Name: אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד שיטת עריכת גנים בCRISPR-Cas9 בהפטוציטים ראשוניים של עכברים באמצעות אלקטרופורציה. הטכניקה מאפשרת יצירת מודלים מחלתיים ויישומים תרפויטיים עתידיים בכבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNC קיבלה מימון ממרכז הביו-הנדסה של דרום קרוליינה להתחדשות ויצירת רקמות מענק פיילוט הנתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) של המכונים הלאומיים לבריאות, האגודה האמריקאית לחקר מחלות כבד הקרן, והחברה האמריקאית לטיפול בגנים ותאים תחת מספרי מענק P30 GM131959, 2021000920, 2022000099, בהתאמה. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותא או האגודה האמריקאית לחקר הקרן לחקר מחלות כבד. הסכימה עבור איור 1 נוצרה עם BioRender.com.

<ol><li>Pampols, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+metabolic+rare+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Inherited metabolic rare disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).</li>
<li>Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approach+to+treatable+inborn+metabolic+diseases%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).</li>
<li>Arnon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation+in+children+with+metabolic+diseases%3A+the+studies+of+pediatric+liver+transplantation+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience.</a> Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).</li>
<li>Maiorana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preemptive+liver+transplantation+in+a+child+with+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia.</a> Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).</li>
<li>OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx">https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx</a> (2019).</li>
<li>Fabris, L., Strazzabosco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+and+undiagnosed+liver+diseases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities.</a> Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).</li>
<li>Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+translational+models+for+rare+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
<li>Lima, A., Maddalo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMMs%3A+Somatically+engineered+mouse+models.+a+new+tool+for+in+vivo+disease+modeling+for+basic+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1117(2021).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seamless+modification+of+wild-type+induced+pluripotent+stem+cells+to+the+natural+CCR5Delta32+mutation+confers+resistance+to+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Hoban, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+correction+of+the+sickle+mutation+in+human+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells.</a> Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).</li>
<li>Rathbone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+delivery+of+Cas9+ribonucleoproteins+results+in+high+levels+of+gene+editing+in+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes.</a> The CRISPR Journal. , (2022).</li>
<li>Benchling [Biology Software]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2022).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li>
<li>Grompe, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrompe%2C+M+%22Hereditary+Tyrosinemia%3A+Pathogenesis%2C+Screening+and+Management%22">Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management</a>. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

השלבים המתוארים בפרוטוקול לבידוד הפטוציטים הם מאתגרים ודורשים תרגול לצורך מיומנות. ישנם מספר שלבים מרכזיים לבידוד מוצלח של הפטוציטים מהכבד. ראשית, שימור תקין של הווריד הנבוב התחתון קאווה חיוני לזלוף מלא בכבד. היעדר ההדבקה בכבד לאחר הזלוף מצביע על תזוזה של הצנתר (טבלה 1). הווריד הנבוב התחתון קאווה (פרפוזיה מדרדרת) הוכנס בהליך מכיוון שהוא פשוט ונגיש יותר מהווריד הפורטלי (פרפוזיה אנטגרדית)17,18. פרוטוקולים מסוימים משתמשים בתפרים כדי לאבטח את הצנתר<s...

IMDs של הכבד הם הפרעות גנטיות המאופיינות על ידי מחסור של אנזים כבד חיוני המעורב בחילוף החומרים שמוביל להצטברות של מטבוליטים רעילים. ללא טיפול, IMDs של הכבד לגרום לאי ספיקת איברים או מוות בטרם עת 1,2. אפשרות הריפוי היחידה לחולים עם IMDs של הכבד היא השתלת כבד אורתוטופית, המוגבלת בשל הזמינות הנמוכה של איברים תורמים וסיבוכים מטיפול מדכא חיסון בעקבות ההליך 3,4. על פי נתונים שנאספו לאחרונה על ידי הרשת לרכש והשתלת איברים, רק 40%-46% מהחולים הבוגרים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד מקבלים איבר, בעוד 12.3% מהחולים הללו מתים בזמן שהם ברשימת ההמתנה5. יתר על כן, רק 5% מכלל מחלות הכבד הנדירות יש טיפול שאושר על ידי ה- FDA6. ברור כי יש צורך קריטי בטיפולים חדשניים עבור IMDs של הכבד. עם זאת, נדרשים מודלים מתאימים למחלה כדי לפתח אפשרויות טיפוליות חדשות.
