Name: בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו בידוד חלבונים מושרים מפנים עוברי עכבר ותאי מזנכיים פאלטליים לניתוח פוספופרוטאין. שיטה זו שומרת על מצב זרחון ומאפשרת חקר מנגנוני פיתוח קרניו-פאציאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

129S4 עכברים היו מתנה מד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. עבודה זו נתמכה בכספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)/המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (NIDCR) R01 DE027689 ו- K02 DE028572 ל- K.A.F., F31 DE029976 ל- M.A.R. ו- F31 DE029364 ל- B.J.C.D.

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Chai, Y., Ito, Y., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+and+its+functional+significance+in+regulating+the+fate+of+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22TheInternational+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+regulating+neural+crest+development+one+phosphate+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).</li>
<li>Xavier, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+receptor+function+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog receptor function during craniofacial development.</a> Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).</li>
<li>Grimsrud, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-6+is+an+autocrine+stimulator+of+chondrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).</li>
<li>MacArthur, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-8+isoforms+activate+receptor+splice+forms+that+are+expressed+in+mesenchymal+regions+of+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development.</a> Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).</li>
<li>Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-8+determines+rostral-caudal+polarity+in+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch.</a> Development. 126 (1), 51-61 (1999).</li>
<li>Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+inactivation+demonstrates+that+FGF8+is+required+for+cell+survival+and+patterning+of+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch.</a> Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).</li>
<li>Tabler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuz+mutant+mice+reveal+shared+mechanisms+between+ciliopathies+and+FGF-related+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes.</a> Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).</li>
<li>Pakvasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+Its+essential+roles+in+bone+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development.</a> Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).</li>
<li>Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-A+and+PDGFR-alpha+regulate+tooth+formation+via+autocrine+mechanism+during+mandibular+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro.</a> Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).</li>
<li>Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDGF+receptor+mutation+in+the+mouse+%28Patch%29+perturbs+the+development+of+a+non-neuronal+subset+of+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells.</a> Development. 115 (1), 133-142 (1992).</li>
<li>Orr-Urtreger, A., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-A+and+its+receptor+are+expressed+in+separate%2C+but+adjacent+cell+layers+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo.</a> Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Pdgfc+gene%3A+dynamic+expression+in+embryonic+tissues+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis.</a> Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 103 (2), 211-225 (2000).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX2-modifying+enzymes%3A+therapeutic+targets+for+bone+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).</li>
<li>Firulli, B. A., Firulli, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+penetrant+cardiac+neural+crest+defects+in+Hand1+Phosphomutant+mice%3A+Dimer+choice+that+is+not+so+critical%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical.</a> Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).</li>
<li>Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+regulates+phosphorylation+and+osteogenic+activity+of+Dlx3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).</li>
<li>Jeong, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+phosphorylates+and+regulates+the+function+of+Dlx5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+kinase+II+regulates+Dlx5+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).</li>
<li>Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+craniofacial+development%3A+From+receptor+signaling+to+transcriptional+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).</li>
<li>Schock, E. N., LaBonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+sox%3A+Diverse+roles+for+sox+transcription+factors+during+neural+crest+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development.</a> Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).</li>
<li>Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srsf3+mediates+alternative+RNA+splicing+downstream+of+PDGFRalpha+signaling+in+the+facial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme.</a> Development. 148 (14), (2021).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+by+reversible+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural crest migration.</a> Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).</li>
<li>Kindberg, A. A., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+boundary+formation+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and boundary formation in craniofacial development.</a> Genesis. 57 (1), 23271(2019).</li>
<li>Faundes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raine+syndrome%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Raine syndrome: an overview.</a> European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+time-lapse+imaging+of+primary+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cells+to+analyze+collective+movement+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/">https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/</a> (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+alteration+of+protein+phosphorylation+during+postmortem%3A+implication+in+the+study+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation.</a> Scientific Reports. 5, 15709(2015).</li>
<li>Sharma, S. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+of+phosphatase+inhibitors+during+Western+blotting+enhances+signal+detection+with+phospho-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies.</a> Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+Western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Hooper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+facial+development%3A+contributions+of+ectoderm+and+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme.</a> Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).</li>
<li>Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+contains+a+platelet-derived+transforming+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serum contains a platelet-derived transforming growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).</li>
<li>Swaisgood, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+update+of+casein+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Review and update of casein chemistry.</a> Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+Western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).</li>
<li>Salinovich, O., Montelaro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+staining+and+peptide+mapping+of+proteins+transferred+to+nitrocellulose+after+separation+by+sodium+dodecylsulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים לחקור אירועי איתות קריטיים התלויים בזרחון במהלך התפתחות קרניופציאלית באופן חזק וניתן לשחזור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה המבטיחים איסוף נכון של נתונים וניתוח תוצאות. בין אם מבודדים פוספופרוטאינים מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכים פאלטליים בתרבית, חובה לנוע במהירות וביעילות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על הקרח כאשר הם מסומנים. הטמפרטורה הנמוכה של הקרח מאטה את הפעילות המטבולית בתאים, ובכך מגנה על חלבונים זרחניים מפני פעילות פוספטאז38 ושומרת על ...

