שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

שבב הגלומרולוס האיזוגני יאפשר מידול מחלות ספציפיות לחולה ובדיקות נפרוטוקסיות ויישומי רפואה מדויקת מתקדמים. אפיתל גלומרולרי ואנדותל מופקים מאוכלוסייה אחת של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, או IPSCs. IPSCs הם בעלי התחדשות עצמית בלתי מוגבלת ויכולים להתמיין כמעט לכל סוג תא.

טכניקה זו יכולה לשמש להערכת פנוטיפים תאיים פתולוגיים ומחלות. שבב האיברים הספציפי למטופל יכול לשמש גם כפלטפורמה לסינון תרופות ומחקרים מכניסטיים. מודל זה יכול להיות מיושם על פיתוח של גוף על מערכת שבב מותאם אישית למטופל מסוים.

למערכת זו יש פוטנציאל לחזות תגובות ספציפיות למטופל לפני בדיקות קליניות. התחל על ידי הוספת בעדינות 25 microliters של מטריצת קרום מרתף 2 פתרון לתעלת השתן ו 20 microliters לתוך הערוץ הנימי של השבב. קח שני כובעי צינור חרוטי סטריליים של 15 מיליליטר ומלא אותם ב -500 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים.

מניחים את הפקק בצלחת הפטרי כדי למנוע התייבשות ומניחים את המכסה על המנה. לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בהמשך, שאפו את המדיום מצלוחיות T75 המכילות תרבית של 15 יום של תאי אנדותל וסקולריים במפגש של 90%.

מוסיפים חמישה מיליליטר של חיץ ניתוק תאים ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שבע דקות. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוסיפו חמישה מיליליטר של DMEM/F-12. צנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות.

הסר את supernatant ו resudate את התאים ב 300 microliters של אמצעי תחזוקה אנדותל. לספור את התאים עם hemocytometer כדי לקבל כ 2 מיליון תאים. באמצעות קצה מחסום P200, שטפו את הערוצים העליונים והתחתונים של השבב המיקרופלואידי ב-200 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 ובמקביל שאפו מהפריפריה של השקע.

החזק את השבב בחוזקה כאשר קצה מחסום P200 מחובר לאספירטור הרחק מהשקע של הערוץ התחתון. מזריק היטב 20 microliters של ההשעיה תא אנדותל כלי הדם לתוך הערוץ הנימי של השבב בזהירות לשאוף את המדיום מן הפריפריה של השקע. בדקו מתחת למיקרוסקופ אם יש בועות או צפיפות זריעה לא אחידה.

הפוך בעדינות את השבב כך שהתאים יוכלו להיצמד לצד הבסיסי של קרום PDMS הגמיש. הכנס את השבב למחסנית המחזיק והוסף שלושה מיליליטר של PBS למחסנית כדי למנוע את התייבשות הממברנה. לדגום את השבב ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.

בדוק את התעלה התחתונה מתחת למיקרוסקופ עבור שכבה מקבילה של תאים המחוברים לממברנת PDMS הגמישה. שטפו את התאים הלא מחוברים על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מדיום תחזוקת האנדותל על פתח התעלה התחתונה תוך שאיפה מהפריפריה של שקע התעלה הנימי. החזירו את השבב למחסנית המחזיקה והדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, לשטוף בעדינות את ערוץ נימי עם 200 microliters של תחזוקת אנדותל בינוני. שטפו את תעלת השתן עם 200 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 ושחררו 50 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 על פתחי הכניסה והיציאה. המשך תאי מזודרם ביניים, להחליף את מדיום אינדוקציה mesoderm ביניים מכל באר של צלחת 12 היטב עם מיליליטר אחד של טריפסין EDTA ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

מגרדים בעדינות את התאים באמצעות מרים תאים ומנתקים את התאים באמצעות פיפטינג. מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת נטרול טריפסין לכל באר ומעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הרכיבו את נפח מתלה התא ל-50 מיליליטר עם DMEM/F-12 וצנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות.

לשאוף את supernatant ו להשעות את התאים ב 500 microliters של בינוני mesoderm אינדוקציה בינוני כדי לקבל כ 3 מיליון תאים. לספור את התאים עם hemocytometer. החזק את השבב והזריק בחוזקה 25 מיקרוליטרים של השעיית התא לתעלת השתן של השבב תוך שאיפה זהירה של המדיום מהפריפריה של השקע.

בדוק אם יש בועות או צפיפות זריעת תאים לא אחידה. הוסף שלושה מיליליטר של PBS לתוך מחסנית מחזיק השבב ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, שטפו את שתי הערוצים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית התאים שלהם.

חברו קצוות מחסום P200 ריקים לשני השקעים של תעלות השתן והנימים. Pipette 200 microliters של תחזוקת האנדותל בינוני ולהזריק חצי ממנו לתוך פתח ערוץ נימי. שחררו את קצה הפיפטה בתוך הכניסה כך שגם הכניסה וגם היציאה של הערוץ מחוברים לקצות פיפטה מלאים במדיום.