מידול מחלות אנושיות באמצעות מערכות in vitro ו - in vivo נותר מכשול לפיתוח טיפולים יעילים ולחקר הפתולוגיה של IMDs של הכבד. הפטוציטים מחולים עם מחלות כבד נדירות מאתגרים להשיג7. מודלים של בעלי חיים חיוניים לפיתוח הבנה של פתולוגיה של מחלות ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, מכשול אחד הוא יצירת מודלים מעוברים הנושאים מוטציות קטלניות. לדוגמה, ניסיונות ליצור מודלים עכבריים של תסמונת אלג'יל (ALGS) עם עוברים המכילים מחיקות הומוזיגוטיות של רצף של 5 קילובייט ליד 5′-הקצה של הגן Jag1 הביאו למוות מוקדם של העוברים8. בנוסף, יצירת מודלים של עכברים על ידי עריכת גנים בתאי גזע עובריים יכולה להיות עתירת זמן ומשאבים9. לבסוף, מוטציות יופיעו מחוץ לרקמה הממוקדת, מה שיוביל למשתנים מבלבלים שעלולים לעכב את המחקר של המחלה9. עריכת גנים סומטיים תאפשר עריכה קלה יותר ברקמת הכבד ותעקוף את האתגרים הכרוכים ביצירת מודלים באמצעות תאי גזע עובריים.
אלקטרופורציה מאפשרת העברה של CRISPR-Cas9 ישירות לתוך הגרעין על ידי הפעלת זרמי מתח גבוה כדי לחדור לקרום התא ותואמת לסוגי תאים רבים, כולל אלה שאינם מתאימים לטכניקות טרנספקציה, כגון תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים ותאי עצב 10,11,12 . עם זאת, כדאיות נמוכה היא חיסרון פוטנציאלי של אלקטרופורציה; אופטימיזציה של ההליך יכולה להניב רמות גבוהות של מסירה תוך הגבלת רעילות13. מחקר שנערך לאחרונה מדגים את ההיתכנות של אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR-Cas9 לעכברים ראשוניים ולהפטוציטים אנושיים כגישה יעילה ביותר14. אלקטרופורציה של Ex vivo בהפטוציטים יש פוטנציאל להיות מיושם כדי ליצור מודלים חדשים של עכברים עבור IMDs אנושיים של הכבד.
פרוטוקול זה מספק הליך מפורט שלב אחר שלב לבידוד הפטוציטים של עכברים מהכבד ולאחר מכן אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כקומפלקסי RNP, המורכבים מחלבון Cas9 ו-RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA), או Cas9 mRNA בשילוב עם sgRNA כדי להשיג רמות גבוהות של עריכת גנים על המטרה. בנוסף, הפרוטוקול מספק שיטות לכימות היעילות, הכדאיות והפונקציונליות של עריכת גנים בעקבות אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 להפטוציטים של עכברים שזה עתה בודדו.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל PCR 8 צינורות FLEX-FREE רצועה, מחוברים כובעים שטוחים שקופים, טבעי</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות צלחות קולגן</td><td>מתקדם ביומטריקס</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלורסנט הכל באחד</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת אנלוגית מיקסר</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART טיפים מסוננים עם קדח רחב 1,000 ומיקרו; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>מגש דיסקציה שעווה כחולה</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9 אינץ' x 6.5 אינץ' x 1/2 אינץ' + F21</td></tr><tr><td>מגרד/מרים תאים</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td> צינורות חרוטיים <td>לא פירוגניים וסטריליים</td></tr><tr><td>(15 מ"ל)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים (50 מ"ל)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>יישומי כותנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>מעוקל מספריים</td><td>קופר כירורגי</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td>100 מ"מ, סטרילי</td></tr><tr><td>חד פעמי צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35 מ"מ, סטרילי</td></tr><tr><td>Epoch Microplate ספקטרופוטומטר</td><td>BioTek מכשירים</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי פלקון (70 ומיקרו; מ)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>קופר כירורגי</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson רקמות מלקחיים</td></tr><tr><td>IV צנתרים&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0.75 בסט</td></tr><tr><td>עירוי IV</td><td>בקסטר</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 מיני צנטריפוגה</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>מחטים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b מכשיר</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>תוכנית T-028 שימשה לאלקטרופורציה בהפטוציטים של עכברים</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>מאסטרפלקס</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>10 