Name: שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: למד איך לשלב אורגנואידים אנושיים עם טכנולוגיית איברים על שבב ליצירת מודל פיזיולוגי של המעי. שיטה זו מאפשרת חיזוי פרמקוקינטיקה ואינטראקציות בין תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפרופסור מארק דונוביץ' על שסיפק את האורגנואידים שמקורם בביופסיית מעיים ולברט קלייר על תכנון האיורים המדעיים של מודול השבב, הנייד והתרבית. כל שאר האיורים המדעיים נוצרו באמצעות BioRender.

<ol><li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors%3A+An+intra-subject+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li>
<li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+Differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+monolayer%3A+Usefulness+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135(2020).</li>
<li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motility%3A+From+bench+side+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Morgan+%26+Claypool+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).</li>
<li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category%3A+Molecular%2C+cell%2C+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li>
<li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+%CE%B2-Catenin+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li>
<li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li>
<li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li>
<li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li>
<li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A%2C+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li>
<li>Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).</li>
<li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li>
<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
</ol>

גאורי קולקארני, אתנסיה אפוסטולו, לורנה יוארט, קרולינה לוצ'סי ומגדלנה קסנדרה הן עובדות נוכחיות או לשעבר של Emulate Inc. ועשויות להחזיק בהון עצמי. Emulate Inc. היא החברה המייצרת את התקני שבבי האיברים ופרסמה פטנטים רלוונטיים לעבודה האמורה במאמר זה.

השילוב של טכנולוגיית איבר על שבב ואורגנואידים במעיים טומן בחובו הבטחה למידול מדויק של פיזיולוגיה של המעי האנושי ופתופיזיולוגיה. כאן אנו מספקים פרוטוקול פשוט וחזק שלב אחר שלב (המתואר באיור 1) לביסוס שבב המעי המכיל שבב מעיים דק או קולוני שמקורו בביופסיה ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המעיים בתרבית משותפת בהתקן מיקרופלואידי. סימולציה מבוססת שבבים זו של המעי האנושי משלבת זרימה פיזיולוגית, לומינלית וסקולרית ותנועות דמויות פריסטלזיס. בנוסף, אנו מתארים נהלים להערכת תפקודי מעיים קריטיים, כגון חילוף ...

