הקרנה מרובת תפוקה גבוהה לסוכרת מסוג 1, מחלות צליאק ו-COVID-19
5 ביולי 2022
בהתאם לצורך הדחוף בבדיקות סקר לסוכרת מסוג 1, צליאק ומחלת קורונה 2019, פיתחנו בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 6-Plex כדי לזהות בו זמנית את כל ארבעת הנוגדנים העצמיים של האיונים, נוגדנים עצמיים של רקמות טרנסגלוטמינאז, ונוגדנים לתחום קשירת הקולטן של תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2.
בדיקת 6-Plex ECL החדשה היא בדיקת המולטיפלקס הראשונה שאומתה ומיושמת כעת בניסוי קליני לסינון אוכלוסייה כללית. הוא משלב בו זמנית שישה מבחני נוגדנים עצמיים המתאימים לבדיקת סוכרת מסוג 1, מחלת צליאק וקורונה באוכלוסייה גדולה. בהשוואה לבדיקת הנוגדנים העצמיים הסטנדרטית הנוכחית, טכניקה זו יכולה לסנן ביעילות רבה יותר נוגדנים עצמיים מרובים עבור מספר מחלות אוטואימוניות בו זמנית.
המשמעות של טכניקה זו תהפוך את ההקרנה בקנה מידה גדול לאפשרית יותר וספציפית למחלה, ותוביל לחיזוי מוקדם של המחלה למניעה ולאבחון מדויק יותר לטיפול. כדי להתחיל, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של GAD65 שעבר ביוטינילאטציה, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 וחלבון אנטיגן פרואינסולין לצינור המכיל 156 מיקרוליטרים של 1% BSA וערבבו עם 240 מיקרוליטרים של מקשרים מצומדים מקבילים של סטרפטאווידין, 1, 2, 3, 8, 9 ו-10. לאחר מכן, לדגור את התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
Aliquot 160 microliters של תמיסת עצירה לתוך כל צינור לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. עכשיו, לקחת 400 microliters של פתרון תערובת מכל צינור ולשלב אותם יחד. הוסיפו לתערובת ארבעה מיקרוליטרים של GAD65 עם תווית רותניום, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ואנטיגן פרואינסולין.
לאחר מכן, הוסף 1.6 מיליליטר של תמיסת עצירה ו -3.2 מיליליטר של PBS. מערבבים היטב את כל הרכיבים. ועכשיו, פתרון האנטיגן מוכן לשימוש בבדיקה.
עבור צלחת PCR של 96 באר, aliquot שבעה מיקרוליטר של סרום לכל באר ולכסות את הצלחת עם סרט איטום. לאחר מכן, מחממים את הסרה ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על מכונת PCR ומנצלים לזמן קצר את הצלחת ב-100 פעמים G למשך דקה אחת. מוסיפים 63 מיקרוליטרים של תמיסת אנטיגן מוכנה לכל באר, מערבבים עם הסרה, ומכסים את צלחת ה-PCR ברדיד אלומיניום כדי למנוע אור.
נערו את הצלחת על שייקר במהירות של 450 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ואז, לדגור את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות. קחו צלחת 6-Plex מהמקרר בארבע מעלות צלזיוס, כדי לאפשר לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטרים של 3% חוסם A לכל באר של צלחת 6-Plex. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע אור. מחזירים את הצלחת למקרר של ארבע מעלות צלזיוס ודוגרים למשך הלילה.
בסוף הדגירה, לאחר הסרת הצלחת מהמקרר, להסיר את כל החיץ מהצלחת. טפחו את הצלחת על מגבות הנייר לייבוש, ושטפו אותה שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל באר. ייבשו את הצלחת על מגבת הנייר ו-30 מיקרוליטרים של אנטיגן בסרום דוגרים מכל באר של צלחת ה-PCR הדוגרה למשך הלילה לשתי בארות של צלחת ה-6-Plex.