עד 60 סל"ד; 90 עד 260 וולט</td></tr><tr><td>AC צינורות משאבה מדויקת</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 רגל, סיליקון</td></tr><tr><td>צלחות תרבית פרימריה</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>353846</td><td>לוחות תרבית רקמות המכילות חנקן</td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית (25 מ"ל)פישר</td> <td>סיינטיפיק</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 מ"ל, סטרילי</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific דיוק מיקרו-מעבד נשלט 280 סדרה, 2.5 ליטר</td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>בקמן קולטר AMPure XP, 5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מטריג'ל מטריקס</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>גלוקוז נמוך, פירובט</td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>תחזוקת הפטוציטים בינוני (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי הפטוציטים בינוני (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אלבומין ELISA ערכת</td><td>פישר Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>ערכת נוקלאופקטור הפטוציטים</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>ללא סידן או מגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>פרקול (תמיסת PVP)</td> <td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מחזורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה פרמאונט בינונית</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract תמיסת מיצוי DNA</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>שיף' s מגיב פוקסין-סולפיט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>פנול אדום</td></tr><tr><td>Vybrant בדיקת כדאיות תאי MTT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td><תמיסת זלוף חזק>ה 1 (pH 7.4, מעוקר מסנן)&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td>יציב ב-4 מעלות; C למשך</td></tr><tr><td>חודשיים EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>Complete עד 200 מ"ל</td></tr><tr><td>EGTA (0.5 מ')</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7.3, 1 מ')</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td><תמיסת פרפוזיה חזקה>2 (pH 7.4, מעוקר בפילטר)&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td>יציב ב-4 מעלות; C למשך חודשיים</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2 שעות<תת>2</תת>0 (1.8 מ"מ</td>)<td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 ומיקרו; L של 1 מיליון מלאי&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>שלם עד 200 מ"ל</td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7 ש<תת>2</תת>0 (0.8 מ"מ)</td><td>סיגמא</td><td>30391-25G</td><td>160 ומיקרו; L של 1 מיליון מלאי</td></tr> <tr><td><חזק>תמיסת זלוף 3&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td>מוכן טרי לפני השימוש</td></tr><tr><td>תמיסה 2</td><td></td><td></td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0.094 יחידות וונש/מ"ל</td></tr><tr><td><קוקטייל הרדמה חזק>עכבר&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצפרומזין</td><td></td><td></td><td>0.25 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי</td></tr><tr><td>קטמין</td><td></td><td></td><td>7.5 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td></td><td></td><td>1.5 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי</td></tr> <tr><td>תוכנה</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: מעקב אחר Indels על ידי פירוק</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים cas9 ו-mrna לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים ולאחר מכן אספקה בתיווך אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) ו-mRNA בתיווך אלקטרופורציה. הפטוציטים ראשוניים של עכברים בודדו בשיטת זלוף מדרדרת בת שלושה שלבים וכתוצאה מכך הופקו תשואות גבוהות של עד 50 × 106 תאים לכל כבד וכדאיות התאים של >85%. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לציפוי, צביעה וגידול הפטוציטים. התוצאות מצביעות על כך שאלקטרופורציה מספקת יעילות טרנספקציה גבוהה של 89%, כפי שנמדדה על ידי אחוז התאים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) והכדאיות התאית הצנועה של >35% בהפטוציטים של עכברים.
