מיקרוסקופיית אלקטרונים המושרה על ידי אור באתרו לתצפית על אינטראקציית החומר הנוזלי-רך

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינויים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) עם מערכת תאורת אור, ייצור תאים נוזליים, ותצפיות in situ TEM של אינטראקציות הנגרמות על ידי אור בין תאי חיידקים לבין פוטוסנסיטייזר. כמו כן נדונו שיטות הכנת הדגימה, נזק לקרן אלקטרונים והדמיה.

הפרוטוקול מציג כיצד ניתן להשתמש בשילוב של TEM של תאים נוזליים ותאורת אור כדי לבחון את השינויים המבניים בחיידקים העטופים בפוטוסנסיטייזר בעת הארת האור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה. הפרוטוקול אינו דורש הכנת דגימה קשה ומספק אנקפסולציה מספקת של חיידקים עם תמיסת פוטוסנסיטייזר.

כדי להתחיל, שנה את מיקרוסקופ האלקטרונים על ידי חיבור הסיב האופטי לעמודת המיקרוסקופ בחלק העליון של העדשה האובייקטיבית. אפשר מרווח של כמה סנטימטרים בין העדשה האובייקטיבית לעדשת המעבה, בתוספת חריץ פנוי לאביזרים. הניחו שתי רשתות TEM לא מטופלות המכוסות בפחמן אמורפי בין שתי פינצטות חצויות, הפונות לצד המצופה פחמן למעלה.

החזק את הרשתות קרוב ככל האפשר לקצה. שים ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת חיידקים על אחת הרשתות. הצפיפות האופטית של המדגם חייבת להיות בטווח של 5 עד 10.

המתן 60 שניות, והכתים בזהירות את הנוזל באמצעות נייר סינון. נסו לפזר את הנוזל על פני כל משטח הרשת במהלך התהליך. שים ארבעה מיקרוליטרים של פוטוסנסיטייזר על אותה רשת.

לאחר חמש שניות, כתם את הנוזל. השאירו שכבה דקה מאוד של נוזל על המצע. הניחו במהירות את הרשת היבשה על גבי זו המכוסה בנוזל.

הזיזו בעדינות את הרשת העליונה לקצה הרשת השנייה, וסחטו את המצעים בקצוות באמצעות פינצטה. חזרו בזהירות על הסחיטה. השאירו את התא הנוזלי בין הפינצטה למשך דקה אחת.

הכנס את הדגימה למחזיק ה- TEM מיד לאחר סיום ההכנה. לאחר הכנסת הדגימה למיקרוסקופ, התחל את התצפיות במצב הגדלה נמוכה כדי למצוא אזור תצפית מתאים. במהלך התצפיות שומרים על מינון אלקטרונים נמוך ככל האפשר.

הרחב את זמן החשיפה. מצא את התאים המוקפים בנוזל בהגדלה המתאימה עם זמן חשיפה ממושך, ולכוד את התמונה הראשונה באופן מיידי. הקפידו על מינון אלקטרונים קבוע, ואספו תמונות כל 30 שניות כדי לצפות בשינויים.

בחן היטב את התמונות וחשב את מינון האלקטרונים הכולל המתאים לשינויים הגלויים הראשונים בתאים. לפני תחילת הניסוי, הגדר את עוצמת אור הלייזר על ידי התאמת הערך הנוכחי. הכנס את הדגימה למיקרוסקופ ומצא את אזור התצפית.

צלם את התמונה הראשונה של התא לפני תחילת ההארה של הדגימה, והשתמש בבלנקר הקרן כדי לכבות את קרן האלקטרונים כדי למנוע את ההשפעות של הקרנת אלקטרונים. הפעל את הלייזר. התחל עם זמן הארה קצר, שכן אור הלייזר הוא בעל עוצמה גבוהה יחסית.

לאחר מכן, כבה את מקור האור. כבה את הקורה הריקה ולכוד את התמונה באופן מיידי. במידת האפשר, השתמש באלגוריתם אוטומטי כדי לחשוף את הדגימה רק למשך הזמן הדרוש לצילום התמונה.

מדוד בזהירות את זמן הקרנת האלקטרונים כדי לחשב את מינון האלקטרונים המשמש להדמיה. נצפתה השפלה ניכרת של השכבה החיצונית של התא הנגרמת על ידי מיני החמצן הריאקטיבי שנוצר על ידי קרינה קלה יותר של הפוטוסנסיטייזר לאחר דקה אחת. תאורת אור נוספת הפכה את השינויים לגלויים יותר.

נקודות תצפית נאותות עם מספיק נוזלים ניתן למצוא בקלות בהגדלה נמוכה, שכן אזורים אלה נראים כהים ומטושטשים יותר. החיידקים המכוסים בנוזל נראים פחות מהחיידקים היבשים, אך עדיין ניתן להבחין ביניהם. כדאי להסתכל על הגבול הנוזלי במהלך ההדמיה, וניתן לזהות את תנועתו בקלות, מה שמרמז על כך שהאזור הנבחר עשוי להיות לא מתאים ולא יציב.

בעיה נוספת במהלך התצפיות היא אידוי המים ומשקעים של התמיסה שיכולים להתרחש באזורים אקראיים של הדגימה, כולל האזורים המקיפים את החיידקים. אנקפסולציה של חיידקים יכולה להתבצע גם באמצעות גרפן וממברנות סיליקון חנקתי. הכנת המדגם קשה יותר, אך יציבות התא הנוזלי תהיה טובה יותר.

השיטה המוצגת יכולה לשמש לתצפיות של תגובות המושרות על ידי אור על נוזל. לדוגמה, השפעת האור על חומרים מתכתיים, זרזים הנגרמים על ידי אור ותגובות פוטוכימיות.