4/CD8 לפי ציטומטריה של זרימה
<ol><li>הכן תרחיפים חד-תאיים מדם היקפי של דימומים דו-שבועיים בשלבים 1.5-1.8.</li>
	<li>תאי כתם עם סמני פני השטח ולנתח על ידי ציטומטריה זרימה. השתמש בנוגדנים הבאים של סמן פני השטח 27,30,43,49 בציטומטריית זרימה: CD45 (שיבוט HI30), CD8 (שיבוט SK1), CD3 (שיבוט OKT3), CD4 (שיבוט RPA-T4)27,30,42,49.</li>
</ol>

SK היא המייסדת של CDR3 Inc. שאר המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

שיטת מתן cART דרך הפה מפותחת כאן עבור עכברים נגועים ב- HIV-1 על ידי שילוב של שלוש תרופות אנטי-רטרו-ויראליות בתוך מזון עשיר בחומרים מזינים. בהשוואה למתן על ידי זריקות יומיות, משלוח דרך הפה קל יותר לשימוש, מגביל את תדירות הניהול, מפחית את הטיפול בבעלי חיים, ממזער מתח ומשפר את הבטיחות55. עד לנקודה זו, רק מחקרים מעטים בעכברים אנושיים 24,37,41 השתמשו בכדורי מזון המכילים תרופות ART כתושות לטיפול בעכברים. עם זאת...

תוחלת החיים של אנשים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי הכרוני (HIV) השתפרה באופן משמעותי עם טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART)1,2. cART מפחית בהצלחה את שכפול ה- HIV-1 ומגדיל את ספירת תאי ה- CD4+ T לנורמליות אצל רוב המשתתפים הנגועים ב- HIV-1 באופן כרוני3, וכתוצאה מכך בריאות כללית משופרת והפחתה דרמטית בהתקדמות המחלה4. עם זאת, מאגר HIV-1 סמוי נוצר גם כאשר ART הוא יזם במהלך זיהום חריף 5,6,7. המאגרים נמשכים לאורך שנים במהלך ART וריבאונד נגיפי מהיר לאחר שהפרעת ART מתועדת היטב 8,9. אנשים החיים עם HIV על ART הם גם נטייה לסיכון גבוה יותר של תחלואה נלווית כגון מחלות לב וכלי דם, סרטן, והפרעות נוירו10,11,12. לכן, יש צורך בתרופה פונקציונלית ל- HIV. מודלים של בעלי חיים לזיהום ב- HIV-1 מציעים יתרונות ברורים בפיתוח ואימות אסטרטגיות ריפוי HIV חדשניות13,14,15. עכברים אנושיים, כמודל של חיה קטנה, יכולים לספק שחזור תאי חיסון אנושיים רב-שכבתיים ברקמות שונות, מה שמאפשר מחקר מקרוב של הידבקות ב- HIV16,17,18,19. מבין המודלים האנושיים, המודל האנושי של מח עצם-כבד-תימוס (BLT) משחזר בהצלחה זיהום כרוני ב-HIV-1, כמו גם תגובות חיסוניות אנושיות פונקציונליות לזיהום ב-HIV-1 20,21,22,23,24. לכן, מודל עכבר BLT האנושי נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור היבטים שונים בתחום המחקר של HIV. עכברי BLT אנושיים הם לא רק מודלים מבוססים היטב לסיכום של זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה, אלא גם כלים תוצאתיים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול בתאים. המחברים הנוכחיים ואחרים הראו כי מודל עכברי BLT האנושיים משחזר זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה 25,26,27 ומספק כלים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול תאי 28,29,30,31,32,33. 
משטרי cART המורכבים משילובים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הנלקחות מדי יום מדכאות שכפול HIV-1 עד כדי כך שהעומס הנגיפי אצל אנשים שטופלו בהצלחה נותר בלתי ניתן לגילוי לאורךזמן 34. התוצאות של טיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV עם משטרי cART רלוונטיים מבחינה קלינית דומות לאלה שנצפו אצל אנשים נגועים ב- HIV-1 שטופלו ב- ART22: רמות HIV-1 מדוכאות מתחת לגבולות הגילוי וההפרעה של cART גורמת לריבאונד של שכפול HIV מהמאגר הסמוי35. הזרקה תת-עורית (SC)27,36,37 או תוך-צפקית (IP)37,38,39 היא המסלול המשמש בדרך כלל לטיפול ב-cART בעכברים אנושיים. עם זאת, הזרקה יומית אינטנסיבית גורמת ללחץ על בעלי חיים על ידי ריסון פיזי40. היא גם דורשת עבודה רבה ועלולה להיות לא בטוחה לחוקרים בשל חשיפה מוגברת ל-HIV תוך שימוש בחדים. מתן אוראלי הוא אידיאלי כדי לחקות את הספיגה, ההפצה וההפרשה של תרופות cART כי הם נלקחים על ידי אנשים נגועים ב- HIV-1. מתן אוראלי כולל בדרך כלל הליכים מותאמים אישית ולעתים קרובות מייגעים כדי לשים את התרופות antiretroviral מעוקר (הכרחי בשל הכשל החיסוני של העכברים) מזון 24,37,41 או מים 42,43,44,45,46 אשר עשוי או לא יכול להיות תואם כימית עם תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, או לגרום למשהו שהעכברים לא יאכלו או ישתו בקלות (מה שישפיע על רמות המינון והתרופות בגוף)., שיטת ניהול ה- cART הפרולית החדשנית המוצעת כאן עולה על ניסיונות אספקה קודמים בשל תאימותה לסוגים שונים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות, בטיחות וקלות הכנה וניהולם, והפחתת מתח וחרדה של בעלי חיים הנובעים מההזרקה היומית.
Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) ו- Raltegravir (RAL) הן תרופות מסיסות במים. באופן מעניין, הזמינות הביולוגית המוגברת של TDF נצפתה עם מזונות שומניים, מה שמרמז על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון שומני עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF47. לכן, כוסות DietGel Boost נבחרו להחליף צ'או מכרסם רגיל כשיטת אספקה המבוססת על תכולת השומן הצנועה שלהן (20.3 גרם ל-100 גרם) בהשוואה לצ'או מכרסמים רגיל (10 גרם ל-100 גרם) ודיאטה טיפוסית עתירת שומן של עכברים (40-60 גרם ל-100 גרם)48. המשקל הכולל של אחת הוא 75 גרם; לפיכך, כל תכיל את כמות המזון, ולכן תרופות, מספיק עבור 5 עכברים במשך 3 ימים.