המעי האנושי הוא איבר מורכב ורב משימות המסוגל להתחדשות עצמית. הוא מחולק למעי הדק והגזום. הפונקציה העיקרית של המעי הדק היא לעכל עוד יותר מזון המגיע מהקיבה, לספוג את כל החומרים המזינים ולהעביר את השאריות למעי הגס, המשחזר את המים והאלקטרוליטים. המעי הדק מחולק עוד יותר למספר אזורים נבדלים אנטומית: התריסריון, הג'ג'ונום והאלאום, שכל אחד מהם מותאם לביצוע תפקודים ספציפיים. לדוגמה, התריסריון מסייע בפירוק של הצ'ים (תוכן הקיבה) כדי לאפשר ספיגה נכונה של חומרים מזינים המערבים חלבונים, פחמימות, ויטמינים ומינרלים בג'ג'ונום. חלק פרוקסימלי זה של המעי הדק הוא גם האתר העיקרי של ספיגת תרופות מעיים ומטבוליזם, והוא מאופיין בביטוי גבוה יותר של אנזימים מטבוליזם של תרופות (למשל, CYP3A4) בהשוואה לביטוי שלהם באילאום ובמעי הגס1. בנוסף לתפקידו העיקרי בעיכול וספיגה של חומרים מזינים, המעי מהווה גם מחסום יעיל נגד תוכן לומינלי שעלול להזיק, כגון מיקרואורגניזמים פתוגניים, מטבוליטים מיקרוביאליים, אנטיגנים תזונתיים ורעלנים 2,3. ראוי לציין כי המעי הגס האנושי מאוכלס על ידי מספר רב של מיקרואורגניזמים, הרבה מעבר לזה של סך התאים בגוף האדם, המספקים יתרונות רבים לתזונה, מטבוליזם וחסינות. לכן, שמירה על שלמות המחסום הרירי שנוצר על ידי תאי אפיתל במעיים היא קריטית כדי לאפשר את הקשר הסימביוטי בין המיקרוביוטה של המעי לבין התאים המארחים על ידי הפרדתם הפיזית כדי למנוע הפעלה מיותרת של תאי מערכת החיסון2. בנוסף, מוות מתוכנת של תאי מעיים ממלא תפקיד חיוני כמנגנון הגנה עצמית המונע מתאים נגועים להתמיד או להתרבות – ובכך להפיץ פתוגנים פוטנציאליים3 – בעוד שההתחדשות העצמית המתמשכת של אפיתל המעיים כל ארבעה עד שבעה ימים מפצה על אובדן התא ומבטיחה את שלמות המחסום ואת ההומאוסטזיס של הרקמות. ליקויים בתפקודי המעי המתוארים, כולל ספיגת חומרים מזינים, שלמות מחסום או חוסר איזון במוות מתאי מעיים ובהתחדשות עצמית, עלולים לגרום להתפתחות של מגוון הפרעות במערכת העיכול, כולל תת תזונה ומחלות מעי דלקתיות (IBD)2,3.
בעבר, מודלים של בעלי חיים וקווי תאי מעיים שמקורם בסרטן שימשו לחקר התפקודים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של רקמת המעי האנושית. עם זאת, חששות בולטים יותר ויותר לגבי יכולת התרגום של מחקר בבעלי חיים לבני אדם, שנגרמו על ידי נוכחות של פערים משמעותיים בין שני המינים, הדגישו את הצורך בשיטות חלופיות רלוונטיות לאדם4. קווי תאי המעי החוץ-גופיים הנפוצים כוללים תאי T84, Caco-2 ו-HT29. בעוד שהם מחקים היבטים מסוימים של תפקוד מחסום המעי והובלת הממברנה, הם מאופיינים בביטוי שונה של אנזימים מטבוליזם תרופתי5, קולטני פני השטח ומובילים4. בנוסף, הם חסרים ספציפיות של מקטעי מעיים ואינם מצליחים לשחזר את המורכבות של אפיתל המעי, כאשר כל מודל מכיל רק אחד מתוך חמשת סוגי תאי האפיתל הקיימים במעי6.
לאחרונה, תרביות אורגנואידים במעיים אנושיים שנוצרו מביופסיות טריות של המעי הדק והמעי הגס 7,8 או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC)9 הוצגו כמודלים ניסיוניים חלופיים עם פוטנציאל להשלים, להפחית ואולי להחליף ניסויים בבעלי חיים בעתיד. בעוד שניתן להשיג iPSCs באופן לא פולשני, הקמת אורגנואידים מ- iPSCs דורשת שימוש בפרוטוקולים מורכבים וארוכים (עם מספר שלבים ניסיוניים) ומייצרת תרביות הדומות לרקמות עובריות אנושיות. לעומת זאת, אורגנואידים שמקורם בביופסיה ניתנים להרחבה רבה, מכיוון שהם יכולים למנף את יכולת ההתחדשות האינהרנטית של רקמת המעי וניתן להעבירם ולהפיץ אותם ללא הגבלת זמן במבחנה. חשוב לציין, אורגנואידים שמקורם בביופסיה שומרים על המחלה ועל המאפיינים הספציפיים לאזורי המעיים של הרקמה הראשונית שממנה הם פותחו ומחקים את המגוון התאי של אפיתל המעיים. אורגנואידים יכולים לשמש כאווטארים ספציפיים למטופל במבחנה כדי לפענח את הביולוגיה והפתוגנזה של הפרעות שונות במערכת העיכול ולשפר את הניהול הטיפולי שלהם. אף על פי שאורגנואידים במעיים השיגו מידה מרשימה של פונקציונליות פיזיולוגית, הם עדיין לא מצליחים לשחזר את המורכבות של האיברים המקומיים בשל היעדרם של מרכיבים סטרומליים קריטיים – כולל כלי דם, רקמת חיבור, עצבים היקפיים