הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

תאי פסגה עצבית מהגרים מקפלים עצביים גולגולתיים בעוברים או כאשר הם ממוקמים בתרבית. זה מספק שיטה נוחה לבודד תאי עצב נודדים ראשוניים ללא דיסוציאציה של תאים. בעוד שנדידת פסגה עצבית מתרחשת בדרך כלל בתוך הסביבה העוברית התלת-ממדית, התרבות הדו-ממדית מאפשרת הדמיה וחקירה של תהליכים הקשורים להגירה.

למרות שקיימים פרוטוקולים של תרבית קיפול עצבי גולגולתי, שיטה זו דורשת אימון וצעדים ספציפיים לאורגניזם. סרטון זה מדגים טכניקות כדי להקל על הכנה ניתנת לשחזור של תרביות קפל עצבי גולגולתי אפרוח. מתחילים מתקשים לעתים קרובות לנתח ולצפות קפלים עצביים ולהעריך את תוצאות התרבות.

מעקב אחר הנחיות ההסרה ויישום הניתוח המורפומטרי המתואר כאן מאפשר קבלת תוצאות כמותיות עקביות. כדי להתחיל, מניחים את הביציות המופרות במצב זקוף בתוך אינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הביצים מהאינקובטור, חטאו את הקליפות על ידי ריסוס יסודי של 70% אתנול ותנו להן להתייבש.

לתיקון והכתמה של התרביות, השתמשו בתלושי כיסוי זכוכית שהוכנסו לצלחת תרבית רקמה מרובת בארות, ופיפטה מספקת תמיסת פיברונקטין כדי לכסות את תחתית הבאר. לאחר מכן, החלף את המכסה, ודגר את הצלחת בתמיסת פיברונקטין באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות תוך ניתוח קפלים עצביים. השתמשו במלקחיים קהים כדי לתקוע חור קטן בקליפה ב-1/4 עד 1/3 מאורך הביצה.

מכניסים בזהירות את המלקחיים הקהים לתוך החור הקטן, ומבטיחים לא להפריע לחלמון. לאחר מכן, חותכים את קליפת הביצה סביב הביצה, מסירים את החלק העליון של קליפת הביצה, ומניחים את העובר לבידוד. הכינו את העובר על ידי שימוש עדין בקצה השטוח של מלקחיים קהים סגורים כדי לנגב כל עודף אלבומין על פני החלמון המכסה את העובר.

השתמש במלקחיים כדי למקם מסגרת תמיכה בנייר סינון מעל העובר, כאשר העובר נמצא בחלון המסגרת. לחצו בעדינות על נייר הסינון כדי להיצמד לחלמון. גזור מסביב לחלק החיצוני של מסגרת נייר הסינון באמצעות מספריים לנתיחה.

השתמשו במלקחיים או בקצות מספריים כדי לתפוס את קצה המסגרת, והרימו בעדינות את העובר הרחק מהחלמון. מניחים את העובר עם מסגרת הנייר כלפי מטה לתוך צלחת פטרי של 60 או 100 מיליליטר מלאה ברינגר עם עט-סטרפ. שמור את צלחת העוברים על קרח אם אתה אוסף אותם עבור RNA או יישום רגיש לחלבון במורד הזרם.

העבירו את העובר לכלי נקי המכיל את תמיסת העט-סטרפ של רינגר. סובבו בעדינות את העובר קדימה ואחורה כדי לפנות כל חלמון שמטשטש את הנוף, והחליפו את תמיסת העט-סטרפ של הצלצול או העבירו אותו לצלחת טרייה אם הוא נעשה מעונן. מקמו את גב העובר ושלד את צד העובר כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ גזירה.

השאירו את העובר על מסגרת הנייר כדי לשמור עליו מתוח ומוחזק במקומו. לאחר מכן, להסיר את קרום vitelline, באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את הקפלים העצביים. כוללים רקמת caudal לשלפוחית האופטית מתרחבת ו rostral למוח האחורי, שם התכווצויות rhombomere רק מתחילים להופיע.

באמצעות מספריים קפיץ, בזהירות את הקפלים העצביים של המוח האמצעי. הקפידו לכרות את ההיבט הגבי ביותר של הקפל העצבי עם זיהום מינימלי של הצינור העצבי והאקטודרם הלא-עצבי, והעבירו את הקפלים העצביים לצלחת נקייה המכילה את תמיסת העט-סטרפ של רינגר באמצעות פיפטור P20 או פיפטה מזכוכית סטרילית של פסטר שטופה בתמיסת העט-סטרפ של יולקי רינגר. יש לאחסן קפלים שנאספו על קרח תוך ניתוח קפלים נוספים.

