גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

PIB-MS היא טכניקה חדשנית המשמשת להעשרת פוספטזות של זרחן-פרוטאין אנדוגני, והם מקיימים אינטראקציה בין חלבונים מתאים ומרקמות. היא כוללת זיהוי וכימות של חלבונים אלה באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות. טכניקה זו אינה דורשת ביטוי אקסוגני של גרסאות מתויגות של פוספטאזות זרחן-פרוטאין שיכולות לשנות את פעילות החלבון או את הלוקליזציה.

כמו כן, הוא אינו משתמש בנוגדנים שעשויים להיות לא ספציפיים או שאינם מסוגלים להבחין בין איזופורמים ספציפיים. ניתן לשנות את השיטה הזו לחקר ה-PPPM לשימוש בכל דבר, מתאים ועד דגימות קליניות. כדי להתחיל, לאסוף את כדורי התא על ידי צנטריפוגה ב 277 פעמים גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את המדיה ושטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS. הכן מאגר ליזיס כמתואר בפרוטוקול הטקסט ושמור על קרח. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ ליזיס מצונן לדגימות, ואז הומוגניזציה של הדגימות על ידי סוניפיקציה ושומרים את התאים על קרח בין פולסים.

מעבירים את הליסאטים לצינורות טריים של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימה הקולית ב 21, 130 פעמים גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש באליקווט של הליזאט כדי לכמת את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת חומצה ביצ'ינצ'ונינית.

שלב זה חיוני כדי להבטיח ריכוז חלבון שווה בכל דגימה. להדברת מעכבי פוספופרוטאין פוספטאז, הכינו שני אליקוטים בעלי ריכוז חלבון שווה לכל דגימה. ניתן להשתמש במאגר Lysis כדי לדלל את הדגימות כך שלכל צינור יהיה ריכוז חלבון שווה.

הוסף מיקרומולר אחד של מיקרוציסטין-LR חופשי לאליקוט אחד ונפח שווה של DMSO לשני. מערבולת את הדגימות ומדגרת אותן על קרח במשך 15 דקות. הכנת חרוזי מעכבי פוספטאז יש לבצע מראש או במהלך שלבי הדגירה המתוארים בסעיף הכנת הדגימה.

השתמש ב-10 מיקרוליטרים של חרוזים מעכבי פוספטאז מוצקים, או שרף PIB, עבור מיליגרם אחד של חלבון והוסף אותם לצינור של 1.5 מיליליטר. שטפו את ה-PIBs שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטרים של חיץ ליזיס על ידי מערבולת ואחריה צנטריפוגה ב-376 פעמים גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. הוסף כמות מתאימה של מאגר lysis ל- PIBs השטופים כדי ליצור פתרון מאגר PIB בנפח של 50%.

מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים את קצה הפיפטה ואת הסלרי כדי להחיות את ה-PIBs. העבר 20 מיקרוליטרים של ה-slurry לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 0.5 מיליליטרים של מאגר ליזיס. סובב את הצינורות ב 376 פעמים גרם במשך 30 שניות.

כל צינור מכיל נפחים שווים של PIBs בו. יש להשליך את ה-supernatant תוך השארת רק את השרף המוצק ועד 50 מיקרוליטרים של חיץ ליזה בכל צינור. העבר את ה- lysates לצינורות המסומנים כראוי המכילים PIBs.

דגירה של הליסאט עם ה-PIBs למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-8 סל"ד. לאחר הדגירה עם הליזאט, צנטריפוגה PIBs ב 376 פעמים g במשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. לשטוף את החרוזים על ידי הוספת 0.5 מיליליטרים של חיץ lysis והפיכת הצינורות לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.

חזרו על שלב זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, הסר את מאגר הליזיס ככל האפשר מבלי לטפטף את ה- PIBs. הכן מאגר אלוטיון המכיל 2% SDS והוסף את מאגר האלוטיון פי ארבעה עד חמישה מנפח ה- PIBs.

דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לחלץ את הפוספופרוטאין פוספטזות מהחרוזים. צנטריפוגה הצינורות ב 376 פעמים גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאסוף את ה-eluate לתוך שפופרת נפרדת ולהמשיך לניתוח ספקטרומטריית מסות או לכתם מערבי.

כדי לחדש את ה-PIBs, דגדרו אותם בתמיסת 2% SDS עם סיבוב ב-8 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את החרוזים שלוש עד חמש פעמים ב-25 מילימולאר Tris-HCl pH 7.5 עם סיבוב למשך 30 דקות לכל שטיפה. אחסן PIBs ב 25 millimolar Tris HCL pH 7.5 עם נתרן אזיד.