ותאי מערכת החיסון – כמו גם גירוי מכני. פרמטרים מכניים, כגון זרימה, לחץ גזירה, מתיחה ולחץ, ידועים כמשפיעים על מורפוגנזה של רקמות והומאוסטזיס in vivo והוכחו בעבר כמשפרים את ההבשלה של תאים במבחנה 10,11,12,13. חיסרון חשוב נוסף של מערכות אורגנואידיות הוא חוסר הנגישות של הלומן, ולכן, לצד האפיתלי של האפיתל. זה מציב אתגר לחקר מנגנונים שונים הקשורים לביטוי מקוטב של מובילי יונים ותרופות, אינטראקציות בין מארח למיקרוביום ובדיקות רעילות פרמצבטית. לבסוף, תרביות אורגנואידיות סובלות משונות ניכרת בגודלן, במורפולוגיה ובתפקודן, בשל האופי הסטוכסטי של תהליך הארגון העצמי במבחנה ובחירות גורל התא. לכן, כדי לממש את מלוא הפוטנציאל של אורגנואידים במעיים במודלים של מחלות, סינון תרופות ורפואה רגנרטיבית, יש צורך לחקור אסטרטגיות חדשות המפחיתות את השונות בהתפתחות האורגנואידים, משפרות את הגישה לתא הלומינלי ומשלבות אינטראקציות חסרות בין תאים לתאים.
טכנולוגיית Organ-on-a-Chip הציגה טכניקות רבות לשילוב כוחות מכניים וזרימת נוזלים לתרביות תאי מעיים במבחנה. עם זאת, מכיוון שרוב מחקרי הוכחת ההיתכנות הראשוניים השתמשו בקווי תאים שמקורם בסרטן שלא הציגו מגוון תאי מספיק, הרלוונטיות של מערכות אלה הוטלה בספק. לאחרונה, שילבנו באופן סינרגטי אורגנואידים במעיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי לשלב את התכונות הטובות ביותר של כל גישה במערכת מבחנה אחת 14,15,16. שבבי המעי המתקבלים משחזרים את הארכיטקטורה הרב-תאית של אפיתל המעי, את נוכחותו של ממשק רקמת אפיתל-אנדותל ואת הכוחות המכניים של זרימת נוזלים ומתיחה, ומאפשרים חיקוי של תפקודים ברמת האיברים במבחנה. בנוסף, השימוש באורגנואידים שמקורם ברקמות ראשוניות (אותם ניתן לדגום מאזורים שונים במעי האנושי) כחומר התחלתי מגביר את הרבגוניות של מודל זה, שכן שבבים המייצגים תריסריון אנושי, ג'ג'ונום, איליאום ומעי גס יכולים להיווצר בעקבות הליכי זריעה ותרבית דומים. חשוב לציין, שבבי המעי מאפשרים הערכה בזמן אמת של: שלמות מחסום המעיים; פעילות של גבול המברשת ואנזימי חילוף החומרים של התרופה; ייצור של mucins; הפרשת ציטוקינים; ואינטראקציה של תאי מעיים עם מיקרואורגניזמים פתוגניים וקומנסליים, כפי שהודגם בדו"חות שפורסמו בעבר. יש לציין שכאשר שבבי המעי הוקמו באמצעות אורגנואידים שנוצרו מרקמה של אנשים שונים, מודלים אלה לכדו את השונות הצפויה בין התורמים בתגובות התפקודיות לתרופות וטיפולים שונים. בסך הכל, מיזוג אורגנואידים עם טכנולוגיית Organ-on-a-Chip פותח את הדלת למודלים מתקדמים יותר, מותאמים אישית ורלוונטיים ל-in vivo שיכולים לשפר את הרלוונטיות והדיוק הפיזיולוגיים של הממצאים במבחנה, כמו גם את האקסטרפולציה שלהם לבני אדם. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להקמת שבב המעי ויישומו במחקרים על תפקודים פיזיולוגיים של שני מקטעי המעיים: תריסריון ומעי הגס. ראשית, מתוארות השיטות להערכת הפעילות של האנזים המפרק את התרופה CYP3A4 בשבב התריסריון, כמו גם את האינדוקציה שלו על ידי תרכובות אב-טיפוס כגון ריפאמפיצין וויטמין D3. שנית, השלבים הנדרשים כדי לדגום "מעי דולף" בשבב המעי הגס מתוארים בפרוטוקול, כאשר ההפרעה של מחסום האפיתל מתבצעת באמצעות ציטוקינים סימן היכר המעורבים בפתוגנזה של ה-IBD. בקצרה, אורגנואידים המופקים מביופסיות אנושיות מופצים במבחנה, נתונים לעיכול אנזימטי, ומוכנסים בערוץ העליון של השבב. בנוכחות זלוף רציף עם מדיה מועשרת בגורם גדילה הם מתפתחים למונולייר אפיתל מפגשי עם ארכיטקטורת תלת-ממד ומשטח תא אפיקלי נגיש בקלות. תא השבבים התחתון, "כלי הדם", נזרע עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המבודדים מהמעי הדק או הגס. האפיתל והאנדותל מופרדים על ידי קרום נמתח נקבובי, המאפשר את יחסי הגומלין של פרקרין בין שתי הרקמות, וכאשר הוא נתון לעיוותים מחזוריים, מחקה תנועות דמויות פריסטלזה של המעיים האנושיים. התרבית המשותפת נשמרת בתנאי הזרימה הדינמיים הנוצרים על ידי זלוף לומינלי וכלי דם עם מדיה מתאימה של תרביות תאים. לבסוף, אנו מתארים סוגים רבים של בדיקות וניתוחי נקודות קצה שניתן לבצע ישירות על השבב או מתוך שפכים שנדגמו מתרביות תאים.