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td>לציטוט מזון ART</td></tr><tr><td>APC אנטי אנושי CD8 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>344722</td><td>לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>לאיסוף נתוני זרימה</td></tr><tr><td>CD34 מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>לייצור עכברי NSG-BLT</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>להמסת ART</td></tr><tr><td>DietGel Boost</td><td>ClearH2O</td><td>72-04-5022</td><td>להכנת מזון ART</td></tr><tr><td>Elvitegravir</td><td>Gilead</td><td></td><td>מתנה מגיליאד</td></tr><tr><td>Emtricitabine</td><td>Gilead</td><td></td><td>מתנה מגיליאד</td></tr><tr><td>FITC אנטי אנושי CD3 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td>לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>Flowjo FlowJo</td><td></td><td>לניתוח נתוני זרימה ציטומטרית</td></tr><tr><td>פריימר קדימה HIV-1: 5&prime;-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3&prime;;</td><td>IDT</td><td>מותאם</td><td>אישית לעומס ויראלי RT-PCR</td></tr><tr><td>HIV-1 בדיקה: 5&prime;-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT TAACTG [Tamra-Q]-3&prime;;</td><td>IDT</td><td>מותאם</td><td>אישית לעומס ויראלי RT-PCR</td></tr><tr><td>HIV-1 פריימר הפוך: 5&prime;-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3&prime;;</td><td>IDT</td><td>מותאם אישית</td><td>לעומס ויראלי RT-PCR</td></tr><tr><td>רקמת עובר אנושית</td><td>Advanced Bioscience Resources, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכברים, זן NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>5557</td><td>לבניית העכברים המואנשים</td></tr><tr><td>פסיפיק בלו אנטי אנושי CD45</td><td>Biolegend</td><td>304022</td><td>לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>PerCP אנטי-אנושי CD4 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td>לזרימה ציטומטריית</td></tr><tr><td>QIAamp ערכות RNA ויראליות</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 52904</td><td>למדידת עומס נגיפי</td></tr><tr><td>Raltegravir</td><td>Merck</td><td></td><td>במתנה</td></tr><tr><td>ממגרדי תאים סטריליים</td> של Merck <td>Thermo Scientific</td><td>179693</td><td>לציון מזון ART</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-To-Ct ערכת 1 שלב</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td></td><td>4392653 לזיהוי עומס נגיפי בפלזמה</td></tr><tr><td>Tenofovir disoproxil fumarate</td><td>Gilead</td><td></td><td>מתנה מגיליאד</td></tr><tr><td>Trimethoprim-Sulfamethoxazole</td><td>Pharmaceutical Associates</td><td>NDC 0121-0854-16</td><td>לשמירה על מזון ART סטרילי. כל כפית של 5 מ"ל מכילה 200 מ"ג סולפאמתוקסזול, USP 40 מ"ג טרימתופרים, USP NMT 0.5% אלכוהול</td></tr></tbody></table>

