סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

פרוטוקול זה מאפשר כימות של טיפות שומנים ואנליזה של המורפולוגיה וההתפלגות התת-תאית שלהן באופן ספציפי מסוג סיבים. טכניקה זו מאפשרת עיבוד סימולטני של שרירים שונים, חוסך זמן ונמנע מממצאים שעלולים להתרחש כאשר הם מעובדים באופן עצמאי. זה גם מאפשר את האוטומטיזציה של טיפות שומנים כימות.

מיוסטטוזיס הוערך בשרירים ימיים, אך פרוטוקול זה יכול להיות מתורגם לבני אדם בתנאים שונים, כגון השמנת יתר, הזדקנות וסרטן. זיהוי אותם סיבים בחתך מקביל יכול להיות קשה, אך מבנים מדהימים כגון ציוצים באקסון או צירי שרירים הם ציוני דרך טובים שיסייעו לחוקר לאתר את אותם סיבים בשתי השקופיות. כדי להתחיל להניח שני חתכים קפואים סדרתיים של קריו של דגימת השריר על שתי שקופיות הידבקות מסומנות מראש.

שקופית אחת לקביעת סוגי סיבים והשנייה לכימות תכולת השומנים. לזיהוי אימונוהיסטוכימי של סוג סיבי שריר, הקיפו את החלקים בקווי מתאר שצוירו בעט הידרופובי. מניחים אותו בתא לח, ושוטפים עם קר כקרח 0.1 PBS טוחן למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את ה- PBS, הוסף את פתרון החסימה לשקופית, ודגירה למשך 90 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר הסר את תמיסת החסימה ודגרר את השקופיות במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כאשר התמיסה מכילה את הנוגדנים העיקריים. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר.

מוסיפים את התמיסה המכילה את הנוגדנים המשניים ומדגרים את המגלשות בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, לאחר מכן הקפידו להרחיק את המגלשה מהאור ולהמשיך עם שלוש השטיפות ב-PBS במשך חמש דקות כל אחת, ואז לשטוף את המגלשה במים מזוקקים כפולים, לאחר הסרת עודפי המים, להרכיב את המגלשה עם ריאגנט אנטיפיד ולאחסן אותה בארבע מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור. כדי להכתים את טיפת השומנים בבודיפי, הקיפו את חלק השרירים בקווי מתאר שצוירו על ידי עט הידרופובי לפני שטיפתו ב-PBS טוחן קר כקרח 0.1 למשך 10 דקות. שתי השקופיות חייבות להיות מוכתמות בו זמנית.

תקן את הקטע עם פרפורמלדהיד קר של ארבעה אחוזים ללא מתנול במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה מהירה ראשונה שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות. חסום את המגלשה עם 5% נסיוב עזים רגיל ב- PBS למשך שעה אחת בתא האדם.

לאחר מכן דגירה של המגלשה עם התמיסה של הנוגדן העיקרי המורכב מ-2% סרום עיזים תקין ואנטי-למינין של חולדות ב-PBS למשך 90 דקות. לאחר שטיפת שקופיות שלוש פעמים ב- PBS, בצע את הדגירה הבאה עם תמיסת הנוגדן המשנית המכילה נוגדן עזים, אנטי חולדה, אלקסה פלואור 647 ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. ודא שהשקופית מוגנת מפני האור.

לאחר הדגירה לשטוף את המגלשה שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, דגירה את הקטע במשך 20 דקות עם תמיסת דאפי ובודיפי. לאחר שטיפה מהירה, לשטוף שלוש פעמים עם PBS, ופעם אחת עם מים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן להסיר את עודפי המים ולהרכיב את החלק עם מגיב anti-דהייה.

לאחר סריקת השריר, העלה את התמונות הדיגיטליות שנלכדו לכל תוכנת עיבוד תמונה לשחזור. בהתבסס על מורפולוגיית הסיבים וההיסטולוגיה של קטע השרירים, שמור את התמונה בפורמט מתאים עם כל הערוצים ממוזגים. עבור תצפית ורכישה של תמונה בודיפית, קבעו את הפרמטרים למיקרוסקופ קונפוקלי, עם עדשה אובייקטיבית של טבילת שמן 40X וצמצם מספרי של 1.4, כמתואר בכתב היד.

כדי למנוע הצלבה בין bodipy ו 558, 568, ו laminin Alexa fluor 647; השתמש במצב סריקה רציפה בתוכנת confocal. נרגש בודיפי ו-493, 503 באמצעות קו לייזר 488 ננומטר או קו לייזר ארגון, והלהיב את בודיפי ו-555, 568 באמצעות קו הלייזר של דיודה 561 ננומטר. לבסוף, זהה למינין אלקסה פלואור 647 עם קו לייזר דיודה של 640 ננומטר, בהתאם לצבע שנבחר, קבע את שיעורי הפליטה על 570 עד 650 ננומטר עבור bodipy ו 493, 503.

וב 565 עד 620 ננומטר עבור bodipy ו 558, 568. הגדר את טווח הפליטה עבור למינין על 656 עד 700 ננומטר. לאחר מכן, הגדר את הרווח ואת הרווח הדיגיטלי כראוי כדי למנוע זיהוי פיקסלים רוויים במחוון הטווח.

תקן את אות הרקע על-ידי התאמת ההסטה. כדי לזהות את סוג הסיבים במיקרוסקופ הקונפוקלי, השתמש במחשב נייד שעליו ניתן לבדוק את התמונה של השקופית ששוחזרה בעבר עם זיהוי חיסוני מסוג סיבים. ברגע שקבוצת סיבים מזוהה כראוי לרכוש את התמונה עם תעלות bodipy ו laminin.