<table><tbody><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במעי האנושי</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0.5 תאים M/ml ; המעי הגס השמור בהקפאה</td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במעי האנושי</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0.5 תאים M/ml ;</td></tr><tr><td>אורגנואידים תריסריון אנושיים שמקורם בביופסיה</td> בהקפאה אוניברסיטת <td>ג'ון הופקין</td><td>-</td><td>האורגנואידים סופקו על ידי פרופסור מארק דונוביץ (מספר מועצת הביקורת המוסדית: NA_00038329).</td></tr><tr><td>אורגנואידים אנושיים של המעי הגס שמקורם בביופסיה</td><td>אוניברסיטת ג'ון הופקין</td> <td>-</td> <td>האורגנואידים סופקו על ידי פרופסור מארק דונוביץ (מספר מועצת הביקורת המוסדית: NA_00038329).</td></tr><tr><td>Zo&euml; CM-1 וסחר; &nbsp; מודול תרבות</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>מודול תרבות</td></tr><tr><td>Orb-HM1&trade; &nbsp; מודול רכזת</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>5% CO2, מתיחת ואקום ואספקת חשמל</td></tr><tr><td>Chip-S1&trade; חיקוי שבב נמתח</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td> <td>Organ-Chip</td></tr><tr><td>Pod&Trade; מודולים ניידים</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>מודול נייד</td></tr><tr><td>UV Light Box</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Chip Cradle</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>1 לכל צלחת תרבות מרובעת</td></tr><tr><td>Steriflip&reg;-מסנני HV</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0.45&nbsp; &mu; מ&nbsp; מסנן PVDF</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים מרובעת (120 x 120 מ"מ)VWR</td><td></td> <td>82051-068-כף</td><td></td></tr> <tr><td>יד&nbsp; ואקום&nbsp; אספירטור</td><td>קורנינג</td><td>4930</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>אספירציה&nbsp; פיפטות</td><td>קורנינג / פלקון</td><td>357558</td><td>2 מ"ל, &nbsp; פוליסטירן, בנפרד&nbsp; טיפים עטופים</td></tr><tr><td>לשאיבה</td><td>&nbsp;-</td><td></td><td>סטרילי (אוטוקלב)</td></tr><tr><td>סרולוגי&nbsp; פיפטות</td><td></td><td>&nbsp;-</td><td>2 מ"ל, 5 מ"ל,&nbsp; 10 מ"ל,&nbsp; ו&nbsp; 25 מ"ל&nbsp; אנדוטוקסין נמוך,</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td> סטרילית <td>P20, P200,&nbsp; עמ' 1000&nbsp; ופיפטה רב-ערוצית סטנדרטית</td></tr><tr><td>&nbsp; טיפים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20, P200, &nbsp; ו&nbsp; עמ' 1000.</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים&nbsp;( חלבון&nbsp; LoBind&reg; צינורות)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216; &nbsp; 0030122240</td><td>צינורות 15 מ"ל, 50 מ"ל</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; צינורות&reg; &nbsp; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>צינורות 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת שחורה בעלת דופן</td> <td>-</td><td></td> <td>לניתוח חדירות אפיתל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ (עם מצלמה)</td> <td>-</td><td></td> <td>לשדה בהיר&nbsp; הדמיה</td></tr><tr><td>אמבט מים (או חרוזים)</td> <td>-</td><td></td> <td>הגדר ל- 37&deg; </td></tr><tr><td>C הגדרת ואקום</td><td>&nbsp;-</td><td>-</td><td>מינימום&nbsp; לחץ: -70 kPa</td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>צלוחיות Biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 BD</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>בקבוק תרבית תאים</td></tr><tr><td>Emulate Reagent-1&nbsp;( ER-1)</td> <td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>תמיסת ציפוי שבב</td></tr><tr><td>אמולט ריאגנט-2&nbsp;( ER-2)</td> <td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>פתרון ציפוי שבבים</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS&nbsp; (DPBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>קורנינג</td><td>מים בדרגת תרבית תאים</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא</td><td>93595</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp; אקספרס</td><td>תרמופישר&nbsp; 12604013 מדעי</td><td></td><td>אורגנואידים&nbsp; דיסוציאציה&nbsp; ותאי אנדותל&nbsp; ניתוק&nbsp; פתרון</td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp; מדעי</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>מעיים בינונייםכת ומסחר; מדיום גידול אורגנואיד (אנושי)</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>06010</td><td>גידול אורגנואיד בינוני</td></tr><tr><td>גידול תאי אנדותל בינוני MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>מדיום אנדותל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>סרום</td></tr><tr><td>Primocin&trade; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td><td>חומר אנטי מיקרוביאלי</td></tr><tr><td>Attachment Factor Attachment Factor&trade;</td><td>תמיסת ציפוי</td> <td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td> לבקבוק</tr><tr><td>מטריג'ל - גורם גדילה מופחת</td><td>356231 קרנינג</td><td></td><td>מטריצת קרום בסיס מסיס</td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>רכיב ECM</td></tr> רכיב <tr><td>פיברונקטין</td><td>קורנינג</td><td>356008</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>72304</td><td>תוסף מדיה אורגנואידית</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>תוסף מדיה אורגנואיד</td></tr><tr><td>פתרון שחזור תאים</td><td>קורנינג</td><td>354253</td><td>תמיסת דיסוציאציה מטריצת מבראן במרתף</td></tr><tr><td>אלבומין בקר סרום (BSA)</td> <td>סיגמא</td><td>A9576</td><td>30%,</td></tr><tr><td>תרבית תאים סטרילית כיתה</td><td>קורנינג</td> מים <td>MT25055CV</td><td>סטרילי, מים</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא</td><td>D2650</td><td>ממס</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 מ"ג אבקה</td></tr><tr><td>ריפמפיצין (RIF)</td> <td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>משרה</td></tr><tr><td>CYP טסטוסטרון הידרט</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>CYP מצע</td></tr><tr><td>1,25-דיהירוקסי ויטמין D3 (VD3)</td> <td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>משרה CYP</td></tr><tr><td>אצטוניטריל עם 0.1% (v/v) חומצה פורמית</td><td>סיגמא</td><td>159002</td><td>פתרון עצירת LCMS</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אוקלודין</td><td>ThermoFisher&nbsp; מדעי</td><td>33-1500</td><td>סמן צמתים הדוקים</td></tr><tr><td>אנטי קלודין 4</td><td>ThermoFisher&nbsp; מדעי</td><td>36-4800</td><td>סמן צמתים הדוקים</td></tr><tr><td>אנטי-E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>סמן צמתים נצמדים אפיתל</td></tr><tr><td>אנטי-VE-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>סמן צמתים נצמדים אנדותל</td></tr><tr><td>אנטי-זונולה אוקלודנס 1 (ZO-1)</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>סמן צמתים הדוקים</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>62248</td><td>כתם גרעיני</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink ערכת מיני RNA</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>ערכת ליזה, בידוד וטיהור RNA</td></tr><tr><td>SuperScript&trade; IV VILO&trade; מאסטר מיקס</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>ערכת טרנסקריפטאז הפוך</td></tr><tr><td>TaqMan&trade; Fast Advanced Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444557</td><td>qPCR reagent</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 5 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>בזמן אמת PCR cycler</td></tr><tr><td>18S פריימר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Eukaryotic 18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4 פריימר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Cytochrome&nbsp; משפחה 3 תת-משפחה A חבר 4</td></tr><tr><td>פירס אנד טרייד; Coomassie Plus (ברדפורד) ערכת בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>ערכת כימות חלבון</td></tr><tr><td>MSD Tris lysis</td><td>Buffer Meso Scale Diagnostics</td><td>R60TX-3</td><td>מאגר ליזה של חלבון</td></tr><tr><td>שסוע/כולל Caspase-3 ערכת ליזאט תאים שלמים</td><td>אבחון סולם Meso</td><td>K15140D</td><td>ערכת זיהוי Caspase 3</td></tr><tr><td>V-PLEX פאנל פגיעות כלי דם 2 ערכה אנושית</td><td>אבחון בקנה מידה Meso</td><td>K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX פאנל דלקתי אנושי II (4-Plex)</td> <td>אבחון בקנה מידה מזו</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td> <td>Zeiss-Confocal מיקרוסקופ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td>Zeiss-20X</td><td></td> <td>עדשות אובייקטיביות למרחקים ארוכים</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td> <td>מיקרוסקופ Zeiss-Brightfield</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td></td><td>עדשות אובייקטיביות Zeiss-10X</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