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- hiv-1

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

מגפת נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) ממשיכה להתפשט ללא הפרעה ברחבי העולם, ונכון לעכשיו, אין חיסון זמין נגד HIV. למרות שטיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART) הצליח לדכא שכפול נגיפי, הוא אינו יכול למגר לחלוטין את המאגר מאנשים נגועים ב- HIV. אסטרטגיית ריפוי בטוחה ויעילה להידבקות ב- HIV תדרוש שיטות רב-תכליתיות, ולכן ההתקדמות של מודלים חייתיים לזיהום ב- HIV-1 הם מרכזיים לפיתוח מחקר ריפוי HIV. עכברים אנושיים משחזרים תכונות מרכזיות של הידבקות ב- HIV-1. מודל העכבר האנושי יכול להיות נגוע ב- HIV-1 וניתן לשלוט בשכפול הנגיף באמצעות משטרי cART. יתר על כן, הפרעה ל-cART גורמת לריבאונד נגיפי מהיר בעכברים אנושיים. עם זאת, מתן cART לבעל החיים יכול להיות לא יעיל, קשה או רעיל, ומשטרי cART רלוונטיים רבים מבחינה קלינית אינם ניתנים לניצול מיטבי. לצד היותו עלול להיות לא בטוח עבור חוקרים, מתן cART על ידי הליך הזרקה יומי אינטנסיבי נפוץ גורם ללחץ על ידי ריסון פיזי של החיה. שיטת cART האוראלית החדשנית לטיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1 המתוארת במאמר זה הביאה לדיכוי של וירמיה מתחת לרמת הזיהוי, לשיעור מוגבר של שחזור CD4+ ולשיפור הבריאות הכללית בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.

בהנחה שעכבר ממוצע השוקל 25 גרם צורך 4 גרם מזון ביום, מינון התרופה היומית באמצעות צריכה פומית מתאים ל-2.88 מ"ג/ק"ג TFV, 83 מ"ג/ק"ג FTC ו-768 מ"ג/ק"ג RAL. כדי לבחון אם משטר המזון הממוטב רעיל ומשפיע על הבריאות הכללית בהשוואה להזרקה יומית של cART, משקל העכברים היה מנוטר מדי שבוע לפני ובמהלך cART באמצעות הזרקה דרך הפה או התת עור. לא היו הבדלי משקל משמעותיים לפני מתן cART בכל קבוצה (איור 1). עם זאת, משקל העכבר ירד ללא הרף במהלך הזרקת cART SC יומית. לעומת זאת, FTC/TDF/ELV או FTC/TDF/RAL ב-DietGel ה...