פתחו כל תמונה בעזרת יבואן הביופורמציה מפיג'י. מתחת לערימת התצוגה עם אפשרות בחר hyper stack, ולאחר מכן מצב צבע וברירת מחדל. ודא שחלון שינוי קנה המידה האוטומטי נבחר.

השתמש בכלי בחירת היד החופשית כדי לבחור באופן ידני את הסרקולמה של הסיב על בסיס תעלת הלמינין. והקש T על המקלדת כדי להקליט את אזור העניין בחלון ההחזר על ההשקעה. עבור אל החלון הראשי של פיג'י ולחץ על ניתוח והגדר מדידות.

לאחר מכן, באזור הבחירה של חלון הקופץ ובקוטר המוגבה, השאר את התיבות הנותרות ללא סימון ופרמטרים אחרים כפי שהם מופיעים כברירת מחדל. לחץ על מדידה בחלון ההחזר על ההשקעה כדי לקבל את השטח ומינימלי עבור קוטר מוגבה של הסיבים שנבחרו וציין אותם לשימוש מאוחר יותר. חשב את הערך של שישית מהמינימום עבור קוטר מוגבה כדי לתחם את החלק המרכזי של הסיב.

לחץ על חלון ההחזר על ההשקעה, לחץ על הוסף כדי לקבל שכפול של ההחזר על ההשקעה הראשון ובחר את ההחזר השני שמופיע בחלון. בחלון הראשי של פיג'י, לחץ על ערוך, ואז בחר והגדל. כדי להציג את הערך שחושב בעבר עם סימן חיסור לפני המספר ולחץ על אישור.

בחלון ההחזר על ההשקעה, לחץ על הוסף, החזר השקעה שלישי חייב להופיע ולמחוק כדי למחוק את ההחזר על ההשקעה השני. בחלון ההחזר על ההשקעה בחר גם ROIs וגם לחץ על יותר מ- ZOR והוסף, המתן להופעת החזר השקעה שלישי המתאים לפריפריה של הסיבים. אם יש צורך בניתוח מחדש של אותם סיבים, שמור את ה- ROIs על ידי לחיצה על עוד ואז שמור.

בחר את ערוץ bodipy ופתח את כלי הסף על ידי לחיצה על כרטיסיות תמונה, התאמה וסף בחלון הראשי של פיג'י. בחלון הקופץ של הסף הגדר את הערכים ל- 70 ו- 255. לאחר מכן בחר YEN ושיטת שחור ולבן.

לפני לחיצה על רקע כהה. לבסוף לחץ על הכרטיסייה החל. עבור אל החלון הראשי של פיג'י ולחץ על ניתוח והגדר מדידות.

בחלון הקופץ, בחר אזור, שבר שטח והגבל לסף. השאר את התיבות והפרמטרים הנותרים כברירת מחדל. עבור אל חלון ההחזר על ההשקעה ובחר את ההחזר על ההשקעה הראשון.

בחלון הראשי של פיג'י לחץ על ניתוח, ואז נתח את כלי החלקיקים. בחלון החלקיקים שנותחו הגדר את הערכים משניים לאינסוף וסמן את תיבת הפיקסלים. שמור על ערך המעגליות המוגדר כברירת מחדל ובחר סכם לפני שתלחץ על אישור.

כדי לקבל את ערכי המרכז ואת הפריפריה של הסיב, חזור על הבחירה של ההחזר השני והשלישי בכל פעם. לאחר מכן שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על הקובץ ולאחר מכן שמור כמו בחלון הסיכום. כלול את סוג הסיבים בשם הקובץ.

פרוטוקול אימונוהיסטוכימי זה מאפשר זיהוי של עכברים, סיבים חמצוניים איטיים, כמו סוג 1 ו-2A, סיבים גליקוליטיים מהירים, כגון סוג 2X ו-2B, ונוכחותם של סיבים היברידיים. על ידי מדידת השטח והמינימום עבור קוטר מוגבה של סיבי השריר, הוחלה הפחתה תלוית גודל כדי להשיג את האזורים המרכזיים וההיקפיים של כל סיב. מבנים מדהימים של כל מקטע שריר, כגון זרדי אקסון או צירי שרירים הם ציוני דרך טובים שיכולים לסייע באיתור אותם סיבים משני הצדדים.

ההגדרות המתוארות לרכישת צביעת למינין בודיפי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. מותר, הדמיה וניתוח של הגודל, המספר וההתפלגות של טיפות שומנים משלושה עד שישה סיבים בו זמנית. השיטה גם אפשרה כימות של שלושה פרמטרים חשובים, כלומר אחוז שטח הסיבים שנכבש על ידי טיפות השומנים, הצפיפות והגודל הממוצע של טיפות השומנים.

הליך הקפאה לא תקין ואי השגת הטמפרטורה הנכונה של איזופנטן הביאו להיווצרות גביש קרח בתוך סיבי השריר. כאשר המקטעים לא היו מיושרים לרוחב, לא ניתן היה לבצע כימות טיפות שומנים והשוואה בין סיבים, שרירים או בעלי חיים. העיבוד של השקופית השנייה חייב להיעשות בו זמנית עם הראשון.

ייבוש האוויר של המגלשה לאחר ההקפאה במשך 15 דקות יפחית באופן משמעותי את הגודל והמספר של טיפות השומנים. Bodipy יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של טיפות שומנים עם אברונים תת-תאיים אחרים, או ערימת חלבונים עם פלואורסצנציה של ספקטרום אחר, או עם מודלים מהונדסים גנטית של GFP. מיואסטאטוזיס דווחה כגורם פרוגנוסטי גרוע למספר מחלות.

לכן, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה או כדי להעריך את ההשפעה של טיפול.