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים - מדפי palatal המשני - מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.51.
שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים 2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH5. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג'וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים6, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע7, 8,9,10. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג'וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים11. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל12. לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)18,19.
האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25, ו-Sox926 הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעיניתשלו 27. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ"א ו/או על ספציפיות הרצף28. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד31. באמצעות הנ"ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.
אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 - הן ראשוניים32 והןמונצחים 33 . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים1, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו - in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.
בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק למיני אמבטיה יבשה</td> מוצרי <td>מחקר International Corp</td><td>400783</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה ChemiDoc XRS+ עם תוכנת Image Lab</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>כימילומינסנציה צילום</td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור, מעיל אוויר</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח לוח, 11 x 13 בפישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה, 4 ג'ל, למיני ג'לים טרומיים עם מודול מיני טרנס-בלוט</td><td>ביו-ראד</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 5415 D עם רוטור F45-24-11 (אפנדורף)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr>מיני מוצרי מחקר<td>אמבטיה יבשה</td><td> International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח למחבת קרח מלבנית SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>, מקסי 9 L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו Stemi 508 עם מעמד K LAB, LED RING LIGHT</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td> טיימר <td>מיקרוסקופ מנתח</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>אקדח צינור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>קופסת כתמים מערבית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9358182<</td><td></td></tr><tr><td>חזק> חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים, 6 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים, 12 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>מרימי תאים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים, פוליפרופילן, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>כף עובר</td><td>Fine Science</td><td>Tools 10370-17</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 0.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>פיפט פסטר, 5.75 אינץ'</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>פסטר, 9 אינץ'</td> <td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 10 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 35 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>, שקיות, שקוף, פוליאתילן בטנה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>פישר Scientific</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Semken</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11008-13</td><td></td></tr><tr><td>נורת לטקס קטנה, 2 מ"ל</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק, 25 מ"מ, 0.2 &mu; m גודל נקבוביות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>מזרק עם קצה לואר, 10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>צינור העברה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>ידית פתיחת קלטת כתם מערבית</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 3MM chr נייר כרומטוגרפיה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td><חזק> ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% ג'ל חלבון טרומי, 10 בארות, 30 ומיקרו; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-גליצרופוספט דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5422-25G</td><td>ריכוז מלאי 1 M</td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, חלק V, נבדק הלם חום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>קוקטייל מעכב מיני פרוטאז שלם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11836153001</td><td>ריכוז מלאי 25x</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון DC II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, נוגדן ראשוני בטא טובולין חד שבטי לעכבר, תרכיז 0.1 מ"ל</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>E7</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>מצע כתמים מערבי ECL</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PI32106</td><td>טווח פיקוגרמה נמוך</td></tr><tr><td>ECL מצע כתמים מערבי ECL</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>טווח פמטוגרמה נמוך</td></tr><tr><td>מאגר אלקטרופורזה, 5 ליטר</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1610772 ריכוז מלאי 10x</td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה, 1 ליטר</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, Di Na מלח דיהידר. (Powd גבישי / אלקטרופור.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מאופיין, ממקור בארה"ב, 500 מ"ל</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול (מוסמך ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד HRP, עז נגד עכבר IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד HRP, עז אנטי ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20,000</td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוכלורית, 6N (מוסמך)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Igepal Ca - 630 חומר ניקוי לא יוני</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19859650</td><td>Nonidet P-40</td></tr><tr><td>Isopropanol (HPLC)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>ריכוז מלאי 200 מ"מ</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) נוגדנים ראשוניים</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9102S</td><td>1:1,000; anti-Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB ליגנד רקומביננטי</td>, <td>חולדה פישר סיינטיפיק</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>קולטן PDGF ובטא;</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> נוגדנים ראשוניים <td>3169S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>גיבקו</td><td>15140122</td><td>ריכוז מלאי 100 יח'/מ"ל, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פניל-מתאןסולפוניל פלואוריד, 99%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>AC215740100-PMSF; ריכוז מלאי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>פוספו-p44/42 MAPK (Erk1/2) טכנולוגיית</td><td>איתות תאי</td><td>נוגדנים ראשוניים 9101S</td><td>1:1,000, אנטי-פוספו-Erk1/2</td></tr><tr><td>קולטן פוספו-PDGF ואלפא; /קולטן PDGF ובטא;</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> נוגדנים <td>ראשוניים 3170S</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (גבישים לבנים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (גבישים לבנים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP362-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>SDS solution, 10%</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (גבישי/ביולוגי, מאושר)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד (אבקה/מאושר ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td>NaF; מנה לשימוש חד פעמי; ריכוז מלאי 1M</td></tr><tr><td>נתרן אורתוונדאט, 99%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC205330500</td><td>Na3VO4; ריכוז מלאי 100 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (גרגירי או אבקה/מאושר ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Tissue Culture, PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>מאגר העברה, 5 ליטר</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td>ריכוז מלאי 10x</td></tr><tr><td>בסיס טריס (גבישים לבנים או אבקה גבישית/ביולוגיה מולקולרית)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Western blot סמן משקל מולקולרי</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female 129S4 עכברים</td><td></td><td></td><td>מתנת ד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה ע"ש אייקן בהר סיני</td></tr></tbody></table>