לאחר הסרת צלחת התרבית מהאינקובטור, השתמש פיפטור או פיפטה פסטר כדי להסיר את תמיסת הפיברונקטין מכיסוי, צלחת או באר. לאחר שטיפת המצע המצופה פיברונקטין בתמיסת העט-סטרפ של רינגר, הוסיפו נפח מתאים של מדיה תרבותית שלמה למנה או באר. כדי לחסום את הפלסטיק ולמנוע את הידבקות הרקמה, השתמשו בפיפטטור P20 או P200, ושטפו את קצה הפיפטה בתמיסת העט-סטרפ של יולקי רינגר.

לאחר מכן, העבירו את הקפלים העצביים המבודדים לכיוון מרכז הכיסוי המצופה בפיברונקטין, תוך הקפדה על העברת תמיסת העט-סטרפ הקטנה ככל האפשר של רינגר. לאחר שאפשרו לצמחים להסתפק במשך 10 עד 15 דקות, הכניסו אותם לתא לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס על ידי נשיאה איטית וזהירה של צלחת התרבית עם קפלים עצביים מצופים. הסר את מדיה התרבות עם פיפטה פסטר, ולשטוף את הבארות עם PBS מעוקר מסנן.

יש להוסיף 4% פרפורמלדהיד ולשמור על שייקר פלטפורמה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להסיר paraformaldehyde, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם PBS, ולהוסיף PBST המכיל 5% סרום. כעת, פיפטה 30 מיקרוליטרים של 200-ננומולר אורגון גרין הצמידו פלואידין על משטח חלק לכל החלקה על הכיסוי.

באמצעות זוג מלקחיים, הסר את החלקת הכיסוי מה- PBST המכיל 5% סרום, וודא את כיוון התאים הפונים כלפי מעלה. יש לפתות את עודפי הנוזלים על ידי נגיעה קצרה בקצה הכיסוי למגב משימה עדין. מניחים בעדינות כל מכסה את צד תא ההחלקה כלפי מטה על טיפת הפלואידין המדולל, ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר תקופת הדגירה, הרימו את תמיסת הכיסוי מתמיסת הכתמים והחזירו אותה לצלחת התרבית, תוך הפיכתה כך שצד התא יהיה למעלה. הקפידו לכסות את הכיסוי ב-PBST, והניחו אותו על שייקר פלטפורמה למשך 10 דקות, תוך שמירה על כיסוי מכוסה ובחושך. יש להסיר PBST, ולחזור על שטיפת המכסה פעמיים למשך שלוש כביסות בנות 10 דקות בסך הכל.

הנח טיפה אחת של מדיית הרכבה על שקופית מיקרוסקופ. הרכב את צד תא ההחלקה של הכיסוי כלפי מטה על-ידי הנמכה איטית של ההחלקה בזווית על מדיית ההרכבה כדי למנוע יצירת בועות, ואפשר למדיה לשקוע לפני ההדמיה. לבסוף, דמיין את התאים המוכתמים וייצא אותם כקבצי TIFF.

תאי הצמרת העצבית החלו להגיח מתוך הקפל העצבי הדביק תוך שלוש עד ארבע שעות מהדגירה, והנדידה הושלמה לאחר כ-20 שעות. תאי הצמרת העצבית הנודדת סומנו באמצעות HNK-1, ונראה כי רוב התאים היו חיוביים ל-HNK-1. תאי הצמרת העצבית הנודדים הודגמו על ידי צביעת אקטין נימה בפלואידין.

תמונות של התאים המוכתמים בפלואידין עובדו באמצעות ImageJ כדי לייצר תמונת סף שבה התאים נראו שחורים עם רקע לבן. תמונת הסף נותחה ומדידות שונות הוצגו בגרפים של עמודות מנוגדות או בעלילות כינור. לדוגמה, השטח הממוצע של 69 התאים שנותחו היה כ-802.11 מיקרומטרים רבועים, שנעו בין 60.27 ל-2, 664.53 מיקרומטרים רבועים.

המעגליות משקפת את בליטות התא ונעה בין 0.101 ל-0.875. הערכים הנמוכים יותר מציינים צורה מוארכת, בעוד שערך של אחד מציין עיגול מושלם. רוב התאים הציגו צורה מוארכת, שנראית הכי בקלות בעלילת הכינור.

לתאי הצמרת העצבית הנודדת בשדה זה היה יחס גובה-רוחב ממוצע של כ-2.13, ויחס גובה-רוחב של אחד מהם מציין צורה סימטרית. כריתה זהירה וציפוי צמחים הם חיוניים לתרבויות מוצלחות. אפשרו לקפלים העצביים לשקוע בצד למשך 10 עד 15 דקות, ולאחר מכן עברו באיטיות לאינקובטור כדי לעודד הידבקות.

וריאציות על טכניקות אלה כוללות מניפולציה גנטית חולפת לפני ההתרבות והדמיית קיטועי זמן במהלך הדגירה. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר איסוף של אוכלוסיות תאי צמרת עצבית קדם-מיגרטורית ונודדת לצורך ניתוח ברמת אומיקה.