Name: שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: למד ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים מגליובלסטומה אנושית לחקירת מגוון תאי הגידול ומנגנוני עמידות לתרופות. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק יותר של ביולוגיית הגידול ופיתוח טיפולים מותאמים אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר ג'סטין לת'יה על עצתו שלא תסולא בפז ותמיכתו המתמשכת. אנו מודים גם לקטרינה פייף, ליסה וואלאס ומאיה קמחי על התמיכה הטכנית המצוינת שלהן.

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microenvironmental+regulation+of+glioblastoma+stem+cells%3A+a+biomaterials+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Materials%22%5BJournal%5D)">Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective.</a> Frontiers in Materials. 5, 7(2018).</li>
<li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+glioblastoma%3A+is+it+working%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li>
<li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li>
<li>Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deadly+teamwork%3A+neural+cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).</li>
<li>Yu, S. C., Bian, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+cancer+stem+cells+based+on+heterogeneity+of+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).</li>
<li>Zhu, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+create+a+stem+cell+niche+in+glioblastoma+by+providing+NOTCH+ligands+that+nurture+self-renewal+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells.</a> Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).</li>
<li>Calabrese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+niche+for+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular niche for brain tumor stem cells.</a> Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Charles, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+nitric+oxide+activates+notch+signaling+and+promotes+stem-like+character+in+PDGF-induced+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).</li>
<li>Seidel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypoxic+niche+regulates+glioblastoma+stem+cells+through+hypoxia+inducible+factor+2+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha.</a> Brain. 133, 983-995 (2010).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cancer+stem+cells+secrete+Gremlin1+to+promote+their+maintenance+within+the+tumor+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy.</a> Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+stem+cells+generate+vascular+pericytes+to+support+vessel+function+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth.</a> Cell. 153 (1), 139-152 (2013).</li>
<li>Flavahan, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+initiating+cells+adapt+to+restricted+nutrition+through+preferential+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).</li>
<li>Hjelmeland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+stress+promotes+a+glioma+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+regulate+tumorigenic+capacity+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells.</a> Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).</li>
<li>Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+glioblastoma+by+co-culturing+tumor+stem+cells+with+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids.</a> Biology Open. 10 (2), 056416(2021).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li>
<li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+what+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Lenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug+screening+pipeline+using+2D+and+3D+patient-derived+in+vitro+models+for+preclinical+analysis+of+therapy+response+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).</li>
<li>Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+glioblastoma+and+their+role+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+lipid+metabolism+marks+glioblastoma+stem+and+non-stem+cells+in+separate+tumor+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Sundar, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organoid+culture+unveils+resistance+to+clinical+therapies+in+adult+and+pediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma.</a> Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