חזור על הליך זה עבור כניסת ערוץ השתן עם 200 microliters של אמצעי תחזוקה mesoderm ביניים. דגרו את השבבים בעזרת קצוות מוטבעים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לחבר את השבבים לביוריאקטור של שבבי איברים, תחילה, הסר טיפים P200 מהערוצים.

הוסיפו טיפות של מדיה מתאימה לכניסה ולשקע של תעלות השתן והנימים כדי למנוע התייבשות. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום אינדוציטים חם למאגר כניסת השתן ושלושה מיליליטר של מדיום תחזוקת אנדותל חם למאגר הכניסה הנימי. הוסף 300 מיקרוליטרים של המדיה המתאימה למאגרי היציאה ישירות מעל יציאת היציאה.

החליקו את התרמילים על המגש ולתוך הביוריאקטור של שבבי האיברים. השתמש בחוגה הסיבובית כדי לבחור ולהתחיל את מחזור הפריים למשך שתי דקות. בדוק באופן חזותי את החלק התחתון של התרמיל לאיתור טיפות קטנות בכל ארבע יציאות הנוזלים.

כדי להשיג מגע בין נוזל לנוזל בין החלק התחתון של התרמיל לבין יציאות השבב המיקרופלואידי, החלק בעדינות את נושא השבב לתוך התרמיל. לחצו בעדינות על לשונית מנשא השבב פנימה ולמעלה. שאפו מדיום עודף מפני השטח של השבב.

הגדר את קצב זרימת הביוריאקטור של שבב האיברים ל -60 מיקרוליטר לשעה. הגדר את הזן המחזורי ל-10% ב-0.4 הרץ. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור של שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הוויסות ולהפעיל במשך שעתיים.

בדוק חזותית את מאגרי מוצא עבור עלייה ברמת המדיום. השתמש בחוגה הסיבובית בביוריאקטור של שבב האיברים כדי לבחור את מחזור הווסת. לאחר יום 17 של תרבות, שאפו מדי יום את המדיום ממאגרי היציאה של תעלת השתן באלכסון הרחק מהנמל, אך שמרו על מדיום כלשהו במאגר.

לחדש את מאגר פתח השתן עם עד שלושה מיליליטר של מדיום אינדוקציה פודוציטים כל יומיים במשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים, לשאוף את המדיום מערוץ השתן אבל לשמור על מדיום כלשהו במאגר. לחדש את מאגר פתח השתן מדי יום עם שלושה מיליליטר של תחזוקת פודוציטים.

באופן דומה, שאפו את המדיום משקע התעלה הנימית ומלאו את מאגרי הכניסה מדי יום במדיום תחזוקת אנדותל. באמצעות פרוטוקול זה נעשה שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם כדי לפתח מודל חוץ-גופי פונקציונלי של הגלומרולוס על ידי הפצת תאי אנדותל וסקולריים ופודוציטים. ביום ה-21 לאחר אינדוקציה של פודוציטים והתפשטות האנדותל של כלי הדם, התאים בתוך השבבים ביטאו סמני זיהוי שושלת כגון פודוצין ונפרין עבור פודוציטים, קדהרין VE ו-PECAM-1 עבור תאי אנדותל וסקולריים.

הן שכבת תאי הפודוקיטים והן שכבת תאי האנדותל של כלי הדם ביטאו את קולגן IV שהוא חלבון ה-GBM הנפוץ ביותר בגלומרולוס הכליות. שבבי הגלומרולוס סיננו באופן סלקטיבי מולקולות קטנות כמו אינולין מהנימים לתעלת השתן, תוך שהם מונעים מחלבונים גדולים כמו אלבומין לעזוב את תעלת הנימים, מה שמראה פונקציית סינון מולקולרית סלקטיבית. במהלך אינדוקציה של האנדותל בימים 4 עד 7, עלייה במספר התאים עלולה לגרום לשכבה משנית של תאים, אך זריעת יתר עלולה לגרום לצבירה שיכולה לעכב התמיינות.

ניתן לצפות בזרימה צולבת בלתי צפויה של נוזלים בין ערוצי השתן והנימים במקרה של הדבקה לא מספקת של רכיבי שבב PDMS, חסימה בנתיב זרימת הנוזלים או מחסום סינון פגום. כאשר זורעים אנדותל ואפיתל ומתחזקים את השבבים מימים 15 ואילך, חשוב לבדוק ויזואלית אם יש בועות אוויר בתעלות בכל שלב. בשבב הגלומרולוס האיזוגני, ניתן לתת מועמדים לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית כדי לבחון את הפוטנציאל הטיפולי או רמות הרעילות שלהם.

טכניקה זו פותחת כעת הזדמנויות להבין את הבסיס הגנטי של מחלת כליות אנושית ולפתח טיפולים מותאמים אישית.