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. כאן מסופקות שתי דוגמאות להקשרים פיזיולוגיים-רלוונטיים שבאמצעותם ניתן לחקור זרחון של חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכבר תרבית שמקורם במדפי פלטה משניים E13.5. כדי להתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של פוספופרוטאינים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות ניתנות לניתוח וכימות נכונים של פוספופרוטאינים בעקבות כתמים מערביים של ליזאטים של חלבון של תאים שלמים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

כאשר מנסים לאפיין את הזרחון של חלבונים שבודדו מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכיים פאלטליים בתרבית, התוצאות הייצוגיות יחשפו באופן אידיאלי פס מובחן וניתן לשחזור בעקבות כתם מערבי עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין הפועל בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה (איור 3) ). עם זאת, אם מתרחשת זרחון נרחב של החלבון, ייתכן שתהיה תזוזה קלה כלפי מעלה של רצועת הפוספופרוטאין בהשוואה לזו של רצועת החלבון הכוללת. יתר על כן, אם קיימים איזופורמים מרובים של חלבון ברקמה, שכל אחד מהם הוא זרחן, או שהחלבון נת...

הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל תובנה רבה יותר על הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים. פרוטוקול זה מתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים משני הקשרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, תהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכים עובריים שעברו תרבית של עכברים. זה הכרחי לנוע במהירות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על קרח ולהשתמש במעכבי פוספטאז בכל מאגרי הליזיס כדי לשמור על שלמותם של חלבונים זרחניים.כדי להתחיל, הניחו את גוף העכבר על לוח ניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, וריססו את בטן העכבר ב-70% אתנול. לאחר מכן פתח את חלל הבטן על ידי צביטה והרמת העור הקדמי לפתח הנרתיק עם מלקחיים ישרים של Semken. לאחר מכן, חתכו את העור המורם בשכבות תחתיות עם מספריים כירורגיים בעלי להב ישר בזווית של 45 מעלות משני הצדדים כדי ליצור צורת V המשתרעת על כל משטח רוחבי בערך באמצע הדרך בין ארבעת הגפיים והגפיים האחוריות.באמצעות מלקחיים Semken, לאחוז באחת הקרניים הרחם ולחתוך מתחת oviduct ומעל צוואר הרחם עם מספריים כירורגיים. כדי לאפשר הסרה מלאה של קרן הרחם, חתכו את המסומטריום, ואז העבירו את קרן הרחם המנותקת ל-10 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. באופן דומה, הסר את קרן הרחם השנייה בצד הנגדי של חלל הבטן.לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי באורך 10 ס"מ המכילה את שתי קרני הרחם על קרח. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, נתחו בזהירות כל עובר מקרני הרחם עם מלקחיים עדינים של דומונט 5. ואז לאט לאט למשוך את המיומטריום, את ההחלטה ואת הכוריאון.לאחר מכן, קרעו והסירו את האניון השקוף יחסית המקיף את העובר ונתקו את חבל הטבור המחבר את העובר לשליה. לאחר מכן העבירו כל עובר מנותח ל-2.5 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בבאר בודדת של צלחת תרבית תאים בת 12 בארות על קרח באמצעות צינור העברת פלסטיק חתוך. הכינו שלוש צלחות פטרי באורך 10 ס"מ המכילות 10 מיליליטרים של PBS היסטולוגיים ושמרו אותן על קרח לשימוש בסיבוב בין עוברים.