טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

פרוטוקול זה מאפשר לתייג חלבונים באופן ספציפי לסוג התא. זוהי הטכניקה הראשונה המציעה אפשרות כזו וזה יכול להיעשות in vitro או in vivo. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי חלבונים ספציפיים סוג התא מסומן ניתן לטהר לא מזוהה, או לדמיין באתרו על ידי immunofluorescent.

כדי להתחיל להכין את הרקמה lysate על ידי הוספת חיץ ליזיס בנפח של 12 עד 15 פעמים את המשקל הרטוב של הרקמה ו triturate את הרקמה עד שהוא הומוגני. מחממים את ההומוגנט הזה במשך 15 דקות עד 75 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את החלבון ואז עושים צנטריפוגה של הדגימה ומעבירים את הסופר-נטנט לצינור חדש. מדגם זה יכול להיות מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, עבור אלקילציה לדלל את הדגימה ההומוגנית פעמיים עד שלוש במאגר מלח פוספט המכיל מעכב פרוטאז ללא EDTA. לאחר מכן מוסיפים יודואצטמיד טרי לריכוז סופי של 20 מילימולים. השאירו את הדגימה למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך.

חזור על תוספת היודואצטמיד ושלבי הדגירה פעמיים. הכן את העמודה בהתאם להוראות היצרן על ידי מערבולת ראשונה של העמודות. לאחר מכן הסרת המכסה חותך את החלק התחתון וצנטריפוגה אותם.

לאחר מכן, בצע חילופי חיץ על-ידי שיווי משקל תחילה של עמודות חילופי המאגר באמצעות מאגר חילופי הכימיה של הלחיצה ולאחר מכן החלפת כל הדגימות האלקיליות. כדי להעריך את שילוב azidonorleucine לקחת 40 microliters של הדגימה רמז ולהוסיף חיץ מלח פוספט לנפח הסופי של 120 microliters. לאחר מכן הגדר את תגובת הכימיה של הקליק על ידי מערבולת התגובה למשך 20 שניות.

לאחר הוספת כל מגיב בסדר המצוין מהר ככל האפשר, לדגור את הדגימות בחושך בארבע מעלות צלזיוס לילה עם סיבוב רציף. למחרת צנטריפוגה את הדגימות במשך חמש דקות ב 17, 000 פעמים G לאחר צנטריפוגה גלולה מעט טורקיז יהיה גלוי. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש ומאחסנים את הדגימה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

לטיהור חלבון מתויג. הכפיף את כל הדגימות להליך חילופי חיץ כפי שהוכח כדי לנקות שאריות של אלקין חופשי באמצעות חיץ מחייב neutravidin כמאגר שיווי המשקל. לאחר מכן לשטוף את חרוזי neutravidin קיבולת גבוהה שלוש פעמים על ידי ערבוב החרוזים עם מאגר הכריכה.

צנטריפוגה התערובת, להשליך את supernatant ולחזור על זה שלוש פעמים. לאחר מכן הכינו סלורית אחד לאחד על ידי הוספת אותו נפח של חרוזים יבשים של נויטרווידין וחיץ קשירה של נויטרווידין. מניחים בצד 20 עד 40 מיקרוליטרים מכל דגימה כליזט מטוהר מראש ומאחסנים אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר מדידת ריכוז החלבון של הדגימה מערבבים מיליגרם אחד של חלבון עם 40 מיקרוליטר של חרוזים. דגירה של התערובת במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף המאפשר לחלבונים המסומנים להיקשר לחרוזים. ביום המחרת לאסוף את supernatant על ידי צנטריפוגה.

מניחים 20 עד 40 מיקרוליטר אליקוט של הסופרנטנט בצד לניתוח מאוחר יותר ומקפיאים את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החרוזים שלוש פעמים על ידי הוספת חיץ נויטרווידין צונן אחד. שקיעת החרוזים והשלכת הסופר-נטנט.

לאחר מכן מוסיפים את אותו חיץ ומדגרים את החרוזים במשך 10 דקות תחת סיבוב רציף בארבע מעלות צלזיוס לפני השלכת הסופרנטנט. חוזרים על הכביסה עם מאגרי שטיפת נויטרווידין שניים ושלושה, ומחממים את החלבונים שנלחצו על ידי דגירה של החרוזים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עם נפח של מאגר אלוטיון נויטרווידין, המתאים לנפח אחד של החרוזים היבשים המשמשים. במהלך ההדחה, שמרו על החרוזים במתלים בקצב של 1000 סיבובים לדקה בשייקר בלוק תרמי חמקמק פעמיים ושלבו את שני האלוטות.

תגובות הקליק נותחו על ידי דף SDS וכתם חיסוני מערבי. תמונות מייצגות של הניסויים מוצגות למתן אזידונורלאוצין על ידי הזרקה תוך פריטוניאלית ולמתן אזידונורלאוצין באמצעות מי שתייה. ניסוי נוסף מספק דוגמה לקביעת ריכוז האלקין האופטימלי של ביוטין דיסולפיד.

בדוגמה זו, שינוי הקיפול בין הדגימה המסומנת לבין הבקרה הוא הגבוה ביותר בריכוז אלקיין של 14 מיקרומולר. דוגמה לתוצאת ספקטרומטריית מסות עם העשרה ברורה בדגימה המסומנת באזידונורלאוצין בהשוואה לבקרה מוצגת כאן. הבדל זה כבר נראה בכתם החלבון הכולל.

מלבד שינויים בעוצמת הפפטידים ישנם גם חלבונים ייחודיים שנמצאים בשתי הדגימות. זהו פרוטוקול מורכב מבחינה טכנית ויש לעקוב אחריו בזהירות באמצעות אלקילציה נכונה של בקרות שליליות, תקינה (לא ברורה) וניקוי הולם של ארכיון ללא קליקים. הצעדים המרכזיים שלנו בפרוטוקול זה, חלבונים מטוהרים יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה אם מעניין את החוקרים לחקור חלבונים או לטעון אותם לג'ל לחקר חלבונים בעלי עניין על ידי כתם מערבי.

היכולת של שיטה זו לתייג חלבונים ממקור תאי מסוים יש הרבה יישומים כגון מתח של חלבונים או מחקר של סינתזת חלבונים במבחנה או in vivo.