עבור ניתוח ספקטרומטריית מסות, שיטות סינון וניתוח נתונים משתנות ועשויות להתבצע על ידי החוקר או מתקן הליבה. לאחר חיפוש בנתונים הגולמיים מול מסד נתונים של פרוטאומים ספציפיים למין, סנן את תוצאות החיפוש וייצא אותם כגיליון עבודה של Microsoft Excel. נתחו את הנתונים במשולשים.

לכימות ללא תוויות, השתמש במדידות שטח שיא של MS1 כדי לכמת את הנתונים. כדי לזהות תת-יחידות PPP והאינטראקציות שלהן דה נובו, השווה בין טריפליקטים ביולוגיים של דגימות מעכבות מיקרוציסטין-LR לבין דגימות שטופלו ב-DMSO. סנן את הנתונים כך שיהיו רק חלבונים עם ספירת פפטידים כוללת של יותר מאחד מכל לפחות שתיים מתוך שלוש הדגימות שטופלו בבקרת DMSO.

כדי לסנן חלבונים שאינם נקשרים באופן ספציפי לשרף, הסר את החלבונים שבהם ספירת הפפטידים הכוללת במצב שטופל במיקרוציסטין-LR גבוהה מזו של כל תת-יחידה קטליטית של PPP. אל תכלול מזהמים נפוצים כגון קרטין, קולגן, חלבונים ריבוזומליים וריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים מהניתוח. קובץ CSV חיוני לייבוא הנתונים לפרסאוס.

ייבוא נתונים מסוננים לפרסאוס על-ידי לחיצה על העלאת מטריצה גנרית במקטע טען. הפוך את הנתונים על-ידי מעבר אל 'התמרה בסיסית', בחירת הנתונים וציון פונקציית הטרנספורמציה כבסיס יומן 2 של x. צמצם ערכים חסרים מהתפלגות נורמלית על-ידי מעבר ל- Imputation, החלף ערכים חסרים מהתפלגות נורמלית, בחירת הנתונים וציון הרוחב וההסטה כלפי מטה עבור החישוב.

בצע נורמליזציה של קוונטיזציה על ידי מעבר לנורמליזציה של קוונטיזציה. ביאור הנתונים על-ידי מעבר לשורות Annot, שורות ביאור קטגוריאליות. בצע את מבחן T של התלמיד על ידי מעבר למבחנים, מבחנים דו-מדגמיים, בחירת הקבוצות, המבחן לביצוע והשיטה לתיקון בדיקת השערות מרובות כפי שהיא משמשת לקיצוץ.

פונקציה זו מחשבת גם את יחסי יומן 2. פוספוטטים של פוספופרוטאין והאינטראקצים שלהם זוהו בתאי HeLa באמצעות ניסוי משיכה של PIB, ולאחר מכן כימות ללא תווית של שפע חלבונים בדגימות שטופלו ב-DMSO ובמיקרוציסטין-LR שטופלו. תרשים הר געש של ניתוח ספקטרומטריית מסות זיהה קלסרים ספציפיים של PIB המוצגים בתת-יחידות אדומות, קטליטיות בכחול, ותת-יחידות PPP מועמדות חדשות, או חלבונים מתקשרים, בלבן.

קלסרים לא ספציפיים הוצגו באפור. תרשים פיזור של אזור log2 מהליזאט של תאי HeLa שטופל ב-DMSO הראה כי השפע היה מתואם מאוד, מה שמעיד על יכולת שחזור של הנתונים. ניתוח רשת של כל תת-היחידות של זרחן-פרוטאין פוספטאז והחלבונים המקיימים אינטראקציה הראה כי חלבונים אלה היו אינטראקציות ספציפיות במשיכה של PIB כלפי מטה.

ניתן לבצע ניתוחי פרוטאומיקה גלובליים ואת התוצאות בהשוואה לניתוח PIB כדי לקבוע אם הרכב ה- PPPome מונע על ידי שפע PPP או מווסת על ידי מנגנונים פוסט-תרגומיים. PIB-MS הוא כלי ישים באופן נרחב שאיפשר לנו לזהות הבדלים בדפוסי ביטוי PPP בתנאים שונים כגון דגימות אינטרפאזה לעומת מיטוטיות או הבדלים בין קווי תאים סרטניים.