לאחר מכן העבירו עובר אחד מבאר בודדת של צלחת תרבית התאים בת 12 הקידוחים לאחת מצורות פטרי באורך 10 ס"מ עם היסטולוגיה PBS על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה. תחת מיקרוסקופ הניתוח, הפרד כל תהליך מקסילרי מהפנים באמצעות המלקחיים העדינים על ידי ביצוע תחילה חתך בצד הקדמי של תהליך מקסילרי אחד לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין תהליך האף הלטרלי בתהליך המקסילרי בתהליך המקסילרי. לאחר מכן, חותכים את הצד האחורי של התהליך המקסילרי לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין התהליך המקסילרי לבין התהליך המנדיבולרי.לאחר מכן הפרד לחלוטין את התהליך המקסילרי על ידי ביצוע חיתוך אנכי מהצדדים הקדמיים לאחוריים של התהליך המקסילרי בצד העין של התהליך המקסילרי שבו ההזחות הטבעיות המוזכרות לעיל מסתיימות. באמצעות פיפטת פסטר של תשעה אינץ' עם נורת לטקס קטנה של שני מיליליטר, מעבירים את זוג התהליכים המקסילריים המנותחים בטיפה קטנה של כ-30 מיקרוליטרים של PBS היסטולוגי לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על קרח. לאחר מכן העבירו את זוג רקמות התהליך המקסילרי לצינור מיקרו-צנטריפוג מסומן של 1.5 מיליליטר על קרח באמצעות פיפטת פסטר, ובכך למזער את העברת ההיסטולוגיה PBS.יתר על כן, הסר כל עודף היסטולוגיה PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם פיפטה פסטר. הוסיפו 0.1 מיליליטר של חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח. ואז פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter.לאחר מכן, מערבולת למשך 10 שניות, ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter, תוך הימנעות יצירת בועות. דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים תוך כדי סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור. לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר.ראשית, שאפו את המדיום מתאי המזנכים הפאלאטאליים העובריים של העכבר באמצעות פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחוברת למערכת ואקום. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS תרבית רקמה קרה כקרח ולהטות את הצלחת הצידה במהלך הכביסה האחרונה כדי להבטיח שכל תרבית הרקמה PBS שואפת. לאחר מכן, הוסיפו חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח כדי ליזום את התאים.דוגרים את הצלחת על קרח במשך חמש דקות עם סיבוב בערך כל דקה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת. לאחר מכן מגרדים את התאים מהצלחת באמצעות מרים תאים מקורר מראש, ומעבירים את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג' 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. לאחר מכן, דגירה של מתלה התא בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור.לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר. ניתוח כתמים מערביים של ליסאטים של תאים שלמים מתאי מזנכים פאלטליים עובריים של עכברים מונצחים בעקבות גירוי עם ליגנד PDFG-B בין 2 ל-15 דקות חשף רצועות משוחזרות שונות עבור פוספופרוטאינים הפועלים בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה. עלייה בעוצמות רצועת הפוספופרוטאין נצפתה עם טיפול עם גורם גדילה בהשוואה לאלה של תאים לא מטופלים, בעוד שעוצמות רצועת החלבון הכוללת היו שוות יחסית בין הדגימות.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד הפרעות וזרחון משפיעות ישירות על איתות בין-תאי, ביטוי גנים ופעילות תאית בהקשרים קרניופציאליים.