רירית המעי היא מחסום פיזי וביוכימי מורכב הממלא שלל פונקציות חשובות. הוא מאפשר הובלה, ספיגה וחילוף חומרים מטבוליזם של חומרים מזינים וקסנוביוטיקה תוך שהוא מקל על קשר סימביוטי עם מיקרוביוטה ומגביל את הפלישה של מיקרואורגניזמים. אינטראקציה תפקודית בין סוגי תאים שונים לבין סביבתם הפיזית והביוכימית חיונית לביסוס ושמירה על הומאוסטזיס של רקמת מעיים. מידול האינטראקציות המורכבות הללו ופיזיולוגיה משולבת של המעיים במבחנה הוא מטרה אימתנית עם פוטנציאל לשנות את הדרך שבה מטרות טיפוליות חדשות ומועמדים לתרופות מתגלים ומתפתחים.
אורגנואידים וטכנולוגיות איבר על שבב שולבו לאחרונה כדי ליצור שבבי מעי רלוונטיים לבני אדם המתאימים לחקר ההיבטים הפונקציונליים של פיזיולוגיה של המעי ופתופיזיולוגיה של המעי במבחנה. אורגנואידים המופקים מהביופסיות של המעי הקטן (תריסריון) והמעי הגס נזרעים לתוך התא העליון של שבב איברים ולאחר מכן מתרחבים בהצלחה כחד-שכבתיים תוך שמירה על המאפיינים התאיים, המולקולריים והתפקודיים המובהקים של כל אזור מעיים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ספציפיים לרקמת המעי האנושי משולבים בתא התחתון של שבב האיבר כדי ליצור מחדש את ממשק האפיתל-אנדותל. פלטפורמה חדשנית זו מאפשרת חשיפה לומינלית לחומרים מזינים, תרופות ומיקרואורגניזמים, ומאפשרת מחקרים על הובלת מעיים, חדירות ואינטראקציות בין חיידקים מארחים.
כאן, פרוטוקול מפורט מסופק להקמת שבבי מעי המייצגים את התריסריון האנושי (שבב התריסריון) ואת המעי הגס (שבב המעי הגס), ואת התרבית הבאה שלהם תחת זרימה רציפה ועיוותים דמויי פריסטלזה. אנו מדגימים שיטות להערכת חילוף החומרים של תרופות ואינדוקציה של CYP3A4 בשבב התריסריון באמצעות משרי אב-טיפוס ומצעים. לבסוף, אנו מספקים הליך שלב אחר שלב למידול חוץ גופי של הפרעת מחסום בתיווך אינטרפרון (IFNγ) (תסמונת המעי הדולף) בשבב המעי הגס, כולל שיטות להערכת השינוי של חדירות פרה-תאית, שינויים בהפרשת ציטוקינים ופרופיל תעתיק של התאים בתוך השבב.

