טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול
2 במאי 2022
מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר Kit V558Δ/+ ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.
הפרוטוקול שלנו מתאר את הרבייה, התחזוקה, הניתוח ועיבוד הדגימה של מודל העכברים החיסוני היחיד, GIST, הנמצא כיום בשימוש. אנו מקווים שחוקרים עתידיים יוכלו להשתמש במודל העכברים הזה כדי להמשיך את המחקר התרגומי ב-GIST. טיפולים מסורתיים ב- GIST כוללים טיפול מולקולרי ממוקד עם מעכבי טירוזין קינאז.
מודל זה מאפשר לחוקרים לבחון אימונותרפיות ב-GIST. כדי להתחיל, לעקר את כל המכשירים, ללבוש כפפות לאורך כל ההליך, ולשמור על שדה סטרילי. הכן את אזור החתך עם 70% אתנול.
באמצעות מספריים, לעשות חתך אנכי בקו האמצע של שני סנטימטרים ולהיכנס לחלל הבטן. בחדות למדוד כל הידבקויות תוך-בטניות. כדי להסיר את בלוטת הלימפה המזנטרית המתנקזת, זהה את הצקום והרם את המזנטריה שלו בצורה מעולה.
בערך באמצע הדרך לבסיס המזנטריה המעי הגסית, זהה את בלוטת הלימפה המזנטרית ונתח אותה בחדות. לפי הצורך, חלקו את רקמת בלוטות הלימפה לשלישים לבידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים. מניחים רקמת בלוטות לימפה ב-20 מיליליטרים של מדיום RPMI לתרחיפים חד-תאיים ושומרים על קרח.
הצקום מוחלף ברובו על ידי GIST בעכברי Kit558. לבידוד של GIST ו cecum, בזהירות לחלק את הצומת האילאוקולי מבסיס הגידול. לאחר מכן, מחלקים שוב את הצקום, שני סנטימטרים דיסטליים לבסיס הגידול.
ב-50% עד 60% מהעכברים Kit558, ראש הגידול מכיל מכסה של רקמת צ'ק, שבדרך כלל מכילה נוזל סרוסי, אך לעיתים רחוקות עשויה להכיל מוגלה. לנתח בחדות את רקמת הכובע הרחק מרקמת הגידול. מחלקים את רקמת הגידול ואת ה-cecum לשלישים לצורך בידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים.
עבור תרחיפים חד-תאיים, הניחו רקמת גידול או cecum ב-HBSS עם 2%FCS, מספיק כדי לכסות את הדגימה, ולשמור על קרח. יש לשפוך מדיית RPMI עם דגימת בלוטות הלימפה על גבי מסנן של 100 מיקרומטר. העבירו את המסנן לחרוט חדש של 50 מיליליטר, ומעכו את בלוטת הלימפה עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק בעל שלושה מיליליטר.
לשטוף מסנן עם 20 מיליליטרים של מדיית RPMI. צנטריפוגה את הדגימות ושואפים את הסופרנטנט. שופכים מחדש את הכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושופכים על מסנן של 40 מיקרומטר.
לאסוף את תפיח התא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את הדגימות והשליכה את הסופרנאטנט.
לאחר מכן, resuspend במאגר חרוזים עבור ציטומטריה זרימה. הכינו את מאגר הקולג'אנאז כמתואר בכתב היד של הטקסט. מניחים את ה-GIST בצלחת סטרילית ומוסיפים 2.5 מיליליטר של מאגר קולגןאז.
באמצעות אזמל סטרילי ומספריים, לטחון את הגידול עד שהוא בשברים עדינים. השתמשו בפיפטה בעלת בור גדול כדי לשאוף את הגידול ואת הקולגן לתוך צינור של 50 מיליליטר. דגירו אותו ב-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב-100 סיבובים לדקה, ואז מרווים את התגובה עם שני מיליליטרים של FBS.
יוצקים קולגןאז עם דגימת GIST על גבי מסנן של 100 מיקרומטר ומעכים את הגידול עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק של שלושה מיליליטר ומלקטים בצינור 50 מיליליטר. לשטוף מסנן עם 20 מיליליטרים של HBSS. צנטריפוגה של התסיס ב-450 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופרנאטנט.