מכסים את הצלחת בנייר כסף, ואז מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים במהירות של 450 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעה. השליכו את התמיסה הקיימת בצלחת 6-Plex ושטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה נתרן כלורי 0.4 M לכל באר. לאחר השלמת הכביסה השלישית, ייבשו את הצלחת כנגד מגבת הנייר והוסיפו 150 מיקרוליטרים של חיץ קריאה לכל באר.
הרמות של שישה נוגדנים עצמיים עבור GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA ו- COVID-19A מבדיקת ECL 6-Plex היו מתואמות היטב עם ששת בדיקות ה- ECL היחידות המקבילות שלהם, ובדיקת קשירת הרדיו הסטנדרטית הנוכחית. ערכי המדד עבור כל דגימה עבור כל ששת הנוגדנים חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות. נצפה ערך מדד גדול מערך הניתוק, שהצביע על תוצאה חיובית.
נוגדנים עצמיים בסרום הפרו את האנטיגן המסומן רותניום לאנטיגן הביוטינילציה, ויצרו קומפלקס עם מקשר ספציפי לבניית פלטפורמת ריבוב. טקטיקה זו הופכת את ההקרנה בקנה מידה גדול לאפשרית ויעילה יותר באוכלוסייה הכללית עבור סוכרת מסוג 1 ומחלות נלוות, מה שמוביל לחיזוי מוקדם ומניעה של המחלות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקת אלקטרו-כימילומינצנציה (electrochemiluminescence) חדשנית מסוג 6-Plex, שנועדה לזיהוי סימולטני של נוגדנים עצמיים הקשורים לסוכרת מסוג 1, למחלת הצליאק ול-COVID-19. הבדיקה שואפת להגביר את יעילות הסריקה רחבת ההיקף של מחלות אוטו-אימוניות אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אוטואימוניות
- אבחון קליני
- בדיקות אלקטרו-כימילומינצנציה
רקע
- סוכרת מסוג 1 ומחלת הצליאק הן הפרעות אוטואימוניות הדורשות גילוי מוקדם.
- מגפת ה-COVID-19 הציבה אתגרים חדשים בסקרים למחלות אוטואימוניות.
- שיטות סריקה נוכחיות הן לרוב לא יעילות וגוזלות זמן רב.
- בדיקות מולטיפלקס (Multiplex assays) יכולות לשפר את יכולות הסריקה על ידי בדיקה של מספר נוגדנים בו-זמנית.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה בתפוקה גבוהה לזיהוי סימולטני של מספר נוגדנים עצמיים.
- תיקוף של הבדיקה לשימוש בניסויים קליניים.
- סיוע לניבוי מוקדם של מחלות ולמניעתן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות אנטיגן באמצעות חלבונים מסומנים בביוטין וברותניום.
- דגירה של דגימות סרום עם תמיסות האנטיגן שהוכנו.
- שימוש בלוח PCR בעל 96 בארות לעיבוד הדגימות.
- מתאם (קורלציה) של התוצאות עם בדיקות סטנדרטיות לאימות גישת המולטיפלקס.
תוצאות עיקריות
- בדיקת ה-6-Plex ECL הפגינה מתאם חזק עם בדיקות בודדות מסורתיות.
- ערכי האינדקס הצביעו על תוצאות חיוביות לנוגדנים עצמיים בדגימות סרום.
- הבדיקה מאפשרת סריקה יעילה של מספר מחלות אוטואימוניות.
- התוצאות תומכות בהיתכנות של סריקת אוכלוסייה רחבה.
מסקנות
- בדיקת ה-6-Plex ECL היא כלי מבטיח לגילוי מוקדם של מחלות אוטו-אימוניות.
- שיטה זו משפרת את היעילות של תהליכי הסריקה.
