Name: רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: חקור את תפקידו של הנתרן כמסר שני בדיפרנציאציה של בריכות אוביקווינול במיטוכונדריה. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה למדידת העברת אלקטרונים בלי צורך במודלים תאיים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ר. מרטינז-דה-מנה, מ. מ. מוניוז-הרננדז, א., ד"ר ק. חימנז וא.ר. מרטינז-חימנז על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ו- HFSP (RGP0016/2018). ה- CNIC נתמך על ידי המכון דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII), השרים דה סיינסיה, Innovación y Universidades (MCNU) וקרן Pro CNIC והוא מרכז המצוינות של סברו אוצ'ואה (SEV-2015-0505). איור 2 נוצר עם BioRender.com.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בעקבות המדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של ה- Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), ספרד, בהתאם לדירקטיבת האיחוד האירופי מיום 22 בספטמבר 2010 (2010/63/UE) ועם הצו המלכותי הספרדי מיום 1 בפברואר 2013 (53/2013). כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר בעלי החיים שבהם נעשה שימוש ואת הסבל שלהם.
הערה: בדיקה השוואתית זו לחקר הפילוח של בריכות CoQ מיטוכונדריאליות מתוארת באופן הבא:
1. כימות חלבונים
<ol><li>להקפיא ולהפשיר את המיטוכונדריה26 המבודדת מכבד עכברים מסוג פרא שלוש פעמים (כלומר, ממברנות מיטוכונדריאליות) לפני הניסוי כדי להפוך את האברונים לחדירים למצעי התגובה.</li>
	<li>לכמת את כמות החלבון של דגימת המיטוכונדריה המבודדת בשיטות ברדפורד או חומצה ביצ'ינצ'ונינית (BCA). במקרה של ברדפורד, הוסף 2 μL של דגימה לתוך 1 מ"ל של 1x מגיב ברדפורד.</li>
	<li>לפצל את המדגם לארבע תת-דגימות של 20 מיקרוגרם כל אחת (כלומר: A, B, C, D; איור 2א).</li>
</ol>2. מדידת פעילות CI+CIII
הערה: חלק זה של הפרוטוקול משתמש בדוגמאות A ו-B כדי למדוד פעילות CI+CIII (איור 2B).
<ol><li>פיצול דגימות A ו-B לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת (כלומר A1, A2, B1 ו-B2). ערבבו כל אחת מתת-הדגימות ב-cuvette של 1 מ"ל עם 30 μL של ציצי c (10 מ"ג/מ"ל), 10 μL של 100 mM malonate, והוסיפו חיץ C1/C2 שחומם מראש (טבלה 1) ב-37 °C עד 980 μL (979 μL עבור cuvettes A2 ו-B2). אזהרה: שלב זה כולל שימוש בריאגנטים הרעילים מלונט ואשלגן ציאניד. הערה: יש להכין ציצי c (10 מ"ג/מ"ל) טרי על ידי ערבוב של 10 מ"ג ציט c ב-1 מ"ל של תמיסת 10 mM K2HPO4 , pH מותאם ל-7.2, ויש לשמור עליו בקרח לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>הוסף 10 μL של 1 M KCl ב- cuvettes A1 ו- A2, והוסף 10 μL של 1 M NaCl ב- cuvettes B1 ו- B2.</li>
	<li>הוסף 1 μL של 1 mM רוטנון לתוך cuvette המכיל תת-דגימות A2 ו- B2. אזהרה: שלב זה כרוך בשימוש ברוטנון המגיב הרעיל.</li>
	<li>ממש לפני המדידה, הוסף 10 μL של NADH (10 mM) לתוך כל cuvettes. הערה: עדיף להוסיף את ה-10 μL על המדרגה של ה-cuvette, כך שהתגובה תתחיל בערבוב.</li>
	<li>ערבבו את הקובט על ידי היפוך זהיר שלה שלוש פעמים. מקם אותו בקורא הקובטים לספיגה (ספקטרופוטומטר UV/VISJASCO).</li>
	<li>לחץ על מדידת פרמטרים > > כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל: 550 ננומטר, וזמן: 4 דקות קריאה; לחץ על הלחצנים קבל והתחל כדי להתחיל בניסוי.</li>
	<li>בסוף המדידה, שמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם. ניתן גם לאסוף את השיפוע באופן ידני.</li>
</ol>3. מדידת פעילות CII+CIII
הערה: חלק זה של הפרוטוקול משתמש בדוגמאות C ו-D כדי למדוד פעילות CII+CIII (איור 2C).
<ol><li>פיצול דגימות C ו-D לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת (כלומר C1, C2, D1 ו-D2). מערבבים כל אחת מתת-הדגימות ב-cuvette של 1 מ"ל עם 30 μL של ציצי c (10 מ"ג/מ"ל), 1 μL של 1 mM רוטנון, ומוסיפים מאגר C1/C2 שחומם מראש ב-37 °C עד 980 μL (970 μL עבור cuvettes C2 ו-D2). אזהרה: שלב זה כולל שימוש בריאגנטים הרעילים אשלגן ציאניד ורוטנון. הערה: יש להכין ציצי c (10 מ"ג/מ"ל) טרי על ידי ערבוב של 10 מ"ג ציט c ב-1 מ"ל של תמיסת 10 mM K2HPO4 , pH מותאם ל-7.2, ויש לשמור עליו בקרח לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>הוסף 10 μL של 1 M KCl ב- cuvettes C1 ו- C2, והוסף 10 μL של 1 M NaCl ב- cuvettes D1 ו- D2.</li>
	<li>הוסף 1 μL של 1 mM אנטימיצין A לתוך cuvette המכיל תת-דגימות C2 ו- D2. אזהרה: שלב זה כרוך בשימוש באנטימיצין ריאגנט רעיל A.</li>
	<li>ממש לפני המדידה, הוסיפו 10 μL של סוקסינט (1 M) לכל הקובטות. הערה: עדיף להוסיף את ה-10 μL על המדרגה של ה-cuvette, כך שהתגובה תתחיל בערבוב.</li>
	<li>מערבבים את הקובט בזהירות, הופכים אותו שלוש פעמים. מקם אותו בקורא קובט הספיגה (ספקטרופוטומטר UV/VIS).</li>
	<li>לחץ על מדידת פרמטרים > > כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל: 550 ננומטר, וזמן: 4 דקות של קריאה; לחץ על הלחצנים קבל והתחל כדי להתחיל בניסוי.</li>
	<li>בסוף המדידה, שמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם. ניתן גם לאסוף את השיפוע באופן ידני.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