אורגנואידים GBM הם שיטת תרבית משלימה לתחומים מסורתיים הכוללים הטרוגניות תאית ומיקרו-סביבתית גדולה יותר 4,22,30. למרות שהיא דורשת יותר זמן ומשאבים, התרבות האורגנואידית יכולה להציע תובנות חשובות לגבי התנהגות תוך-סרטנית ומנגנונים של עמידות לסמים.
GBM מונע על ידי אוכלוסייה של CSCs 5,31, ושיטות אלה פותחו כדי לאפשר המשך צמיחה והתחדשות עצמית של אוכלוסיית CSC זו. גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסט (FGF) ידועים כמשפרים את התחזוקה והצמיחה של תאי גזע ומספקים איתות קולטן פעיל טירוזין קינאז (RTK). היווצרותן של אוכלוסיות תאים הטרוגניות ומיקרו-סביבה של גידולים מובחנים בתוך גידולי GBM מסתמכת על תמיכה בהתנהגויות CSC. הבחירה של lrECM מחקה את סביבת המוח העשירה בלמינינים ותומכת בתאים בתרבית אורגנואידית להתארגן בעצמם ולהגר על ידי פלישה. למרות שקבוצות מסוימות ביססו תרבית אורגנואידית ללא שימוש במדיה מועשרת lrECM או EGF/FGF24,28, שעשויה להציע דרך יעילה יותר בזמן של שיטת תרבית זו ובחירה חזקה יותר של איתות אונקוגני כדי להניע צמיחה, שיטות אלה נבחרו כדי לייעל את הסביבה הפרו-תאי כדי לבסס בצורה הטובה ביותר את ההטרוגניות התאית של אורגנואידים. גם אורגנואידים מוחיים וגם אורגנואידים GBM נעשו עם lrECM בספרות בעבר 21,32,33. למרות שביססנו נתונים לגבי אוכלוסיות הגידולים שנמצאו בתוך האורגנואידים והשונות המרחבית, פחות ידוע על אוכלוסיות שאינן גידוליות בתוך האורגנואידים וכמה זמן הם שורדים מדגימות החולה המקוריות. כתמי IHC מסוימים (כגון CD45) עשויים לספק נתונים אלה, ועשויים להיות נקודת מחקר מעניינת בעתיד עם אורגנואידים.
ידיעת השימוש המיועד לתרבית אורגנואידית חשובה לבחירת שיטות מתאימות. לביסוס אורגנואידים מדגימות ראשוניות לעומת גידול אורגנואידים אחידים לניסויים ספציפיים יש הליכים מעט שונים. הערכה לאופן שבו אורגנואידים מתבגרים וממלאים חזותית את פיגום lrECM חשובה ליכולת להקצות זמן ומשאבים מתאימים לתרבות אורגנואידית. אזורים דלילים של תאים באורגנואידים יתרחבו באיטיות ויגדלו כדי למלא את ה-lrECM, מה שיכול להימשך בין 2-8 שבועות, תלוי בהתנהגות הדגימה. קצב גידול זה הוא מהותי במקצת לכל דגימה; הוא נשמר על פני קבוצות שונות של אורגנואידים ועקבי למדי עם הקצב היחסי של צמיחת הכדור. אורגנואידים יכולים להישמר במשך יותר משנה אחת ולשמור על יכולות היווצרות הגידול על xenograft לתוך עכברים; עם זאת, מומלץ לגדל אותם במטרה ברורה לא לבזבז משאבי מעבדה (הן חומרים והן זמן)4. גידול אורגנואידי נבדק במספר גדלים ופורמטים של בארות, ומראה כי צלחת בגודל 10 ס"מ היא ההגדרה האידיאלית לשמירה על כדאיות תאים אופטימלית, ואחריה צלחת של 6 בארות עם שלושה אורגנואידים לכלבאר 34. אורגנואידים צורכים יותר מדיה בהשוואה למקביליהם התרבית הדו-ממדית, ושימוש בפורמט באר קטן יותר אינו מוביל לתחזוקה נאותה. לדוגמה, לבאר אחת של לוח בפורמט 96 בארות אין מספיק שטח או נפח מדיה ביחס לגודל של אורגנואיד כדי לקיים צמיחה אורגנואידית.
כפי שהאורגנואידים קובעים, להיות שומר מצוות חשוב להגברת ההצלחה. בתחילה, אורגנואידים יצרכו מדיה לאט, אך ככל שהם נעשים צפופים ובוגרים יותר, הם יצרכו מדיה מהר יותר. הוספת פנול אדום למדיה יכולה לעזור לשמש אינדיקטור לצריכת מדיה. כאשר המדיה צהובה יותר, זה עשוי לגרום לנו להתאים את דפוס ההזנה, בין אם זה להחליף נפח גבוה יותר של מדיה, להגדיל את כמות המדיה הכוללת בצלחת, לחלק אורגנואידים בין מספר צלחות תרבית תאים כדי לעמוד בקצב הצמיחה שלהם, או אפילו להתאים את ציר הזמן לניסויים. 
במובנים רבים, אורגנואידים הם דרך לא יעילה לביצוע מחקר סרטן. הם כרוכים בסקאלות זמן ארוכות, והם יקרים ועתירי משאבים בהשוואה לתרבות הספירה של GBM. עם זאת, בהשוואה לקסנוגרפטים שמקורם בחולה, שיטה חלופית ליצירה מחדש של מגוון תאי ומיקרו-סביבתי, הם פשוטים יותר, זולים יותר וניתנים לשליטה. הבחירה מתי להשתמש בצורה הטובה ביותר באורגנואידים חשובה לחוקרי סרטן. הם לא נועדו להחליף את המרחב המסורתי או את התרבות החסידית ולא להחליף מודלים של קסנוגרפט. אורגנואידים יכולים, כאשר הם מיושמים בשאלה המדעית הנכונה, לשלב את היתרונות של שתי המערכות הללו ועשויים לאפשר לנו להתבונן בביולוגיה של תאי הגידול שאחרת היו נשארים מוסתרים. הקהילה המדעית רק מתחילה להבין אילו הזדמנויות למידה אורגנואידים מציעים, אך ברור שהם יהיו כלי רב ערך בעתיד להבנת הביולוגיה המורכבת של GBM.