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה המדכאות בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה, או ART, המדכאת בהצלחה שכפול HIV RNA בעכברים אנושיים. שיטת ART האוראלית החדשנית עולה על ניסיונות לידה קודמים בשל בטיחותה, קלות ההכנה והניהול שלה, והפחתת הלחץ על בעלי חיים כתוצאה מהזרקה יומית. שיטת המסירה האוראלית המוצעת לדיכוי שכפול RNA של HIV בעכברים אנושיים תהיה בעלת ערך רב למחקרי הוכחת היתכנות פרה-קליניים לפיתוח טיפולי ריפוי חדשניים המחקים באופן הדוק את אספקת התרופה אצל אנשים הנגועים ב- HIV כרוני.מי שתדגים את ההליך תהיה ולרי רזאק, מנהלת מעבדה וטכנאית מהמעבדה שלנו. התחל על ידי שקילת תרופות בודדות. הכינו 10 כוסות מזון עם cART באמצעות מגרדי תאים סטריליים כדי לשקול 250 מיליגרם של FTC, 375 מיליגרם של TDF ו-500 מיליגרם של RAL או ELV לצינורות צנטריפוגה בודדים סטריליים של 50 מיליליטר בארון בטיחות ביולוגי.הוסף DMSO לצינור FTC ו- TDF כדי ליצור ריכוז סופי של 250 מיליגרם למיליליטר, ולתוך צינור RAL או ELV לריכוז סופי של 500 מיליגרם למיליליטר. מערבבים את תמיסת התרופה על ידי ערבוב ופיפטינג עד לקבלת תמיסה ברורה. לעקר את התמיסות באמצעות מסנן קרום PVDF הידרופילי בגודל 0.22 מיקרומטר עם מזרק סטרילי.פתרונות סמים בודדים ניתן לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 12 שבועות. הפשרה טרייה של אליקוט אחד מכל תמיסת תרופה לפני השימוש ב

oral-combinational-antiretroviral-treatment-hiv-1-infected-humanized

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת היעילות של טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב פומי (cART אוראלי) במודל עכבר אנושי נגוע בנגיף חיסוני אנושי-1 (HIV-1). שילוב של תרופות המכוונות ל- HIV-1, כולל מעכבי שעתוק לאחור נוקלאוזיד ומעכבי העברת גדילי אינטגראז, ניתנים יחד עם תוסף תזונה ואנטיביוטיקה. בעקבות צריכת תערובת זו על ידי עכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1, הדיכוי היעיל של שכפול ויראלי מוערך באמצעות בדיקות תקופתיות של העכברים.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב אוראלי לטיפול בזיהום HIV-1 במודל עכבר אנושי

הסרטון מדגים טכניקה ליצירת מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). רקמת תימוס עוברית אנושית ותאי גזע המטופויטיים מהונדסים (HSC) מושתלים בכמוסת הכליה של עכבר מדוכא חיסון חמור. HSCs, המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) נגד HIV, מעורבבים בתערובת חלבונים ג'לטינית המקדמת את לוקליזציה משותפת שלהם עם רקמת בלוטת התימוס. לאחר ההליך, HSCs להתמיין לתאים חיסוניים אנושיים שונים, וכתוצאה מכך לפתח מודל עכבר אנושי עם מערכת חיסון אנושית פונקציונלית נגד HIV.

בניית מודל עכבר אנושי עם חסינות מהונדסת נגד HIV

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים...

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

המתואר כאן הם שלוש גישות ניסיוני ללמוד את הדינמיקה של זיהום HIV בעכברים הומניזציה. הראשון מתיר את המחקר של אירועי זיהום כרונית, בעוד שני האחרונים מאפשר לימוד של אירועים חריפים לאחר זיהום ראשוני או נגיפי ההפעלה מראש.

כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה

פיתחנו פרוטוקול עבור הדור והערכה של הומניזציה ונגיף הכשל החיסוני האנושי חעוגה מודל העכבר מבוסס על השתלת תא גזע, הנגיף החיסוני intravaginal האדם חשיפה, ו-droplet דיגיטלי PCR RNA כימות.

הומניזציה חעוגה עכברים עבור חשיפה Intravaginal HIV וטיפול בזיהום HIV

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

מבחני cytotoxicity למדוד טבעי התא הרוצח התגובות ממס ל-HIV נגועים בתאי מוגבל על ידי טוהר התאים היעד. אנו מדגימים כאן את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 נגוע T-cell תקיעות ראשונית על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

למד שיטה חדשה למתן תרופות אנטי-רטרו-ויראליות דרך הפה בעכברים מושבאים עם HIV-1. השיטה מדכאת שכפול RNA ויראלי ביעילות תוך הקטנת מתח בבעלי החיים.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

גלה סרטונים נוספים