isolation-whole-cell-protein-lysates-from-mouse-facial-processes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטון מדגים את ניתוח מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא המבודדים מרקמת מוח העכבר. התהליך כולל חשיפת הציסטאין הלא-פלמיטוילטי וחסימתם, ולאחר מכן שימוש בפולימר שנקשר לציסטאין הפלמיטוילטי, ומסייע בהערכת מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

פרוטוקול להפרדה של אקטודרם וmesenchyme פן עובר מתואר. אנו משתמשים Dispase השני לטיפול בעוברים שלמים ראשון, לנתח בליטות פן שלמות, ואז להפריד אקטודרם וmesenchyme הפנים.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

ניתוח פרוטאומי של כל סוג תא תלוי מאוד הן בטוהר והן בפיצול מראש של חומר המוצא על מנת לבצע דה-קומפלקסיזציה של הדגימה לפני ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (MS). על ידי שימוש בטכניקות שטיפה לאחור, ניתן להשיג זרע טהור ממכרסמים. לאחר העיכול, ניתן להעשיר פוספופפטידים באמצעות TiO2.

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

בשיטה זו, אנו מציגים תהליכים ביוכימיים לבידוד מהיר ויעיל של חלבונים בינוניים (IF) חלבונים מרקמות עכבר מרובות. IFs מבודד ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים שינויים שלאחר translational ידי ספקטרומטריית מסה בדיקות ביוכימיים אחרים.

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של תאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים להדמיה של צמיחה דו-ממדית (2D) ובגידות לתיקון פצעים. אנו מספקים גם את המתודולוגיה לניתוח נתוני ההדמיה של זמן לשגות כדי לקבוע היווצרות זרם תאים תנועתיות כיוונית.

בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבות של קרטינוציטים אוראליים הנגזרים מחך העכבר הבוגר. כמו כן, דווח על שיטת הערכה באמצעות חיסונים.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

למדו בידוד חלבונים מושרים מפנים עוברי עכבר ותאי מזנכיים פאלטליים לניתוח פוספופרוטאין. שיטה זו שומרת על מצב זרחון ומאפשרת חקר מנגנוני פיתוח קרניו-פאציאלי.

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין (וידאו) | JoVE Journal

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

גלה סרטונים נוספים