בצעו שימוש חוזר בכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושפכו מעל מסנן של 40 מיקרומטר אספו את התסיסים וספרו תאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה ושואפים לסופרנאטנט, ואז משחזרים את החיץ בחיץ חרוזים לציטומטריית זרימה. באמצעות מספריים, לפצל את cecum אורכית כדי לחשוף את הרירית הפנימית.
חותכים אותו למקטעים של 0.5 ס"מ ומניחים אותו בצינור של 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטרים של HBSS ו-2% FBS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות ולצנטריפוגה ב-450 RCF למשך 20 שניות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט.
הוסף חמישה עד 20 מיליליטרים של HBSS עם EDTA דו-מילימולרי. דגירו אותו ב-37 מעלות צלזיוס ב-100 סיבובים לדקה במשך 15 דקות. צנטריפוגה והשלכת הסופרנאטנט, ואז החייאת הכדור בחמישה עד 20 מיליליטרים של HBSS.
יש לנער את התערובת במרץ למשך 30 שניות, ולאחר מכן לבצע צנטריפוגה ב-450 RCF למשך 20 שניות ולהשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה פעם נוספת. משחזרים את הכדור בחמישה מיליליטרים של מאגר קולגןאז, ואז דוגרים אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-100 סיבובים לדקה.
לנער במרץ כל 10 דקות ולהרווה את התגובה עם שני מיליליטרים של FBS. יוצקים קולגן עם דגימת cecum על גבי מסנן של 100 מיקרומטר ומחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק של שלושה מיליליטר. לשטוף את המסנן עם 20 מיליליטרים של HBSS ולאסוף את התסיס.
צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנאטנט. שופכים מחדש את הכדור ב-20 מיליליטרים של מאגר חרוזים ושופכים על מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף תסיסים ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
חזור על תהליך הצנטריפוגה פעם נוספת והחייא את הכדור במאגר חרוזים לציטומטריית זרימה. לעכברי Kit558 הייתה תוחלת חיים ממוצעת של שמונה חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת. גידולים מעכברי Kit558 ביטאו סמנים קנוניים של GIST, כולל ה-KIT של טירוזין קינאז, ערוץ הטרנס-ממברנה Dog1 וגורם השעתוק ETV1.
גידולים נחקרו עבור שינויים במסלול האיתות KIT כגון הסמנים במורד הזרם ERK ו- AKT או מיקרו-סביבה חיסונית, אשר חיקו באופן הדוק את ה- GIST האנושי. MRI או CT שימשו למעקב אחר נפח הגידול כמדידה מדויקת של תגובת הגידול. ניתוח הגידול הרחק מהצומת האילאוקולי והרחק מהכובע הצחי חשוב כדי ללכוד את משקל הגידול האמיתי ואת הניתוח החיסוני והמולקולרי.
בתוך GIST, מודל זה איפשר לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול, כמו גם אימונותרפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר את מודל העכבר Kit V558Δ/+ ומפרט טכניקות לניתוח ולעיבוד מוצלחים של דגימות עכברים. הפרוטוקול נועד להקל על מחקר תרגומי בגידולים סטרומליים של מערכת העיכול (GIST) באמצעות מודל אימונו-קומפטנטי זה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר תרגומי
רקע
- מודל העכבר Kit V558Δ/+ הוא כיום המודל היחיד בעל מערכת חיסונית תקינה עבור GIST.
- טיפולים מסורתיים עבור GIST כוללים טיפול מולקולרי ממוקד.
- מודל זה מאפשר בדיקה של אימונו-תרפיות.
- ניתוח נכון של הרקמה ועיבוד דגימות הם קריטיים לדיוק המחקר.
מטרת המחקר
- לתאר את הרבעה והתחזוקה של מודל העכבר Kit V558Δ/+.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור נתיחה ועיבוד דגימות.
- להעמיק את ההבנה של GIST ולשפר את מתודולוגיות המחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הערבה ותחזוקה של מודל העכבר Kit V558Δ/+.
- סטריליזציה של מכשירים ושמירה על שטח סטרילי.