גליובלסטומה (GBM) היא הגידול העיקרי השכיח ביותר במוח עם פרוגנוזה קודרת של כ -15 חודשים מאבחון1. טיפולים יעילים במחקרים פרה-קליניים יכולים לעתים קרובות להיות יעילים בצורה גרועה בחולים 2,3. תגובה קלינית ירודה מיוחסת לגורמים רבים, כולל ההטרוגניות המיקרו-סביבתית של GBM ואינטראקציות פנים-טיפוליות מורכבות. אלה יכולים להיות קשים לשחזור בסביבת המעבדה עם שיטות מסורתיות של תרבית דבק או כדור4. נוכחות של תת-קבוצה של תאי גזע סרטניים המתחדשים בעצמם (CSCs) בתוך GBM עשויה גם היא לתרום למורכבות זו 5,6. CSCs חיוניים להתפשטות הגידול ולשמירה על צמיחת הגידול על ידי קידום אנגיוגנזה פעילה, פלישת סרטן ועמידות לטיפולים כולל קרינה 7,8,9. תאי CSCs אינם מפוזרים באופן אחיד בין גידולים, אלא מועשרים בתוך מיקרו-סביבה ספציפית, כולל נישה פריווסקולרית ואזורים פרינקריטיים, שכל אחד מהם מספק ויסות מולקולרי מובהק של מצבי התאים שלהם 10,11,12,13,14. CSCs אינם נמענים פסיביים של רמזים מיקרו-סביבתיים, אלא בעלי יכולת לעצב מחדש את המיקרו-סביבה שלהם 7,15,16. המיקרו-סביבה של CSC יכולה לקדם תחזוקה של מצב תאי גזע בתגובה ללחצים כגון מחסור בחומרים מזינים, pH והיפוקסיה17,18,19,20, מה שמרמז על החשיבות של תנאים אלה במערכת מודל. לפיכך, שחזור של המיקרו-סביבה התאית המגוונת בתוך גידולים הוא קריטי להבנת העמידות הטיפולית ולזיהוי טיפולים חדשניים.
תרבות התלת מימד עלתה בפופולריות בשנים האחרונות21,22. אורגנואידים שימשו בסוגים אחרים של סרטן, והמטרה העיקרית של שמירה על תאים כאורגנואידים היא לאפשר צמיחה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות (שרבות מהן עשויות בדרך כלל להיות מחוץ לתרבית כדור הומוגנית יותר) ומגוון מרחבי, הנתפס כמיקרו-סביבה אזורית של גידולים עם ספציפיות גנטית 4,23,24,25,26 . ישנן שיטות רבות לתרבית תלת מימדית של תאים סרטניים, שלכל אחת מהן יתרונות וחסרונות27,28,29. התרבות האורגנואידית לא נועדה להוות תחליף לתרבות החסידות או המרחב המסורתית. הוא משמש בצורה הטובה ביותר כטכניקה משלימה לשיטות דו-ממדיות כאשר יש שאלות ספציפיות שבהן האינטראקציה בין מיקרו-סביבה של תאים לתגובות תאי גידול היא קריטית.
מאמר זה מתאר שיטות אמינות וחוזרות על עצמן ליצירת אורגנואידים של GBM מדגימות מטופלים ראשוניות או מתרביות שמקורן בחולה. אנו מתייחסים לשתי מטרות שונות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית: (1) הקמת אורגנואידים מרקמת המטופל הראשונית, עם פוטנציאל השתלה מקסימלי ללא קשר לאחידות, או (2) גידול אורגנואידים אחידים לשימוש ניסיוני כמותי יותר. בעת הקמת דגימה ראשונית כאורגנואידים, אין צורך לסנן תאים בודדים או לספור תאים, מכיוון ששמירה על מספר וסוגי תאים מרביים כדי לקבוע את התרבית הראשונית היא בראש סדר העדיפויות. עם זאת, כאשר מגדלים אורגנואידים לניסויים השוואתיים, יש צורך בסינון חד-תאי ובספירת תאים כדי להבטיח שהאורגנואידים המשוכפלים יהיו ברי השוואה לצורך עקביות ניסויית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להקים תרביות אורגנואידים וליצור אורגנואידים אחידים, כמו גם שיטות מעודנות להטמעה ושימור של אורגנואידים וניסויים סטנדרטיים בתרביות תאים, כולל אימונוהיסטוכימיה, אימונופלואורסצנציה והערכת הכדאיות הכוללת של התאים באורגנואידים GBM.

