תרביות נוירונים בהיפוקמפוס כדי לזהות ולחקור נוגדנים פתוגניים חדשים המעורבים בדלקת המוח אוטואימונית

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא איפשר לנו לזהות אם דגימת מטופל הכילה נוגדנים פתוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון ביכולתה להבדיל בין תגובתיות בין פני השטח לבין אנטיגנים תוך תאיים, שלא ניתן להבחין בהם בקלות בשיטות אחרות. תאי העצב התרבותיים בהיפוקמפוס משמשים לזיהוי נוגדנים חדשים.

הזיהוי של נוגדנים חדשים אלה מאפשר בסופו של דבר ייזום של מונותרפיה ספציפית כדי לשפר את תוצאות המטופלים. טכניקה זו חשובה משום שניתן להרחיב אותה לכל תחום המחלות הקשורות לנוגדנים פתוגניים המופנים לחלבוני פני השטח העצביים. מחזיק את ראש העובר עם מלקחיים מעוקלים עדינים, לחדור את המסלולים עם זוג מלקחיים ישרים עדינים בזווית של 45 מעלות.

לאחר מכן שחררו את המלקחיים המעוקלים העדינים. בעזרת מספריים ניתוח, לנתח את העור ואת הגולגולת החל מן העצם העורפית אל העצם הקדמית. לאחר מכן הסר את המוח עם זוג מלקחיים מעוקלים עדינים ואסוף אותו בצלחת שישה סנטימטרים עם תרדמה פלוס B27.

לאחר שהמוחות מכל העוברים מתאוששים, השתמשו במלקחיים הישרים העדינים כדי להפריד את הטלנצפלונים. לאחר מכן, הכינו צלחת באורך 10 ס"מ על ידי הנחת טיפות של תרדמה פלוס B27 במרחקים של סנטימטר אחד במעגל, והניחו טלנספלון אחד לכל טיפה כדי לדמיין דרך היקף החיתוך בהגדלה של 1.25 X. תוך כדי עבודה מתחת למיקרוסקופ, הסר בזהירות את התלמוס, וקלף את קרומי המוח כדי לדמיין טוב יותר את ההיפוקמפוס.

לאחר מכן לנתח את ההיפוקמפוס עם מספריים קפיץ מדויק. והניחו אותו בצלחת של 3.5 ס"מ עם תרדמה פלוס B27 ואיסטראט שניים. חזור על ההליך כדי לאסוף את כל ההיפוקמפי.

עבור דיסוציאציה אנזימטית של ההיפוקמפוס, להוסיף מיליליטר אחד של 2.5% טריפסין בצינור 50 מיליליטר המכיל את ההיפוקמפי. לאחר הבאת נפח הצינור לחמישה מיליליטר עם HBSS, לדגור את הצינור במשך 15 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לדלל עוד יותר את הטריפסין, להוסיף 10 מיליליטר של HBSS שחומם מראש, ולהניח את הצינור בחזרה באמבט המים, להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להעביר את ההיפוקמפי המופיע כמסת ריר לצינור של 50 מיליליטר. ודגרה את הרקמה עם שישה מיליליטר של HBSS שחומם מראש במשך חמש דקות, כפי שהודגם. כדי לנתק את הרקמה באופן מכני, להעביר את מסת ההיפוקמפוס לצינור שני מיליליטר עם תחתית חרוטית.

לאחר הוספת מיליליטר אחד של מדיית DMEM שחוממה מראש, הומוגניות הכדור עם מיקרו פיפטה של 1000 מיקרוליטר על ידי שאיפה עדינה למעלה ולמטה. תוך הקפדה שלא ליצור בועות, חזור על שאיפת העלייה והירידה 10 עד 20 פעמים עם פיפטה זכוכית משוכה מראש עם הקצה שלה במגע עם החלק התחתון החרוטי של הצינור עד שהתערובת שקופה. ספרו את התאים לפני שתחלקו אותם באופן שווה על צלחת באורך 3.5 ס"מ עם תנועות טלטול מוצלבות.