כדי להדגים את התועלת של גישה זו, CRISPR-Cas9 המכוון לגן הידרוקסיפנילפירובט דיאוקסיגנאז התחשמל לתוך הפטוציטים ראשוניים של עכברים כעריכה גנטית הוכחה עקרונית כדי לשבש גן טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית (IMD) של הכבד. עריכה גבוהה יותר על המטרה של 78% נצפתה עבור RNPs לעומת 47% יעילות עריכה עם mRNA. הפונקציונליות של הפטוציטים הוערכה במבחנה באמצעות בדיקת אלבומין שהצביעה על כך שאספקת CRISPR-Cas9 כ-RNPs ו-mRNA גורמת לכדאיות דומה של תאים בהפטוציטים ראשוניים של עכברים. יישום מבטיח לפרוטוקול זה הוא יצירת מודלים של עכברים למחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על הכבד.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים הניתנים לציפוי מהכבד התהליך הכולל של זלוף בכבד ובידוד הפטוציטים מודגם באיור 1. בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי C57BL6/6J בני 8-10 שבועות. ההליך צפוי להניב 20-50 × 106 תאים לכל עכבר עם כדאיות של בין 85% ל-95%. אם הכדאיות היא &lt;70%, יש לעקוב אחר טיפול פרקול כדי להסיר תאים מתים. הפטוציטים מבודדים טריים צריכים להיות מצופים על צלחות תרבית רקמה המכילות קולגן I או המכילות חנקן. תוך 3-12 שעות מהציפוי, הפטוציטים צפויים להיצמד לצלחת, והמורפולוגי...

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים מהכבד ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים ו-mRNA כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית של הכבד. השיטות המתוארות מביאות לכדאיות גבוהה ולרמות גבוהות של שינוי גנים לאחר אלקטרופורציה.

אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שמדובר בגישה קלה, מהירה וניתנת לשחזור לעריכת גנים בהפטוציטים ראשוניים של עכברים כדרך ליצור מודלים של מחלות in vitro ו- in vivo. באמצעות הטכניקה שלנו, ייתכן שניתן יהיה להפיל גן מטרה בהפטוציטים מבודדים ולאחר מכן להשתיל אותם בחזרה לחולה, כדי להחליף תאים חולים בהפטוציטים ערוכים גנטית חוקרים לא מנוסים עשויים להיאבק עם קנולציה ושמירה על קטטר יציב לאורך כל הזליפה. מומלץ למשתמשים לקרוא בעיון ולתרגל את ההליך ואת שיטות פתרון הבעיות לפני תחילת העבודה.בהדגמת זליגת הכבד ובידוד הפטוציטים יהיו טינה פרקר מנהלת מתקן קליני ואיליידה אטס, עוזרת מחקר לתואר שני. הליך האלקטרופורציה יודגם על ידי קאלי סטיוארט, עוזרת מחקר לתואר שני מהמעבדה שלי. תחת מטוס כירורגי של הרדמה.מתחילים את זליגת הכבד על ידי ביצוע חתך רוחבי בצורת U בעור הבטן באמצעות מספריים, ומרחיבים את החור דרך הצדדים. ממשיכים לפתוח את העור לכלוב הצלעות. באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן עד צלעות.נזהר לא לנקב איברים. הזז את המעיים לצד ימין באמצעות גב מלקחיים או משטח קהה של מספריים. זהה את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון.הפעל את המשאבה כדי לשטוף תמיסת זלוף שחוממה מראש דרך הצנתר. יש לעצור את המשאבה ולהוציא את הקטטר. לאחר מכן להחדיר את קצה המחט המחוברת לקטטר לתוך הווריד הנבוב התחתון בזווית של 10 עד 20 מעלות לווריד, להסיר את המחט מהקטטר.לאחר מכן דחף בעדינות את הקטטר לתוך הווריד בתנועה מקבילה לווריד. חבר את הצינורות לקטטר מבלי להזיז את הקטטר עוד יותר לתוך הווריד. הפעל את המשאבה עם קצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.