מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום
6 באפריל 2022
ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט, את ההכנה הכירורגית והשימוש במערכת מיוצבת ואקום כדי לדמות הידבקות לויקוציטים ריאתית וזלוף נימי in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה תוך-רחית יציבה ברזולוציה גבוהה של הריאה המשקפת השלמה עם טראומה פיזית מינימלית. כדי להתחיל, להכין את חלון ההדמיה על ידי מתן שכבה דקה של שומן ואקום לחלק העליון של הטבעת החיצונית תוך הימנעות מזיהום של תעלת הוואקום.
מניחים כיסוי זכוכית נקי בקוטר 8 מ"מ על החלון ולוחצים בעדינות כלפי מטה כדי ליצור אטם. חברו את חלון ההדמיה למשאבת ואקום המצוידת במד לחץ דיגיטלי ומסוגלת לספק 50 עד 60 מילימטרים של יניקה קבועה כספית. מעבירים כבל סיבים אופטיים באורך דרך צינורית אנדוטרכאלית בעלת 20 מדים ומטביעים את הקצה בלידוקאין HCL.
לאחר ההרדמה, הכנס אוטוסקופ שונה, כך שהחותכים העליונים יתאימו לתוך הפער בספקולום. התאם את ההיקף ואת מיקום הלשון עד שהאפיגלוטיס ומיתרי הקול נראים בבירור. הכנס את כבל הסיב האופטי דרך הרווח בספקולום והשתמש בתנועות מעגליות קטנות כדי להעביר את הכבל בין מיתרי הקול, ולאחר מכן השתמש בכבל הסיב האופטי כמדריך, החלק בעדינות את הצינורית לקנה הנשימה כדי ליצור אינטובציה של העכבר.
לאחר תחילת האוורור עם 1.5% איזופלורן, לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה. מהדק את הצינורית לחוטם באמצעות סרט רפואי. השתמשו בנייר דבק כדי להדק את המצח הימני למשטח החימום במצב השעה תשע ולהרחיב את הכפה האחורית השמאלית באופן קשוח ולאבטח אותה במצב של השעה שש.
באמצעות סרט בד, מתחו קלות את המצח השמאלי למצב השעה 12 והצמידו את הקצה השני של הקלטת לחלק העליון של פלטפורמת המיקרוסקופיה התוך-ורידית, ואז מרחו בדיקה של טמפרטורת פי הטבעת ואוקסימטר דופק כפות כדי לעקוב אחר הסימנים החיוניים לאורך הניסוי. כדי להכין את העכבר לניתוח, לעקר את בית החזה והבטן עם מגבון אלכוהול 70% ולמרוח ציפוי קל של שמן מינרלי כדי להרטיב את השיער בצד שמאל של העכבר. בצע חתך קטן ליד החלק התחתון של כלוב הצלעות כדי לחשוף את שכבת השריר הבסיסית, ולאחר מכן להאריך את החתך הראשוני ולהשתמש בניתוח קהה כדי לחשוף את כלוב הצלעות.
באמצעות מלקחיים המוסטטיים, תפסו את רקמת האפיתל והשומן המנותקות והניחו את האזור המנותח. כדי לתייג באופן פלואורסצנטי לויקוציטים וזרימת דם, תנו בולוס של 2.5 מיליליטר לקילוגרם של רודמין 6G ו-FITC-אלבומין דרך וריד הזנב. באמצעות מלקחיים משוננים, לתפוס את הצלע מיד נחותה ממיקום הבסיס של הריאה בהשראה הסופית.
חזור מעט את המלקחיים כדי למשוך את הצלע הרחק מהריאה ולאחר מכן חתך את הצלע כדי לגרום לפנאומוטורקס. להאריך את החתך לרוחב לשני הכיוונים, תוך הקפדה לא לגעת בריאה. תפסו את הצלע הגבוהה הבאה עם מלקחיים קהים ונסוגו מעט כדי לאפשר לריאה ליפול מדופן בית החזה.
אם הריאה אינה מתנתקת, לחץ קלות על דופן בית החזה כנגד הריאה כדי לגרום לריאה להיצמד לצדר הבסיסי ובכך ליפול בקלות רבה יותר. ממשיכים את החתך המקורי בסופו של דבר עד שעצם החזה וקרניאלי עד לחשיפת פסגת הריאה. השתמש באפליקטורים מכותנה ובגזה כדי להחליש כל דימום שעולה.
