השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

המשמעות של שיטה זו היא בכך שהיא מאפשרת מיקרוטובולים ללא תוויות לתמונה בו זמנית עם חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקצבי פריימים גבוהים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היישום הקל שלה ואת הדרישות המינימליות על רכיבים אופטיים. זה גם עוקף את הצורך בתיוג פלואורו-4 של מיקרוטובולים.

כדי להתחיל, להכין את פולימר PDMS על ידי שילוב של חומר הריפוי ואת אלסטומר הבסיס ביחס מסה של 1:10. מערבבים אותם במשך שתי דקות ואז מדגים את התערובת בתא ואקום עד שכל הבועות נעלמות. לאחר מכן, יוצקים את התערובת על תבנית המאסטר בשכבה בעובי של כ-0.5 ס"מ, תוך הקפדה על הימנעות מיצירת בועות, ואופים את התערובת בתנור שחומם מראש ב-70 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.

לאחר מכן, חתכו את האזורים המובנים של הפולימר ונקבו חורים בכל קצה של התעלה באמצעות מנקב PDMS. מאוחר יותר, נקה את הצד המובנה של בלוק PDMS. לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם איזופרופנול ומתנול ולאחר מכן במים אולטרה-פוריים ולייבש את פני השטח.

לאחר מכן, פלזמה מנקה את ה-PDMS באמצעות חמצן או פלזמת אוויר ומניחים את ה-PDMS המנוקה בפלזמה על זכוכית כיסוי שנוקתה כראוי. מחממים אותו צלחת חמה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הכנס צינורות פוליאתילן בצפיפות נמוכה בגודל מתאים לתוך החורים וחבר את צינורות היציאה למזרק 0.5 מיליליטר.

לאחר מכן, הזרימו את הפתרונות למיקרו-ערוצים על ידי טבילת צינור הכניסה בתמיסה וציור הנפח הנדרש עם המזרק. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ והפעילו את מקור האור האפי-תאורה להדמיית IRM. כדי למקד את המיקרוסקופ, חפש את מישור המוקד הנכון ליד ממשק פתרון PDMS ובחר שדה ראייה ליד מרכז התעלה.

לאחר מכן, הכינו תמיסה של 0.1 מיקרומולרים של מיקרובים פלואורסצנטיים ב-BRB80 וזרמו בנפח ערוץ אחד לפחות של תמיסת המיקרובאד. עקוב אחר התגובה באמצעות IRM או TIRF. כאשר הצפיפות הרצויה של microbeads מושגת, לשטוף את עודף עם BRB80.

הזרימו זרעים מדוללים לתוך תא התגובה ועקבו אחר התגובה באמצעות IRM. כאשר הצפיפות הרצויה של זרעים מושגת, לשטוף את עודף עם BRB80. לאחר מכן, הכינו תערובת הרחבה של מיקרוטובול המכילה טובולין ללא תווית של 12 מיקרומולר, GTP של מילימולר אחד, DTT של חמישה מילימולרים במאגר BRB80.

לאחר מכן, זרמו פנימה לפחות נפח ערוץ אחד של תערובת ההרחבה תוך הקפדה על כך שטמפרטורת התגובה היא 28 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, הגדר את הגדרות ההדמיה בתוכנת המיקרוסקופ. התחל את ההדמיה וזרם את תמיסת הקינזין לתוך החדר.

לאחר מכן, דמיינו את ה-GFP המסומן כמיקרוטובולים של קינסין 1. לאחר השלמת המדידה, הקלט סרטון קצר שבו השלב מתורגם באיטיות בתנועה מעגלית או רוחבית. ההקרנה החציונית של סרטון זה תשמש כתמונת רקע ותוחמר מהמדידות הגולמיות.

צור הקרנה חציונית ב- ImageJ מהקלטת הרקע על-ידי לחיצה על תמונה. לאחר מכן, בחר את האפשרות מחסניות ולחץ על Z Project. לאחר מכן, הפחת את הקרנת הרקע החציונית מנתוני התמונה הגולמיים על-ידי לחיצה על תהליך ולאחר מכן בחר באפשרות מחשבון תמונה תוך הקפדה על בדיקת אפשרות התוצאה של 32 סיביות לצוף.

לרישום תמונה, בחר אוסף של מיקרובים ליד המיקרוטובול המעניין והשתמש בהם כדי ליישר את תמונות TIRF ו- IRM. עבור כל חרוז באוסף זה, השתמש בכלי הבחירה מרובה הנקודות כדי לסמן את המיקום המשוער בערוץ TIRF ולאחר מכן את המיקום המתאים בערוץ IRM. לאחר מכן, הפעל את המאקרו ImageJ שסופק.

מיקרובים מופיעים ככתמים כהים בתעלת ה-IRM מימין וככתמים בהירים בתעלת TIRF משמאל. הליך היישור מכסה כראוי את שני הערוצים על ידי לוקליזציה של מבחר חרוזים. באמצעות פרוטוקול זה התקבלו גם קימוגרפיה של מולקולות קינסין המסומנות על ידי EGFP, שהולכות לעבר הקצוות המתכווצים של המיקרוטובולים.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבחור מטרות צמצם מספריות גבוהות על מנת להשיג השתקפות פנימית כוללת וגם כדי למקסם את יעילות האיסוף ואת ניגודיות התמונה. שיטה זו יכולה לשמש להדמיה ברזולוציה גבוהה של מולקולות פלואורסצנטיות בודדות בו זמנית בתוך המבנה המקרומולקולרי מסיבי מספיק כדי שניתן יהיה לדמיין אותן על ידי IRM, כגון קרום התא או נימה של אקטין. פרוטוקול זה מספק גם הליך הניתן להתאמה בקלות להדמיה בו זמנית עם כל שילוב של IRM, TIRF ואפיפלואורסצנציה.