- הכנת אזורי החיתוך באמצעות 70% ethanol.
- טכניקות מפורטות של נתיחה ועיבוד דגימות.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבטיח נתיחה ועיבוד מוצלחים של הדגימות.
- מקל על השימוש במודל Kit V558Δ/+ במחקרים עתידיים.
- מספק תשתית לבדיקת אימונותרפיה ב-GIST.
מסקנות
- מודל העכבר Kit V558Δ/+ הוא כלי בעל ערך למחקר של GIST.
- טכניקות נכונות של נתיחה ועיבוד חיוניות לקבלת תוצאות מהימנות.
- מחקר זה שואף לתמוך במחקרים טרנסלציונליים עתידיים ב-GIST.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל העכבר המהונדס גנטית KitV558Δ/+ מספק מערכת בעלת תקינות חיסונית (immunocompetent) הרלוונטית למחלה עבור מחקר תרגומי בגידולים סטרומליים של מערכת העיכול (GIST). מודל זה מאפשר הערכה קפדנית הן של טיפולים מולקולריים ממוקדים והן של טיפולים חיסוניים, תוך התגברות על מגבלותיהם של מודלי קסנוגרפט (xenograft) ותמיכה בביטחון ניבוי במסלולי פיתוח פרה-קליניים באונקולוגיה. התאימות שלו להיסטולוגיה של GIST אנושי ולמיקרו-סביבה החיסונית משפרת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים ומסייעת בקבלת החלטות לגבי קידום פורטפוליו התרופות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים אונקוגניים המונעים על ידי KIT בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שחזור של ההיסטולוגיה וההסננה החיסונית של GIST אנושי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור היפותזות טיפוליות, הן מולקולריות והן אימונולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק רקמות גידול ורקמות לימפואידיות מאושרות עבור בדיקות מולקולריות ואימונולוגיות המשך.
- מאפשר הכנה הניתנת לשחזור של תרחיפי תאים בודדים עבור ציטומטריה של זרימה ואנליזה כמותית.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות ובסקילביליות עבור סריקת תרכובות ואימונותרפיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים פרה-קליניים לביולוגיה של המחלה בבני אדם, ובכך מגבירה את הרלוונטיות של ביומרקרים תרגומיים.
- מאפשרת דימות לאורך זמן והערכה כמותית של התגובה של הגידול באמצעות MRI או CT.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון של אימונותרפיות וחומרים מטרתיים ב-GIST.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני עבור GIST, ובכך הוא תומך בבדיקת היפותזות חסונה וברציפות תרגומנית.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בהבהרת מסלולים ובניתוח המיקרו-סביבה החיסונית ב-GIST עם מוטציית KIT.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור עבור בדיקות מולקולריות ואימונולוגיות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של נפח הגידול, אוכלוסיות תאי מערכת החיסון וסמני הפעלת מסלולים.
- מחקר תרגומי: מספקת פלטפורמה להתאמת סמנים ביולוגיים ומחקרי יעילות פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מודל בעל תפקוד חיסוני שניתן לשימוש חוזר למחקרים מתמשכים ב-GIST ולהערכה תרפויטית.
השפעה תפעולית ואורגנית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של GIST.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של עיבוד דגימות ותזרימי עבודה של בדיקות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של אונקולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של טיפולים חדשניים ל-GIST.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות ברבייה ובתחזוקה של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
- נדרשת גישה למכשור כירורגי סטרילי ולשיטות דימות מתקדמות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיבוד רקמות ופרוטוקולים אנליטיים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות לצורך אינטגרציה עם פלטפורמות מגוונות של בדיקות מולקולריות ואימונולוגיות.
- יש להביא בחשבון את תוחלת החיים של המודל ואת קצב התקדמות הגידול בתכנון הניסויי.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
KitV558Δ/+ Mouse Organ Harvest
2:26
Single-Cell Suspension of Mesenteric Lymph Node
3:09
Single-Cell Suspension of GIST
4:22
Single-Cell Suspension of Cecum
6:06
Results: Investigation of Therapeutics in an Immunocompetent Mouse Model
6:49
Conclusion