הרימו את כלוב הצלעות כדי לחשוף את כלי הדם האינטרקוסטליים על ההיבט הגבי של חלל בית החזה, תוך הקפדה שלא לפגוע בריאה, לצבוט את כלי הדם האינטרקוסטלי הנחות ביותר ליד עמוד השדרה, ואז לחתוך את הצלע הסמוכה. תנועה קרנית, ובסופו של דבר, משתמשת בתבנית חוזרת ונשנית של צריבה וחיתוך כדי לבלות חלק של כ-1 על 2 סנטימטרים של הצלעות. כדי להתכונן להדמיה, העבירו את פלטפורמת המיקרוסקופיה התוך-ורידית לשלב המיקרוסקופ והניחו את חלון ההדמיה ישירות מעל הריאה החשופה.
השתמש במניפולטור המיקרו כדי להוריד בזהירות את חלון ההדמיה עד שהוא נצמד למשטח הריאה ומייצב אותו. כדי לדמיין את המיקרו-סירקולציה הריאתית, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה המצויד בערכות מסנן FITC ו- Rhodamine אובייקטיביות וסטנדרטיות בגודל 20x. השתמש במצלמת CCD בשחור-לבן כדי להקליט את הסרטונים עם ניגודיות אופטימלית.
באמצעות ערכת המסנן FITC, זהה מקום ריאתי בהתבסס על התבנית המתכנסת של זרימת הדם ורשם סרטון של 30 שניות עם המקום בפוקוס, ולאחר מכן חזור על ההקלטה באותו שדה ראייה באמצעות סט מסנן רודמין כדי להמחיש לויקוציטים. כדי לאתר עורק ריאתי, השתמש במסנן FITC סט כדי לזהות כלי דם עם תבנית מסתעפת של זרימת דם ותעד סרטון של 30 שניות. חזור על ההקלטה באותו שדה ראייה באמצעות ערכת המסנן Rhodamine כדי להמחיש לויקוציטים.
כדי לאתר את אזורי העניין של הנימים, השתמש בערכת המסנן FITC כדי לזהות אזור של נאדיות ונימים שאינם מצטלבים על ידי כלי שיט גדולים יותר ורשום סרטון של 30 שניות. חזור על ההקלטה באותו שדה ראייה באמצעות ערכת המסנן Rhodamine כדי להמחיש לויקוציטים. סרטון זה מתאר דימוי של FITC של זרימת דם בתוך מקום ריאתי כפי שמצוין על ידי החץ הירוק.
הדמיית רודמין מאפשרת הדמיה של לויקוציטים באותו מקום עם שני לויקוציטים דביקים המסומנים על ידי החצים האדומים. שיטות אלה יושמו גם כדי לדמיין את אותן תופעות ועורקים ריאתיים ואזורי עניין נימיים. כדי להדגים את הכימות של פרמטרים מיקרו-מעגליים, עכברים טופלו ב-LPS תוך-ורידי כדי לגרום לדלקת ריאות.
סחר בלוקוציטים במקומות ריאתיים מוצג כאן עם אזורים מתוארים המייצגים את אזורי האנדותל שנותחו בעכברים נאיביים ומטופלים ב- LPS. הידבקות וגלגול של לויקוציטים הוגברו בעכברים שטופלו ב-LPS. סחר בלוקוציטים בעורקים ריאתיים מוצג כאן עם אזורים מתוארים המייצגים את אזורי האנדותל המנותחים בעכברים נאיביים ומטופלים ב- LPS.
הידבקות לויקוציטים הייתה גבוהה יותר בעכברים שטופלו ב-LPS. נתון זה מראה הידבקות לויקוציטים בתוך נימים ריאתיים בעכברים תמימים ומטופלים ב-LPS. הודגם כי הידבקות לויקוציטים גבוהה יותר בעכברים שטופלו ב-LPS לעומת נאיביות.
נתון זה מראה זלזול של נימים ריאתיים בעכברים תמימים ומטופלים ב-LPS. צפיפות נימי תפקודית הוכחה כנמוכה יותר בעכברים שטופלו ב-LPS לעומת נאיביות. יש הרבה היבטים מאתגרים של פרוטוקול זה.
אופטימיזציה של מיקום העכבר על הפלטפורמה היא צעד פשוט שיכול להפוך את שלבי הניתוח וההדמיה להרבה יותר ניתנים לשחזור. הליך זה ניתן להתאמה למגוון רחב של פרמטרי מחקר וגישות מיקרוסקופיה. לכן, זה צריך להקל על מחקר נוסף של microcirculation ריאתי במצבים בריאים וחולים כאחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיה (intravital) לחקר אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל ובדיקת פרפוזיה נימיים בזמן אמת. טכניקה זו מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה ויציבה של המיקרוסירקולציה הריאתית תוך גרימת טראומה פיזית מינימלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיה (Intravital) מאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכים ביולוגיים.
- אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל הן קריטיות להבנת תגובות חיסוניות.
- פרפוזיית נימים חיונית לבריאות ותפקוד הרקמה.
- מערכת דימות הריאות המיוצבת בוואקום ממזערת את הטראומה במהלך הדימוי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לדימוי היצמדות לוקוציטים ריאתיים.
- כימות פרפוזיה נימיים in vivo.
- העמקת ההבנה של דינמיקת הזרימה במיקרו-סירקולציה בריאות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה כירורגית ליצירת חלון הדמיה.
- מריחת גריז ואקום להבטחת אטימה תקינה.
- שימוש במשאבת ואקום לשמירה על יניקה קבועה.
- שילוב כבל סיב אופטי לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של היצמדות לוקוציטים במיקרוסירקולציה ריאתית.
- כימות של מדדי פרפוזיה בנימיליות.
- הדגמה של טראומה פיזית מינימלית במהלך הדימוג.
- השגת תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות המערכת המיוצבת בוואקום.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר המיקרו-סירקולציה הריאתית.
- דימיון תוך-חי (Intravital imaging) עשוי לקדם מחקרים על תגובות חיסוניות בריאות.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על טכניקה זו כדי לבחון תופעות ביולוגיות קשורות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב של מיקרוסירקולציה ריאתית בשידור חי ובתוך גוף (intravital) מאפשרת ויזואליזציה וכמותיות ישירה של אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל במודלים של פגיעה ריאתית חריפה. יכולת זו ממלאת פער קריטי במחקר של מחלות נשימה על ידי אספקת דימות ברזולוציה גבוהה ובמינימום טראומה של תהליכים חיסוניים דינמיים in vivo. השיטה תומכת בביטחון חיזוי באימות מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטי עבור פורטפוליו של גילוי תרופות למחלות נשימה ודלקת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תנועת תאי חיסון והפעלה אנדותליאלית ברקאת ריאה רלוונטית למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות הידבקות וגלגול של לוקוציטים בתנאי דלקת.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות עבור התערבויות הממתירות את המיקרו-סירקולציה הריאתית או את התגובה החיסונית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה מאוששת in vivo להערכת השפעות של תרכובות על אינטראקציות בין לוקוציטים לתאי אנדותל.
- מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון מדדי הידבקות של לוקוציטים ופרפוזיה נימירית.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובמדרגיות עבור סריקה פרה-קלינית של סוכנים נוגדי דלקת או סוכנים המכוונים למערכת כלי הדם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של פגיעה ריאתית חריפה ו-ARDS לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשר רצף ממחקרי מנגנון בשלב הגילוי להערכת יעילות ובטיחות פרה-קלינית.
- מספק נתונים מותאמי סיכון להכוונת החלטות קידום של טיפולים נשימתיים ואימונומודולטוריים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מערכת דימות זו משתלבת ברצף השלב המחקרי עד לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות, קבלת קריאות כמותיות והתאמה תרגומית במודלים של מחלות נשימה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בניתוח מונחה-השערות של דינמיקת תאי חיסון ותפקוד כלי דם in situ.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות במודלים של בעלי חיים חיים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של היצמדות לוקוציטים, גלגול ופרפוזיה נימיים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים לסופי-נקודה פרה-קליניים הרלוונטיים לפגיעה בריאות האדם.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה ליישומים מגוונים במחקר ריאתי וכלי דם על פני תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במודלים של פגיעה ריאתית ממקור חיסוני.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי דימוי in vivo עם טראומה מינימלית ורמת הדירות גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון בתיקי פיתוח בתחומי הנשימה והדלקת.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים המכוונים למיקרו-סירקולציה ריאתית או למסלולים חיסוניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנה כירורגית ובטכניקות של דימות תוך-חי (intravital imaging).
- מחייב גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשטח רחב (widefield) ולפלטפורמות דימות מיוצבות בוואקום.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי דימות.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות ריאה ותואם למספרים שונים של סמני פלואורסצנציה.
- צמצום ארטיפקטים של תנועה ומיקום נכון של בעל החיים הם קריטיים להשחזרות ולאיכות הנתונים.