<table><tbody><tr><td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) טבליות</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>3,3-Diaminobenzidine (DAB) טבליות</td></tr><tr><td>96 בארות PCR צלחות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96 בארות PCR</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>תמיסת ניתוק תאים</td></tr><tr><td>אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>תוסף תזונה אנטיביוטי-אנטי-פטרייתי</td></tr><tr><td>B-27 מינוס ויטמין A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>תוסף B-27 מינוס ויטמין A (50x)</td></tr> <tr><td>GelCode מגיב כתמים כחולים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>מגיב כחול</td></tr><tr><td>מסננת תאים (70 ומיקרו; m)</td> <td>מסננת תאים CellTreat</td><td>Scientific 229483</td><td>(70 ומיקרו; m)</td></tr> <tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>בדיקת כדאיות תאים זוהרים</td></tr><tr><td>מבהיר 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>מגיב הבהרה המטוקסילין גרעיני</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>תחליף קסילן</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoxylin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hematoxylin</td></tr><tr><td>Glutamine ב 0.85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>גלוטמין ב 0.85% NaCl (200 מ"מ)</td></tr> <tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>מטריצה חוץ-תאית מועשרת בלמינין</td></tr><tr><td>מיני עט PAP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>עט מחסום הידרופובי</td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>נוירובזאלית מדיה מינוס פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>מדיה נוירובזאלית מינוס פנול אדום (500 מ"ל)</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 4% ב-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>פרפורמלדהיד 4% ב-PBS</td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא</td><td>P0290</td><td>פנול אדום (0.5%)</td></tr><tr><td>תושבת ProLong Gold Antifade עם DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>תושבת ריפוי נוזלי</td></tr><tr><td>רקומביננטי חלבון EGF אנושי</td><td>R& D systems</td><td>236-EG-01M</td><td>חלבון EGF אנושי רקומביננטי (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td></tr> <tr><td>FGF אנושי רקומביננטי מו</td><td>"פ בסיסי D systems</td><td>4144-TC-01</td><td>FGF אנושי רקומביננטי בסיסי (250 ומיקרו; g/mL)</td></tr> <tr><td>איתות תאים מדלל נוגדן SignalStain</td><td></td><td>8112</td><td>נוגדנים מדלל</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC זיהוי מגיב</td><td>איתות תאים</td><td>8114</td><td>מגיב לזיהוי אימונוהיסטוכימיה</td></tr><tr><td>SignalStain ציטראט פתרון חשיפת מסכה</td><td>איתות תא</td><td>איתות 14746</td><td>פתרון חשיפת ציטראט</td></tr><tr><td>סכין גילוח קצה יחיד</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>קצה יחיד סכין גילוח</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>תבניות קריו-תבניות חד פעמיות</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. תרכובת</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>כתם אימפרמטר תא (0.4%)</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>קסילן</td></tr></tbody></table>