- היא טומנת בחובה פוטנציאל לשיפור תוצאות הטיפול בחולים באמצעות התערבות מוקדמת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת ה-6-Plex ECL שעברה תיקוף מאפשרת זיהוי רב-מרכיבי (multiplexed) ובעל תפוקה גבוהה של נוגדנים עצמיים לסוכרת מסוג 1, למחלת הצליאק ול-COVID-19, ובכך היא נותנת מענה לצורך בסריקה יעילה של אוכלוסיות עבור מחלות ספציפיות. פלטפורמה זו מגבירה את הביטחון החיזוי בנקודת המפנה המוקדמת ביותר ברצף שבין הגילוי לאבחון, ותומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי מחקר המותאמות לסיכון במחקרים על מחלות אוטואימוניות ומחלות זיהומיות. אימוצה ככלי סריקה ראשוני מדגים השפעה ברמה ארגונית על תהליכי עבודה טרנסלציונליים ופרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה סימולטנית של מספר מטרות אוטואימוניות ווירוסליות בפורמט בדיקה יחיד.
- משפר את הפחתת הסיכונים הביולוגיים על ידי הבחנה בין פרופילים של נוגדנים עצמיים הספציפיים למחלה.
- תומך בביטחון חיזוי עבור אסטרטגיות של חיזוי ומניעה מוקדמים של המחלה.
- מקל על תיעדוף הפורטפוליו על ידי אספקת תוצאות כמותיות ומולטיפלקס לצורך תיקוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות Multiplexed שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקה וזיהוי סממנים ביולוגיים (biomarkers) בשלבים הבאים.
- מנstandardize תנאי הבדיקה כדי להבטיח הדירות והשוואתיות כמותית בין דגימות.
- מאפשר סריקה רחבת היקף (high-throughput) הניתנת להרחבה, עם דרישות מינימליות לנפח סרום.
- תומך בהערכה אמינה של השפעות תרכובות או התערבויות על מספר סממנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה, לצורך המשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף קליני.
- מספק פלטים כמותיים המנחים החלטות קידום מותאמות סיכון בקווי פיתוח פרה-קליניים.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה (predictive de-risking) על ידי מתאם בין פרופילים של נוגדנים עצמיים מרובי-סמנים (multiplexed autoantibody profiles) לבין הופעת המחלה והתקדמותה.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
בדיקת ה-6-Plex ECL משתלבת בממשק שבין השלבים המוקדמים של הגילוי, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ומחקר תרגומי, ומאפשרת מעבר חלק מבדיקת השערות ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות חסונה ובבירור מסלולים באמצעות זיהוי רב-סמני (multiplexed) של נוגדנים עצמיים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לסביבות סריקה בעלת תפוקה גבוהה.
- אנליטיקה: מספק ערכי מדד ונקודות החלטה מבוססות ערכי סף להשוואה בין תנאים שונים ולניתוח סטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב התגליות לאישוש קליני על ידי התאמת זיהוי סמנים ביולוגיים לנקודות קצה רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור יוזמות סריקה רב-סמניות עתידיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים בשלבים מוקדמים של מחלות אוטואימוניות ומחלות זיהומיות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימת העבודה באמצעות סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה לסריקה בתפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון על ידי אספקת נתונים רב-מרכיביים (multiplexed) וברי-ביצוע.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום מועמדים על בסיס ראיות איתנות של סמנים ביולוגיים רב-מרכיביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפיתוח בדיקות אימונו-סיי (immunoassay) מרובות-נפח (multiplexed) ובגילוי באמצעות אלקטרו-כימילומינצנציה (electrochemiluminescence).
- דורש גישה למכשור ייעודי לקריאות ECL ולטיפול בלוחיות בתפוקה גבוהה (high-throughput).
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בדיקה ומסלולי ניתוח נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה לשימוש עם סוגי דגימות שונים או מודלים של מחלות ככל שצרכי הפורטפוליו יתפתחו.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בתיקוף (validation) קפדני מול בדיקות single-plex ובדיקות קישור רדיואקטיבי (radio-binding assays) מבוססות.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