למרות שפרוטוקול זה מייצג הליך פשוט מאוד לזיהוי קיומם של מאגרי CoQ המפולחים חלקית, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון. מצעים (כלומר, NADH או succinate) רצוי להוסיף אחרון מאז חמצון אוטומטי של תרכובות אלה עשוי להתרחש. ההיפוך של קובט חייב להיות זהיר על מנת למנוע היווצרות של בועות שעלולות להפריע לקריאה.
בנוסף, הטכניקה הנוכחית מציגה כמה מגבלות שראוי להזכיר. המדידות אינן מבוצעות במיטוכונדריה שלמה. לפיכך, התוכן המלאכותי ושיעורו של המאגר עשויים לגרום להבדלים עם הסביבה הטבעית של המיטוכונדריה. ריא...

מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) היא המסלול העיקרי המניע סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP), ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וצריכת מקבילות מפחיתות, כגון ניקוטין אדנין דינוקלאוטיד (NADH) או סוקסינט, על ידי מיטוכונדריה. מערכת OXPHOS מורכבת מחמישה קומפלקסים של חלבונים: קומפלקס I (CI) מחמצן את NADH ומפחית את ה-CoQ ליוביקינול (CoQH2). קומפלקס II (CII) מחמצן את הסוקסינט לפומאראט ומפחית את ה-CoQQ ל-CoQH2. קומפלקס III (CIII) מחמצן את CoQH2 בחזרה ל-CoQ, ומפחית ציטוכרום c (cyt c). לבסוף, IV מורכב (CIV) מחמצן את cyt c ומפחית את החמצן למים. שרשרת אוקסידורדוקציה זו, מה שמכונה שרשרת הובלת האלקטרונים (mETC), מצומדת לשאיבה של H+ לרוחב ה-IMM, מה שיוצר גרדיאנט אלקטרוכימי המשמש את V (CV) המורכב כדי לזרחן אדנוזין דיפוספט (ADP) ל-ATP.
קומפלקסים של mETC יכולים להיות לבדם ב-IMM או להתאסף למבנים רבעוניים הנקראים סופר-קומפלקסים. CIV יכול להרכיב עם CIII, וליצור את III2+IV או Q-respirasome (כפי שהוא מסוגל לנשום בנוכחות CoQH2)1,2,3 או יצירת הומודימרים או הומוליגומרים4. CIII יכול לקיים אינטראקציה עם CI, ויוצר את הסופר-קומפלקס I+III25. לבסוף, CI מסוגל גם לקיים אינטראקציה עם Q-respirasome, ובונה את I+III2+IV או N-respirasome (כפי שהוא יכול לנשום לצרוך NADH)1,6,7,7,8,9,10.
CoQ ו-cyt c הם נושאי אלקטרונים ניידים האחראים על העברת אלקטרונים מ-CI/CII ל-CIII, ומ-CIII ל-CIV, בהתאמה. השאלה אם סוכני-על מטילים מגבלה מקומית פונקציונלית על נשאים אלה הייתה נושא לוויכוח עז בשני העשורים האחרוניםעל 2,7,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, מספר קבוצות עצמאיות הוכיחו כי ניתן לפלח את CoQ ו- cyt c באופן פונקציונלי לבריכות ב- IMM. לגבי ה-CoQ, ניתן לפלח אותו באופן פונקציונלי למאגר CoQ ספציפי עבור CI (CoQNAD) ומאגר נוסף המוקדש לאנזימים תלויי FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. עם זאת, על מנת להבדיל בין קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, נדרש ביטוי יתר של האוקסידאז החלופי (AOX) ויצירת מוטנטים ספציפיים של mtDNA, שיכולים להרכיב CI בהיעדר CIII, 1,19,20.