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

גליובלסטומה (GBM) היא סרטן המוח הממאיר הראשוני השכיח ביותר עם פרוגנוזה גרועה ביותר. מגוון תאי ומולקולרי תוך-גידולי, כמו גם אינטראקציות מורכבות בין מיקרו-סביבה של גידולים, יכולים להפוך את מציאת הטיפולים היעילים לאתגר. שיטות מסורתיות של תרבות דבק או כדור יכולות להסוות מורכבויות כאלה, בעוד שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית יכולה לשחזר שיפועים מיקרו-סביבתיים אזוריים. אורגנואידים הם שיטה של תרבית GBM תלת-ממדית המחקה טוב יותר את ארכיטקטורת הגידול של המטופלים, מכילה אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית, ויכולה לשמש לניסויים בתפוקה בינונית. למרות שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית היא מייגעת וגוזלת זמן רב יותר בהשוואה לתרבות המסורתית, היא מציעה יתרונות ייחודיים ויכולה לשמש לגישור על הפער בין מערכות in vitro ו-in vivo הנוכחיות. אורגנואידים ביססו את עצמם ככלים יקרי ערך בארסנל של ביולוגים של סרטן כדי להבין טוב יותר את התנהגות הגידול ואת מנגנוני העמידות, והיישומים שלהם רק ממשיכים לגדול. כאן, פרטים מסופקים על שיטות ליצירה ושמירה על אורגנואידים GBM. מתוארות גם הוראות כיצד לבצע הטבעה וחיתוך של דגימות אורגנואידים תוך שימוש בטכניקות של הטבעה קפואה ושל פרפין, כמו גם המלצות לפרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה על מקטעים אורגנואידיים, ומדידה של הכדאיות הכוללת של תאים אורגנואידיים.

איור 1 מראה צמיחה אורגנואידית מוקדמת הנראית באמצעות מיקרוסקופיית אור בהגדלה של פי 10. איור 1A מראה נדידה ופלישה של תאים בודדים דרך lrECM בתצוגה המרכזית. התאים ימשיכו להתרחב ו'ליישב' את ה-lrECM, והם ייראו צפופים יותר ובסופו של דבר אטומים יותר על ידי בדיקה חזותית. איור 1B מראה כמה אורגנואידים בוגרים (בגיל 7 שבועות) ללא הגדלה, יחסית לגודל של אגורה.
איור 2 מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית של אורגנואידים מסוג GBM עבור פוספו-היסטון H3, סמן של התפשטות פעילה. רוב התאים המתרבים מאוד נראים בהיקף האורגנואידי בהשוואה לליבה האורגנואידית. מכתים חיוביים יהיו בעלי מראה חום/נחושת.
איור 3 מתאר את התהליך להומוגניזציה ולמדידה של מספר התא הכולל באורגנואידים של GBM באמצעות בדיקת כדאיות תא זוהר ספציפית לתלת-ממד. בשל המספר הגבוה של תאים הנמצאים באורגנואידים GBM, המבנה האורגנואידי הגדול יותר הומוגני בתחילה על ידי טריטורציה במגיב בדיקה זוהר. לאחר מכן שברים מכלל הליזאט האורגנואידי נטענים לתוך בארות בודדות ומדוללים בריאגנט נוסף של בדיקה זוהרת לפני הדגירה והקריאה על קורא צלחות מתאים מרובה בארות.
איור 4 מייצג נתוני בקרה של DMSO (רכב משותף) עבור אורגנואידים. נתונים מתווכים מדגימים עקביות תוך-אורגנואידית ובין-אורגנואידית. נתוני כדאיות זוהרים בדרך כלל מנורמלים לבקרות עבור כל דגימה בעת יצירת נתוני ניסוי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> איור 1: מבט דרך מיקרוסקופ אור (10x). (A) צמיחה אורגנואידית מוקדמת המדגימה נדידה/פלישה של תאי GBM לאורך המטריצה החוץ-תאית העשירה בלמינינים. (B) אורגנואידים בוגרים ביחס לגודל של אגורה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> איור 2: אימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים GBM. (A, B) אורגנואידים GBM המציגים תאים מוכתמים בפוספו-היסטון H3 לשגשוג פעיל. סרגלי קנה מידה הם 600 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר עבור A ו-B, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> איור 3: פרוטוקול הכדאיות של תאים זוהרים עבור אורגנואידים . (A) להעביר אורגנואידים בודדים לצינורות צנטריפוגות קטנים ולהסיר עודפי מדיה. (B) הוסף 500 μL של 1:1 PBS ותערובת בדיקת כדאיות תאים זוהרת לכל צינור ופיפטה באגרסיביות כדי לפרק את האורגנואיד. (C) הוסף 25 μL של תערובת אורגנואידית זו ו-75 μL של אותה תערובת של 1:1 PBS ובדיקת כדאיות תאים זוהרים לכל באר של צלחת 96 בארות. (D) מניחים על שייקר למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך 20 דקות ב-RT, ולאחר מכן קוראים לומינסנציה על קורא צלחת. איור שנעשה באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> איור 4: כדאיות התא. נתוני כדאיות תאים עבור אורגנואידים ב-0.1% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור שישה שכפולים טכניים של ארבעה אורגנואידים עבור ארבע דגימות מטופלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>כמות</td>
		</tr><tr><td>בינוני נוירובסלי מינוס פנול אדום</td>
			<td>500 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>תוסף B-27 פחות ויטמין A (פי 50)</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100x)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוטמין ב-0.85% NaCl (200 מ"מ)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF בסיסי (250 מיקרוגרם / מ"ל)</td>
			<td>20 מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>חלבון EFG אנושי רקומביננטי (250 מיקרוגרם למ"ל)</td>
			<td>20 מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>פנול אדום</td>
			<td>500 מיקרון</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: נוסחה שלמה של מדיום נוירובאזלי (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>50% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>75% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>3 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>4 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>15 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>15 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: לוח זמנים לעיבוד אורגנואידים קטנים (בקוטר של פחות מ-3 מ"מ)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>50% אתנול</td>
			<td>6 דק'</td>
		</tr><tr><td>75% אתנול</td>
			<td>6 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>95% אתנול</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>5 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>8 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>30 דק'</td>
		</tr><tr><td>שעוות פרפין</td>
			<td>30 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: לוח זמנים לעיבוד אורגנואידים גדולים (מעל 3 מ"מ קוטר)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>זמן</td>
		</tr><tr><td>המטוקסילין</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>מגיב מבהיר המטוקסילין גרעיני</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריאגנט בלוינג</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>ריצה diH2O</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>70% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>100% אתנול</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr><tr><td>תחליף קסילן</td>
			<td>2 דק'</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 4: כתם נגדי של המטוקסילין