איור 1D מסכם את ציר הזמן של תרבית שבבי המעי וממחיש את תאי האנדותל והאורגנואידים במעיים לפני ואחרי הזריעה על השבב. יתר על כן, הוא מדגים את ההבדלים המורפולוגיים המובהקים בין התריסריון לבין שבבי המעי הגס, המודגשים על ידי נוכחותן של התצורות דמויות הווילי בשבב התריסריון ומייצגות את ארכיטקטורת המעי הדק.
איור 3A,B מדגים את תגובות האינדוקציה של CYP3A4 בשבב התריסריון משלושה תורמים אורגנואידים שונים. השבבים נחשפו ל-20 μM RIF או...

אורגנואידים במעיים שמקורם בביופסיה וטכנולוגיות של איברים על שבבים משולבים בפלטפורמה מיקרופיזיולוגית כדי לשחזר את פונקציונליות המעי הספציפית לאזור.

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש באורגנואידים שמקורם בביופסיה ובטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור שבב מעי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לחזות פרמקוקינטיקה ואינטראקציה בין תרופות ותרופות ולחקור תפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים. איחוד אורגנואידים בטכנולוגיית איבר על שבב מאפשרים לנו לשחזר את המורכבות של אפיתל המעי. בנוסף, הוא מאפשר שליטה ניסיונית רבה יותר ברמזים המכניים, בהתפלגות הזרימה ובשיפועים הביוכימיים.שיטה זו מחקה את הפיזיולוגיה המורכבת של המעי האנושי, ומעניקה הבנה טובה יותר של הבסיס התאי והמולקולרי של תפקודי מעיים תקינים ופתולוגיים. זה עוזר לחזות טוב יותר פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה ומועמדים פוטנציאליים לתרופות כדי למנוע נזק דלקתי. זריעה היא שלב קריטי בפרוטוקול.פיצול מוגזם או צפיפות זריעה לא מדויקת של שברי האורגנואיד במעיים עלולים לפגוע בהתפתחות ובהבחנה של מחסום האפיתל. כדי להתחיל, לשאוף את המדיום מן התרבות האורגנואידית הסטטית. לשחזר מדיה ממספיק בארות כדי להשיג צפיפות זריעה סופית של שמונה מיליון תאים למיליליטר.הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת דיסוציאציה של BMM קר כקרח לכל באר וחברו את ה-BMM המסולסל מפני השטח של הבאר. לאסוף את ההשעיה לתוך צינור קשירה חלבון נמוך 15 מיליליטר ומניחים אותו על קרח. יש לנער בעדינות את השפופרת כל 15 דקות למשך שעה.צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל גלולה אורגנואידית. אם שכבת ג'ל שקופה נצפתה מעל הכדור, לשאוף פתרון מן הצינור. השהה את הכדור והוסף נפח שווה של תמיסת דיסוציאציה BMM.לדגור על קרח במשך 10 דקות צנטריפוגה. יש לחזור על הפעולה עד שלא יהיו שאריות BMM מסיסות. לאחר מכן להשליך את supernatant ולתלות מחדש את הכדור בשני מיליליטר של תמיסת עיכול אורגנואידים.דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שלוש דקות והוסיפו שמונה מיליליטר של DMEM F12 מתקדם כדי לעצור את התגובה האנזימטית. צנטריפוגה והחייאת הכדור במדיום גידול אורגנואידי שלם כדי להשיג שמונה מיליון תאים למיליליטר. Aliquot 360 microliters בצינורות סטריליים 1.5 מיליליטר נמוך חלבון קשירה.לאחר מכן, להסיר את המדיום מן הערוץ העליון של שבבים מצופים ולהוסיף 30 microliters של ההשעיה התא. דגירה של השבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה כדי להדביק את שברי האורגנואידים לממברנה. הוסף שלושה מיליליטרים של מדיום גדילה אורגנואידי שלם טרום שיווי משקל למאגר הכניסה העליון ושלושה מיליליטרים של מדיום צמיחת תאי אנדותל טרום שיווי משקל במאגר הכניסה התחתון.הוסף 300 מיקרוליטרים של אותה מדיה במאגרי היציאה העליונים והתחתונים בהתאמה. העבר את המגש הנושא את המודולים הניידים למודול התרבית. על מודול התרבית, הפעל שוב ושוב את מחזור הפריים עד שייווצרו טיפות מספיקות לחיבור מוצלח של השבבים.לאחר מכן החלק את נושאת השבבים לתוך המודול הנייד. לאחר מכן התחל את מחזור הוויסות בן השעתיים כדי ללחוץ על מדיית התרבות במודול הנייד ובשבב ולאחר מכן התנאים המתוכנתים יתחדשו. לאחר מכן, שנה את הגדרות המתיחה והפעל את מודול התרבות.לאחר 24 שעות, חזור על המחזור עם 10% מתיחה ואת אותו תדירות. כדי להכין מדיית מינון או בקרת רכב, דלל את פתרונות מלאי ה-CYP או DMSO במדיום גדילה אורגנואידי שלם ובמדיום צמיחת תאי אנדותל. השהה את מודול התרבית והבא את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית.החלף את המדיה בכל מאגרי הכניסה והיציאה בשני מיליליטר של מדיית מינון עם משרנים או בקרת רכב. החזר את המודולים הניידים בחזרה למודול התרבית והפעל מחדש את הזרימה במהירות של 30 מיקרוליטר לשעה. החלף את המדיה בתמיסת השראה טרייה כל 24 שעות והמשך את התרבות במשך 48 עד 72 שעות.