המנגנון של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך היפוקסיה לא היה ידוע עד לאחרונה. בהיפוקסיה חריפה, CI עובר את המעבר הפעיל/דה-אקטיבי (A/D), הכרוך בירידה בפעילות האוקסידורדוקטאז של NADH-CoQ השואבת את ה-H+ . ירידה כזו בשאיבת H+ מחמצצת את המטריצה המיטוכונדרית וממיסה חלקית את משקעי הסידן-פוספט במטריצה המיטוכונדרית, ומשחררת Ca2+ מסיס. עלייה זו ב-Ca2+ המסיס מפעילה את מחליף Na+/Ca2+ (NCLX), אשר מוציא את Ca2+ בתמורה ל-Na+. הגברת Na+ המיטוכונדרית מתקשרת עם פוספוליפידים בצד הפנימי של ה-IMM, מפחיתה את הנזילות שלה ואת העברת ה-CoQ שלו בין CII ל-CIII, ולבסוף מייצרת אניון סופראוקסיד, אות חמצון-חיזור21. באופן מעניין, העברת CoQ רק פחתה בין CII ל-CIII, אך לא בין CI ל-CIII, מה שמדגיש כי 1) Na+ הצליחה לווסת רק אחת מבריכות ה-CoQ הקיימות במיטוכונדריה; 2) קיימות בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM. לפיכך, פרוטוקול בשימוש נרחב לחקר פעילויות אנזים מיטוכונדריאלי יכול לשמש כדי להעריך את קיומם של בריכות CoQ שהוזכרו.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על מדידת הפחתה של ציט c מחומצן, המצע של CIII, על ידי ספיגה בנוכחות סוקסינט (כלומר, מצע CII) או NADH (כלומר, מצע CI). אותה דגימה מחולקת לשניים, שאחד מהם יטופל ב- KCl, והשני עם אותו ריכוז של NaCl. בדרך זו, בהתחשב בכך ש-Na+ מקטין את נזילות ה-IMM, אם CoQ היה קיים במאגר ייחודי ב-IMM, גם CI+CIII וגם CII+CIII היו יורדים בנוכחות Na+. עם זאת, אם CoQ היה קיים במאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, ההשפעה של Na+ הייתה ניכרת בעיקר (או רק) על פעילות CII+CIII, אך לא על CI+CIII. כפי שפורסם לאחרונה21, Na+ משפיע רק על העברת ה-CoQ בין CII ל-CIII (איור 1C,D), אך לא בין CI ל-CIII (איור 1A,B).
פרוטוקול זה, יחד עם שפע של טכניקות, שימשו כדי לאשר את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית ב-IMM, אחד המוקדש ל-CI (כלומר, CoQNAD), ואחר המוקדש לאנזימים הקשורים ל-FAD (כלומר, CoQFAD)1,3,7; תצפית שלמרות שהיא ממשיכה להתווכח22, אומתה באופן עצמאי על ידי כמה קבוצות 7,19. לפיכך, הרכבת העל של CI לתוך פלקסים סופר-קומפלקסים משפיעה על הניידות המקומית של CoQ, ומקלה על השימוש בו על ידי ה-CIII בתוך הסופר-קומפלקס 1,7,13,14,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>אנטימיצין A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td>בדיקת חלבון <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>ברדפורד</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכרום c מלב סוסים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מלונית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ציאניד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Manager תוכנה</td><td>JASCO</td><td>גרסה 2</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>UV / VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-na+ חושפת בריכות coq פונקציונליות מפולחות חלקית