במאמר זה אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים של גליובלסטומה (GBM) מדגימות של מטופלים ראשוניים או מתרביות תאים שמקורן בחולה, ושמירה עליהם עד לבגרות. אורגנואידים אלה של GBM מכילים אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית ויוצרים מחדש מיקרו-סביבה של גידולים ex vivo.

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

מציאת טיפולים לגליובלסטומה היא מאתגרת בגלל המגוון התאי שקיים בגידולים והאינטראקציות בין מיקרו-סביבה מגוונת. אורגנואידים יכולים לעזור לשחזר חלק מהמגוון המרחבי הזה, ואנו יכולים להשתמש בזה כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הגידולים. בעוד ששיטות מסורתיות של תרביות תאים נוטות לייצר אוכלוסיות תאי גידול הומוגניות, אורגנואידים יכולים לחקות טוב יותר את המגוון המולקולרי והתאי של גליובלסטומה ולמדל טוב יותר אינטראקציות תוך-גופיות.ניתן להשתמש באורגנואידים כדי לחקור את יעילות התרופה ומנגנוני העמידות. התנגדות לטיפולים קליניים עשויה להופיע רק באורגנואידים ולא בתרבות התחום המסורתית, המשקפת את המציאות הקלינית של מחלה זו. אורגנואידים יכולים לעזור להדגים את ההשפעות האזוריות של כימותרפיה.ניתן להשתמש בהם כדי לגלות טיפולים ספציפיים חדשים בנישה, והם יכולים גם לשמש ככלי חיזוי לרפואה מותאמת אישית בעתיד. חלק מהחומרים המשמשים ליצירת אורגנואידים רגישים לטמפרטורה, והזנחת השמירה על חומרים אלה בטמפרטורה הנכונה שלהם עלולה להוביל לקשיים ביצירה או בשמירה על אורגנואידים. התחילו להכין את התבניות האורגנואידיות מתחת לקולט אדים על ידי הורדת נייר השעווה מגיליון הפרפילם והצבתו בין שתי תגובות שרשרת פולימראז סטריליות 96-well או לוחות PCR.ודא כי החלק הפנימי של parafilm נקי. הפעילו לחץ אחיד על הלוח העליון כדי ליצור גומות קטנות בעומק שני מילימטרים בפרפילם מבלי ליצור חורים. מפרידים את הצלחות.הפרפילם הגומה יידבק לצלחת העליונה. לאחר מכן הניחו את הצלחת העליונה על קרח יבש למשך 30 שניות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי למשוך את הפרפילם מהצלחת העליונה בתנועה מהירה.פרפילם קפוא קל יותר להסרה. מניחים את תבנית הפרפילם שהושלמה בתבנית מכוסה וסטרילית של תרבית תאים באורך 10 סנטימטרים. כדי להכין את ההשעיה החד-תאית מגליובלסטומה או מתרבית דבק GBM, הסר את המדיה המשומשת מהצלחת.לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים בטמפרטורת החדר לצלחת, ודוגרים את הצלחת ב 37 מעלות במשך שלוש דקות. לאחר אישור ניתוק התא מהצלחת מתחת למיקרוסקופ, הוסף שמונה מיליליטר של Neurobasal Medium שלם, או מדיום NBMC, כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא. מסננים את המתלים דרך מסננת תאים אחת של 70 מיקרון.