לאחר מכן הביאו את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית ושאפו את מדיום המינון מכל המאגרים. יש לשטוף ולהחליף את מאגר הכניסה העליון במדיום DMEM F12 מתקדם וחם ואת המאגר התחתון במדיום צמיחת תאי אנדותל. החלף את מדיום הכביסה במיליליטר אחד של תמיסת מצע בדיקה.למזג את השבבים בקצב זרימה גבוה של 1, 000 microliters לשעה במשך חמש דקות ולשאוף הן מאגרי מוצא העליון והתחתון. החזירו את השבבים למודול התרבית ודגרו במשך שעה אחת תחת זרימה קבועה של 300 מיקרוליטר לשעה. לאחר שעה של טיפול, עצרו את הזרימה והביאו את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית.אספו 100 מיקרוליטרים של שפכים ממאגר היציאה העליון והוסיפו אותם לצינור המכיל 200 מיקרוליטרים של תמיסת עצירה. מניחים את הצינורות מיד על קרח יבש ומאחסנים את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לשטוף את שני הערוצים עם 200 microliters של DPBS סטרילי.לאחר מכן חסום את שקע הערוץ התחתון עם קצה פיפטה מסנן של 200 מיקרוליטר. מחלחלים 50 מיקרוליטרים של תמיסת הדיסוציאציה דרך התעלה התחתונה ודוגרים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. ודא ניתוק מלא של תאי האנדותל ולהסיר את פתרון הדיסוציאציה מן הערוץ על ידי פיפטינג.יש לחזור על הכביסה. לאחר מכן, לחסום את מוצא הערוץ העליון ו perfuse 75 microliters של חלבון lysis buffer. משאירים את קצה הפיפטה מוכנס ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאסוף את התא lysates בצינור 1.5 מיליליטר על ידי pipetting חמש עד 10 פעמים. חזור על זילוף ואיסוף כדי לקבל ניתוק מלא של תאים ולאחסן את הליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הניתוח. עבור תזה של RNA, בצע את אותו הליך תוך שימוש ב-150 מיקרוליטרים של מאגר RNA lysis.ראשית, הכינו תמיסת מינון אינטרפרון גמא על ידי דילול תמיסות המלאי במדיום צמיחת תאי אנדותל ללא גז. בארון biosafety, הסר את המדיום ממאגרי הכניסה בתעלה התחתונה והחלף אותו בשלושה מיליליטר של תמיסת המינון היומית. לאחר מכן מכניסים את המגשים למודול התרבות ומכניסים את השבבים בקצב זרימה גבוה של 1, 000 מיקרוליטר לשעה למשך חמש דקות.החלף את קצב הזרימה ל -60 מיקרוליטר לשעה והמשך את התרבית הנוזלית. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של DPBS לכל באר לצלחת בעלת דופן שחורה של 96 בארות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של הקולחים מכל המאגרים לבארות המתאימות.כדי להכין עקומה סטנדרטית, בצע דילול פי שלושה של המדיום המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של שלושה קילודלטון דקסטרן מפל כחול ב- DPBS. לאחר מכן בצע הזיות סדרתיות באמצעות דילול משולש של מדיום צמיחת תאי אנדותל ב- DPBS. מאפיינים מורפולוגיים מובהקים של שבבי התריסריון והמעי הגס הודגשו על ידי נוכחותן של תצורות דמויות וילי בשבב התריסריון המייצגות את הארכיטקטורה של המעי הדק.בשבב התריסריון שנחשף לציטוכרום P450 משרה rifampicin וויטמין D3, היה ביטוי גבוה של גנים mRNA עבור התרופה מטבוליזם אנזים ציטוכרום P450 3A4 ופעילות קטליטית משופרת של אנזים ציטוכרום P450, מה שמצביע על תגובות אינדוקציה מתאימות בין כל שלושת התורמים האורגנואידים. לאחר טיפול מונולאייר אפיתל של שבב המעי הגס עם אינטרפרון גמא, מורפולוגיה התא נפגע ואובדן אפיתל columnar נצפו. כמו כן, הטיפול באינטרפרון גמא הוביל לאות ציטופלסמי מוגבר של חלבוני צומת הדוקים ודבקים בהשוואה לבקרת הרכב, והראה תזוזה של סמני צומת הדוקים ZO-1 וקלודין 4 והפנמה של occludin ו- E-cadherin.עלייה משמעותית בחדירות הפארא-תאית האפיתליאלית נצפתה לאחר 48 שעות של גירוי אינטרפרון גמא על שבבי המעי הגס. באופן דומה, אינטרפרון גמא משרה הפעלה של אפופטוזיס המצוין על ידי עלייה בתכולה התוך תאית של Caspase 3 נבקע. אינטרפרון גמא גרם להפרשה מקוטבת של מולקולות מעודדות דלקת בשבב המעי הגס כפי שמוצג על ידי ההפרשה הבזולטרלית של VCAM-1 ואינטרלוקין-6 וההפרשה האפיקלית של ICAM-1 וחלבון עמילואיד בסרום A.לתרבית שבבי מעיים מוצלחת, יש להשתמש באורגנואידים לא מובחנים ולעקוב אחר הוראות הפיצול וצפיפות הזריעה.לאחר התבססות מוצלחת של שבב המעי, אנו יכולים לחקור את הספיגה, ההובלה והמטבוליזם במעיים, רמות חומרי מזון והפרשת הורמוני מעיים, אינטראקציות בין פתוגנים של חיידקים מארחים, בטיחות ויעילות של תרופות, מנגנוני מחלה ספציפיים למטופל ותגובות לטיפולים.