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

בריכות יוביקינון (CoQ) בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי (IMM) מחולקות באופן חלקי לאנזימים מורכבים התלויים ב-I או ב-FAD. ניתן להעריך תת-חלוקה כזו בקלות על ידי בדיקה השוואתית באמצעות NADH או סוקסינט כתורמי אלקטרונים במיטוכונדריה מופשרת קפואה, שבה נמדדת הפחתת ציטוכרום c (cyt c). הבדיקה מסתמכת על ההשפעה של Na+ על ה-IMM, ומפחיתה את הנזילות שלו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות NADH-cyt c oxidoreductase ופעילויות succinate-cyt c oxidoreductase בנוכחות NaCl או KCl. התגובות, המסתמכות על תערובת של ריאגנטים בקובט באופן מדורג, נמדדות באופן ספקטרופוטומטרי במהלך 4 דקות בנוכחות Na+ או K+. אותה תערובת מבוצעת במקביל בנוכחות מעכבי האנזים הספציפיים על מנת להפחית את השינוי הלא ספציפי בספיגה. פעילות NADH-cyt c oxidoreductase אינה פוחתת בנוכחות אף אחד מהקטיונים הללו. עם זאת, פעילות succinate-cyt c oxidoreductase פוחתת בנוכחות NaCl. ניסוי פשוט זה מדגיש: 1) את ההשפעה של Na+ בהפחתת נזילות IMM והעברת CoQ; 2) כי סופר-קומפלקס I+III2 מגן על העברת יוביקינון (CoQ) מפני השפעה על ידי הורדת נזילות IMM; 3) כי העברת CoQ בין CI ל- CIII שונה מבחינה פונקציונלית מהעברת CoQ בין CII ל- CIII. עובדות אלה תומכות בקיומן של בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM ומראות כי ניתן לווסת אותן על ידי סביבת Na+ המשתנה של המיטוכונדריה.

תוצאות אופייניות מפרוטוקול זה מיוצגות להלן (איור 3). מכיוון שספיגת ציט c מופחתת מתמקמת ב-550 ננומטר, כל תת-הדגימות ללא מעצורים חייבות להראות עלייה בספיגה ב-550 ננומטר. תת-דגימות מעוכבות מראות באופן אידיאלי שיפוע שטוח או מעט עולה (איור 3). יש להחסיר מדרונות מתת-דגימות מעוכבות מתת-דגימות חסרות מעצורים.
לדגימות A ו-B, שתיהן מתוקנות על ידי עיכוב הכתב שלהן והן מייצגות את פעילות NADH:cyt c oxidoreductase, יש שיפוע דומה (<strong class="xfig"...

פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

פרוטוקול זה מדגיש את תפקידו של הנתרן כשליח שני ומראה גם את קיומן של בריכות יוביקווינול מובחנות חלקית. טכניקה זו מדגימה גישה פשוטה ביותר לחקר מאגרי יוביקווינול אשר אחרת דורשת מודלים ספציפיים מאוד של תאים. גישה זו עשויה לשמש לחקר העברת אלקטרונים בממברנות אחרות, במיוחד של אנזימים בתוך טיפות שומנים.פצל את הדגימות לארבע תת-דגימות של 20 מיקרוגרם כל אחת ותייג אותן כ-A עד D.פצל את הדגימות A ו-B לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת ותייג אותן כ-A1, A2, B1 ו-B2. הכן את מאגר C1/C2 כמתואר בפרוטוקול הטקסט וחמם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. בקובטה אחת של מיליליטר, הוסיפו כל אחת מתת-הדגימות ל-30 מיקרוליטרים של ציטוכרום c ו-10 מיקרוליטרים של מלונט. הוסף מאגר C1/C2 כדי להעלות את הנפח ל-980 מיקרו-liters ב-cuvettes A1 ו-B1 ו-979 microliters ב-A2 ו-B2. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של אשלגן כלורי טוחן אחד בקובטות A1 ו-A2 ו-10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי טוחן אחד ב-B1 ו-B2. הוסיפו מיקרוליטר אחד של רוטנון מילימולרי אחד לקובטות A2 ו-B2. ממש לפני המדידה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של NADH 10 מילימולר לכל הקובטות.הופכים את הקובט שלוש פעמים ומניחים אותו בספקטרופוטומטר. התוכנה המצורפת, לחץ על מדידה ואז פרמטרים, ואז עבור אל כללי והגדר את פרמטרי המדידה באורך גל של 550 ננומטר וזמן בארבע דקות של קריאה. לחץ על אישור והתחל כדי להתחיל בניסוי.בסוף המדידה, שמרו את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה על ידי לחיצה על File ו-Save As.פיצלו דגימות C ו-D לשתי תת-דגימות של 10 מיקרוגרם כל אחת ותייגו אותן כ-C1, C2, D1 ו-D2. מערבבים כל אחת מתת-הדגימות בקובטה של מיליליטר אחד עם 30 מיקרוליטרים של ציטוכרום c ומיקרוליטר אחד של רוטנון. הוסף את מאגר C1/C2 שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי להעלות את הנפח ל-980 מיקרוליטרים ב-cuvettes C1 ו-D1 ו-970 microliters ב-C2 ו-D2. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של אשלגן כלורי טוחן אחד ב-cuvettes C1 ו-C2 ו-10 מיקרוליטרים של נתרן כלורי טוחן אחד ב-D1 ו-D2. הוסיפו מיקרוליטר אחד של אנטימיצין A מילימולרי אחד לתוך הקובטות C2 ו-D2 ממש לפני המדידה ו-10 מיקרוליטרים של סוקסינט טוחן אחד לכל הקובטות. הופכים את הקובט שלוש פעמים ומניחים אותו בספקטרופוטומטר.בצע את המדידה ושמור את השיפוע הכולל את העלייה הליניארית של הספיגה בסוף המדידה. פרוטוקול זה שימש לחקר ההשפעה של יוני נתרן על הפחתת ציטוכרום c על ידי ממברנות מיטוכונדריאליות על תוספת NADH או סוקסינט. עקבות ספיגה שנוצרו ב-550 ננומטר עבור דגימות A ו-B תוקנו עבור העיכוב המתאים להן.עקבות אלה הראו שיפוע דומה, המצביע על פעילות דומה של NADH-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז. עם זאת, עקבות לדגימות C ו-D היו שונים, והראו כי פעילות succinate-cytochrome c oxidoreductase של מדגם C גבוהה מזו של מדגם C גבוהה יותר מזו של מדגם D.In סדר כדי לנרמל את כמות השינוי שנמדדה בטכניקה זו, שיטות אחרות יכולות להתבצע עוד יותר, כגון פעילות I מורכבת מבודדת, מורכבת II או מורכבת III. באמצעות טכניקה זו, אנו חוקרים את ההגדרות הפיזיולוגיות שבהן נתרן עשוי להיות מעורב כשליח שני.

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחלץ, לפתור ולזהות supercomplexes מיטוכונדריאלי אשר ממזער את החשיפה לדטרגנטים וכחול Coomassie. פרוטוקול זה מציע איזון מיטבי בין רזולוציה, ושימור פעילויות אנזימים, תוך צמצום הסיכון לאובדן אינטראקציות חלבון לבנה-חלבון.

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.

הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

אנו מספקים שיטה לסינון בו-זמנית של ספרייה של שברי נוגדנים לזיקה קשירה ומסיסות ציטופלזמית על ידי שימוש במסלול הטרנסלוקציה של Escherichia coli Twin-arginine, שיש לו מנגנון בקרת איכות מובנה לקיפול חלבון תוך תאי, כדי להציג את שברי הנוגדנים על הממברנה הפנימית.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

חקור את תפקידו של הנתרן כמסר שני בדיפרנציאציה של בריכות אוביקווינול במיטוכונדריה. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה למדידת העברת אלקטרונים בלי צורך במודלים תאיים ספציפיים.

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na⁺ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

גלה סרטונים נוספים