חפש את הכבד מיד הופך חיוור כסימן כי הזלוף מוצלח. גזור את וריד הפורטל באמצעות מספריים. הגדל בהדרגה את קצב הזרימה לחמישה מיליליטר לדקה.לאחר תמיסת הזלוף שלוש זורם דרך בזהירות לפקח על גמישות הכבד. כדי לקבוע אם הכבד התרכך, לחץ בעדינות על הכבד עם צמר גפן או מלקחיים ובדוק אם נוצרות כניסות על הכבד. היזהרו שלא לחדור יתר על המידה כדי למנוע אובדן כדאיות התא.ברגע שהכבד מתרכך לאחר 30 עד 50 מיליליטר של תמיסת זלוף שלוש זרמו דרך, עצרו את המשאבה, הסירו את הקטטר ואת כיס המרה. נזהר לא לשפוך את תוכנו. ואז בזהירות לנתח את הכבד.הכניסו את הכבד לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה DME M קר כקרח עם 10% FBS בינוני. סובבו את צלחת הפטרי בעדינות כדי להסיר קרישי דם אפשריים. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי חדשה המכילה DME M קר כקרח ומדיום 10% FBS.כדי לשחרר תאים מכמוסת הכבד, הניחו את צלחת הפטרי על קרח ואז באמצעות שני זוגות מלקחיים סטריליים, קרעו בעדינות את קפסולת הכבד על כל האונות. סובבו בעדינות את הכבד במדיום באמצעות מרים תאים כדי לשחרר את ההפטוציטים. המשך בתנועה זו עד שהכבד הופך קטן מאוד וההשעיה הופכת חומה ואטומה.הסר את שאריות רקמת הכבד מהצלחת ובאמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר שנקבעה למהירות נמוכה, העבר בזהירות את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר מקורר מראש על קרח ומצויד במסננת תאים של 100 מיקרומטר. הוסיפו DMEM קר כקרח, ו-10% FBS בינוני לצלחת פטרי כדי לשטוף ולאסוף את התאים הנותרים מפני השטח. לאחר מכן, העבר לצינור החרוטי של 50 מיליליטר.חזור על שלב זה עד שכל התאים נאספים. כדי לשטוף ולטהר את ההפטוציטים מתאים שאינם פרנכימליים, צנטריפוגה של התאים שנאספו בצינור החרוטי של 50 מיליליטר ב-50 RCF בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בהאטה נמוכה או ללא הפסקות. השליכו את הסופר-נאטון המכיל פסולת ותאים שאינם פרנכימליים.לאחר מכן השהה מחדש את הכדור בשאריות הסופר-נטון על ידי סיבוב עדין של הצינור. לאחר ההשעיה מחדש של גלולה להוסיף 30 מיליליטר של DMEM קר כקרח טרי ו 10% FBS בינוני. התחל להכין את מדיית המצעים, התאים ומכשיר האלקטרופורציה של CRISPR CAS 9 על-ידי הפעלת לחצן ההפעלה בהתקן האלקטרופורציה.לאחר מכן הגדר את תוכנית האלקטרופורציה על ידי לחיצה על לחצן X ולאחר מכן על לחצן החץ למטה עד שהתוכנית T 0 28 מופיעה על המסך. הכין את בארות היעד עבור hepatocytes אלקטרופוציה על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של PM לשש צלחות מצופות קולגן היטב. דגירה של הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש.בצינורות רצועה מפוצלים של PCR, הכינו את קומפלקסי CAS 9 RMP ו-mRNA כמתואר בכתב היד של הטקסט. יש לאחסן את תערובת ה-mRNA SG RNA על קרח עד לאלקטרופורציה. בנפרד, הכינו צינור המכיל מיקרוגרם אחד של E G F P mRNA כדי לאמת אלקטרופורציה מוצלחת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.צנטריפוגה של תגובת האלקטרופורציה ב-100 RCF למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנאטון מכדור התא והוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוקלאופקציה לכל תגובה לאורך דופן הצינור. להשעות מחדש את ההפטוציטים בתמיסת האלקטרופורציה על ידי נדנדת הצינור בעדינות ביד.