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

neuroHuMiX הוא מודל מעיים על שבב מתקדם לחקר האינטראקציות של תאים חיידקיים, אפיתליאליים ועצביים בתנאי תרבית משותפת פרוקסימלית ומייצגת. מודל זה מאפשר לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקשורת בין מיקרוביום המעי למערכת העצבים.

מודל מעיים-על-שבב לחקר ציר המיקרוביום-מערכת העצבים של המעי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

שילוב של אורגנואידים במעי הכלבי ומערכת מיקרופלואידית של מעיים על שבב מציע מודלים תרגומיים רלוונטיים למחלות מעיים אנושיות. הפרוטוקולים שהוצגו מאפשרים מורפוגנזה תלת-ממדית ומידול דינמי במבחנה של המעי, ומסייעים בפיתוח טיפולים יעילים למחלות מעיים בכלבים ובבני אדם עם One Health.

מורפוגנזה תלת ממדית במעי על שבב של כלבים באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם במחלות מעי דלקתיות

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

מודל מעי-על-שבב חיסוני לניתוח תגובות חיסוניות של רירית המעי

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

יש לעצב אורגנואידים במעי האנושי כדי לסכם טוב יותר את המבנה והתפקוד של המעי האנושי הילידי. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לשילוב מערכת עצבים מעי במבנים אלה.

עצבנות של אורגנואידים במעי האנושי

למד איך לשלב אורגנואידים אנושיים עם טכנולוגיית איברים על שבב ליצירת מודל פיזיולוגי של המעי. שיטה זו מאפשרת חיזוי פרמקוקינטיקה ואינטראקציות בין תרופות.

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

גלה סרטונים נוספים