לאחר שתסיים, מניחים את המנה באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני. עבור חיזוק חיסוני פלואורסצנטי של 14 יום בתאי מבחנה, יש להוסיף את הדגימה המכילה נוגדנים נגד NMDAR לכיסויים ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר שעה, התייחסו לדגימה עם 4% פורמלדהיד ו-PBS כתמיסת קיבוע בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן לשטוף את דחף הדגימה עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, ולאחר מכן תוספת של נוגדנים משניים עז אנטי אדם Alexa Fluor 488 בדילול אחד עד 1000 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרכב את תלושי הכיסוי המכילים את הדגימה עם מדיום הרכבה נוזלי ושאף את כל הנוזלים שנותרו. דמיינו את הנוירונים עם הדמיה פלואורסצנטית.

להדמיית סידן, יש להשתמש בתאי מבחנה במשך 14 עד 18 ימים שגודלו על גבי תלושי כיסוי. לפני ההדמיה, טפלו בתאים באמצעות קידוד וקטור נגיפי עבור pAAV2 CAG GCaMP 5G ב-2.5 כפול 10 עד עותקי הגנום העשירי למיליליטר במשך חמישה עד שבעה ימים. יום אחד לפני ההדמיה, לדגור את התאים עם דגימת המטופל במשך 24 שעות.

ביום ההדמיה, הכינו את ההתקנה והגדירו את תא התא במיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס. מלאו את הנתיב במים מזוקקים, החדירו בו 5% פחמן דו חמצני כדי לשמור על התנאים הפיזיולוגיים של התא. לאחר כיסוי התאים בתמיסה פיזיולוגית חוץ-תאית, העבירו אותם לתא התא במיקרוסקופ.

הוסיפו 10 מיקרומולרים NBQX כדי לחסום את קולטני AMPA ו-KA, ודמיינו את תגובת הקולטן של NMDA. רכוש את הסרט של ארבע דקות עם המסגרות שנרשמו כל 100 אלפיות השנייה. זמן קצר לאחר תחילת הרכישה, להוסיף פתרון גירוי למנה.

לאחר הגירוי, חלצו את האות הפלואורסצנטי לאורך זמן מהתרבית שהוחדרה עם הבקרה ודגימות נוזל השדרה המוחי של המטופל או דגימות CSF באמצעות תוכנת עיבוד כגון Image J.It נצפתה שהתאים ביום אחד במבחנה היו מפוזרים באופן שווה ונדבקו לצלחת עם למלה המתפתחת סביב גוף התא ונויריטים קלים מתחילים להתרחב. לאחר כמה ימים בתרבית, הנוירוריטים התארכו למרחק קצר והתאים הראו קיטוב משמעותי. הרשת העצבית המשיכה לגדול והפכה מורכבת.

בגיל 18 יום, תאי העצב היו בוגרים, מחוברים זה לזה ובנו את הרשת העצבית. התמונות הפלואורסצנטיות המייצגות מראות נוירונים בוגרים בגיל 18 יום באמצעות סמנים סלקטיביים. הדגירה של התרביות עם דגימות החולה יצרה אות פלואורסצנטי אינטנסיבי שכן הוא מכיל את הנוגדנים האוטומטיים שזיהו את קולטן NMDA שנמצא על פני השטח של הנוירונים.

לעומת זאת, דגימות הבקרה לא הפיקו אות פלואורסצנטי כאשר ניתנו לתרביות העצביות. היישום של NMDA הגביר את עוצמת הפלואורסצנציה כפי שצוין על ידי שינוי בפלואורסצנציה הירוקה התוך-תאית. כאשר הגירוי הופעל, הנוירונים שטופלו בדגימת CSF של הבקרה הראו הבדל גבוה יותר בעוצמת הפלואורסצנציה מאשר התאים שטופלו בדגימת CSF של המטופלים.

זיהוי הרכוש ונתיחת ההיפוקמפוס קובעים את טוהר התרבויות. צבירה של תאים היא גורם מפתח, במיוחד כאשר משתמשים בתרביות למטרות הדמיה. בנוסף, ניתן להשתמש בתאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית כדי לזהות נוגדנים חדשים ואת אנטיגני המטרה שלהם בשילוב עם מיצוי חיסוני וטכניקות ספקטרומטריית מסה.

טכניקה זו אפשרה אפיון של קטגוריה חדשה של מחלות בתיווך נוגדנים. לכן, הוא חיוני בחקר התחום החדש של ננו-אימונולוגיה.