לאחר שהפטוציטים מתפזרים באופן שווה בתמיסת האלקטרופורציה, העבירו 100 מיקרוליטרים של ההשעיה של ההפטוציטים לצינורות הרצועה המכילים את תשעת הקומפלקסים של CAS. מעבירים את תוכן הרצועה היטב לכלי אלקטרופורציה. הנח את כלי הנוקליאו-וטרינר לתוך החריץ במכשיר האלקטרופורציה.אלקטרופוט ההפטוציטים על ידי לחיצה על כפתור X. לאחר האלקטרופורציה, המתן עד שיופיע מסך במכשיר שאומר:אוקיי. לחץ שוב על כפתור X והסר את הספינה.לדגור את הכלי החשמלי על הקרח במשך 15 דקות. הוסף 500 מיקרוליטרים של PM חמוש מראש לכלי האלקטרופורציה. מעבירים 300 מיקרוליטרים של תגובת האלקטרופורציה לכל יעד היטב על הצלחת שחוממה מראש.לדגור את הצלחות במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו את מטריצת הממברנה למדיום תחזוקת הפטוציטים הקרים כקרח וערבבו על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. הסר את המדיום מהבארות המיועדות לניתוח עריכת גנים 24 שעות לאחר ציפוי התאים.מזלפים את תערובת הכיסוי באיטיות על גבי התאים ומחזירים את הצלחת לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ב-24 שעות לאחר הציפוי, מעבירים את המדיום המותנה מהבאר המיועדת למבחני MTT ואלבומין ומאחסנים בצינור מיקרו-פוגה עד שהם מוכנים לביצוע בדיקת האלבומין. המשך בניתוח של פעילות CAS תשע על ידי חילוץ הדנ"א הגנומי והגדרת ה- PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט.תוך 3 עד 12 שעות מהציפוי ההפטוציטים נדבקו לצלחת ומורפולוגיה של התא הניחה מראה מצולע או משושה טיפוסי תוך 24 שעות טוהר התאים המבודדים אומת באמצעות צביעת גליקוגן באמצעות מגיב משמרת חומצה תקופתית 24 שעות לאחר הציפוי. הציטופלסמה של ההפטוציטים המוכתמים הופיעה מג'נטה. ההפטוציטים צולמו 24 שעות לאחר האלקטרופורציה ובממוצע, 89.8% מההפטוציטים היו חיוביים ל-GFP.בשלושה ימים לאחר האלקטרופורציה CAS תשעה המושרים בלוקוס HPD שם נותחו והתוצאות הראו על אינדלים מטרה של 47.4% בהפטוציטים שעברו אלקטרופוטציה עם CRISPR Cas תשעה mRNA ו-78.4% אינדלים עבור CAS תשעה RNP. בדיקת MTT הראתה כדאיות של 35.4 ו-45.9% בהפטוציטים שטופלו ב-CRISPR Cas תשעה mRNA ו-R N P.בהתאם לתוצאות ה-MTT, רמות האלבומין המנורמל היו 31.8% בהפטוציטים שטופלו ב-CAS 9 RNA ו-34.5% ב-CAS nine r p. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי cannulation תקין משפיע על כל השלבים המאוחרים יותר ואת ההצלחה של ההליך.לאחר הליך זה, ניתן להשתיל את ההפטוציטים ועכברים לחקור את החריטות שלהם. יתר על כן, ניתן לחלץ את הדנ"א הגנומי של הפטוציטים המצופים כדי לנתח את היעילות והספציפיות של עריכת CAS 9.

electroporation-mediated-delivery-cas9-ribonucleoproteins-mrna-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג'ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

למד שיטת עריכת גנים בCRISPR-Cas9 בהפטוציטים ראשוניים של עכברים באמצעות אלקטרופורציה. הטכניקה מאפשרת יצירת מודלים מחלתיים ויישומים תרפויטיים עתידיים בכבד.

אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה

גלה סרטונים נוספים