סובבו את התאים בטמפרטורה של 120 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את supernatant ו resushed את התאים במיליליטר אחד של NBMc. לספור את התאים מן ההשעיה של תא יחיד באמצעות כתם impermeant התא.כדי ליצור אורגנואידים מתרחיף חד-תאי, הוסף כמות מתאימה של מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין, או lrECM, לתוך צינור צנטריפוגה קטן בדלי קרח או בלוק קר. הכן תערובת תאים המכילה 20, 000 תאים לכל organoid. ערבבו היטב את תערובת תרחיף התאים lrECM כדי למנוע התיישבות של התאים, מה שיגרום להיווצרות אורגנואידית לא אחידה.לאחר מכן, פיפטה בזהירות 20 מיקרוליטר של התערובת על תבנית parafilm כדי ליצור טיפה דמוית פנינה. הקפידו לקרר את קצה הפיפטה כל שניים עד שלושה אורגנואידים כדי למנוע פילמור lrECM. לאחר שמספר האורגנואידים הרצוי יונף על תבנית הפרפילם בצלחת תרבית באורך 10 סנטימטרים, דגרו את האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים באינקובטור של תרבית תאים.לאחר שהאורגנואידים מתמצקים, שטפו את האורגנואידים בעדינות מתבנית הפרפילם עם מדיום NBMc באמצעות קצה P1000 ואספו אותם לצלחת תרבית חדשה באורך 10 ס"מ המכילה 20 מיליליטר של NBMc. מניחים את צלחת התרבית באינקובטור מבלי לרעוד במשך ארבעה ימים. לאחר ארבעה ימים, החלף את המדיה בצלחת.לשם כך, הניחו פיסת נייר כהה מתחת לצלחת תרבית התא. הטה את הצלחת והמתן 20 שניות. כאשר האורגנואידים מתיישבים לחלוטין בתחתית המנה, מסירים באיטיות את המדיה עם פיפטה זכוכית גדולה הנפתחת.לאחר הוספת מדיה חדשה, מניחים את הצלחת באינקובטור על שייקר מסלולי ב-80 סל"ד, ומחליפים מדיה כל יומיים-שלושה לאחר מכן. הצמיחה של האורגנואיד נצפתה באמצעות מיקרוסקופ אור. במבט המרכזי, גידול אורגנואידים מוקדם הראה נדידה ופלישה חד-תאית דרך lrECM.האורגנואידים הבוגרים בגיל שבעה שבועות היו יחסית לגודל של אגורה. הכתם האימונוהיסטוכימי של האורגנואידים GBM עם פוספו-היסטון H3 חשף תאים מתרבים מאוד עם מראה חום או סגול בהיקף האורגנואידי בהשוואה לליבה. נתוני הכדאיות של התאים עבור אורגנואידים ב-0.1% DMSO הדגימו עקביות תוך-אורגנית ואינטראורגנידית.שימו לב לביומסה אורגנואידית ולהחמצת מדיה. אם האורגנואידים עוברים מדיה מהר מדי, הקפד להחליף את המדיה בתדירות גבוהה יותר או לפצל את האורגנואידים בין צלחות נוספות. אורגנואידים בוגרים יכולים לשמש לניסויים עם טיפולים או מוטבעים ומחולקים לשימוש עם אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה.ניתן להשתמש באורגנואידים מנותקים לניתוח FACS. אורגנואידים אלה שימשו לאחרונה בבדיקות תפקודיות תלת-ממדיות כדי לגלות מטרות חיוניות בנישות של תאי גזע סרטניים מובחנים מרחבית. אנחנו גם משתמשים במודלים האלה כדי לתעדף תרופות וטיפולים שונים לפני בדיקות in vivo.

maintaining-human-glioblastoma-cellular-diversity-ex-vivo-using-three

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הסרטון מדגים יצירה ותחזוקה של תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מרקמת גליובלסטומה. הרקמה המבודדת משובצת במטריצה אגרוזית, וחלקים דקים מתקבלים באמצעות ויברטום. חלקים אלה מונחים לאחר מכן על תוספות קרום חדירות בתוך צלחת מיקרו ומתורבת במצע תחזוקת תרבית פרוסה לתחזוקה לטווח ארוך.

יצירה ותחזוקה של תרביות פרוסות מרקמת גליובלסטומה אנושית

סרטון זה מתאר את ההכנה והטיפוח של אורגנואידים של גידולי מוח מתרחיף חד-תאי. באמצעות מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין כפיגום וכמצע תרבית עבור חומרי הזנה, התאים מתאפשרים להתרבות ולהתארגן בתוך האורגנואיד. כתוצאה מכך, נוצרים אורגנואידים ex vivo, המחקים את המגוון התאי ואת המיקרו-סביבה של גידולי מוח.

יצירת תרבית אורגנואידים מתרחיף תאי גידול במוח

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

מודלים vivo לשעבר של גליובלסטומה (GBM) אינם מותאמים למחקר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של הפלישה של הגידול האנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ותחזוקה של תרבויות פרוסה organotypic מרקמת GBM אדם טרי. תיאור של זמן לשגות מיקרוסקופיה ו כמותי תא הגירה טכניקות ניתוח מסופק.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

ניתן למזער קסנוגרפלים שמקורם בחולה של גליובלסטומה מולטיפורמה למיקרו-גידולים חיים באמצעות מערכת תרבית ביוג'ל אנושית תלת מימדית. בדיקת גידול תלת מימדית זו מתאימה לבדיקת תגובה לתרופות ופרופיל מולקולרי, כולל ניתוח קינומי.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

מחקר זה מציג שיטה אוטומטית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים מסוג גליובלסטומה שמקורם במטופל באמצעות מסוק רקמות. השיטה מספקת גישה מתאימה ויעילה להשגת אורגנואידים כאלה לבדיקה טיפולית.

טיפוח אורגנואידים מסוג גליומה שמקורם במטופל Ex Vivo באמצעות מסוק רקמות

גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 הן גידולים נדירים שקשה לתרבת. אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית המשמרת ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 ומקיימת תרביות במשך חודשים. חשוב לציין, טכניקה זו עובדת עם גידולים שמורים בהקפאה, ומציעה משאב רב ערך לחקר גליומה.

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מקיף לייצור ושימוש באורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסים במעבדה (LEGO) כדי לחקור תלות גנוטיפ-פנוטיפ ולסנן תרופות פוטנציאליות לטיפול בגליובלסטומה.

תרבית אורגנואידים של גליובלסטומה מהונדסת במעבדה וסינון תרופות

למד ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים מגליובלסטומה אנושית לחקירת מגוון תאי הגידול ומנגנוני עמידות לתרופות. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק יותר של ביולוגיית הגידול ופיתוח טיפולים מותאמים אישית.

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

גלה סרטונים נוספים