קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.

העניין במיקרוסקופיית אלקטרונים נוזליים הרקיע שחקים בשנים האחרונות, כפי שאנו יכולים לדמיין כיום בתהליכים ננומטריים בזמן אמת. ידע משופר על מבנים גמישים אלה יכול לסייע לנו בפיתוח ריאגנטים חדשניים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים כגון SARS-CoV-2. צפייה בחלבונים בסביבה נוזלית עוזרת לחקות מערכות ביולוגיות ונותנת לנו הזדמנות להסתכל על החלבונים בצורה דינמית יותר.

והניסוי הזה יראה לכם טכניקות חדשות כיצד להשתמש ולדמיין חלבונים הן בסביבות קרח זגוגיות והן בסביבות נוזליות. התוצאות האחרונות כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון בטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. יישומי נוזל וקריו-EM קורלטיביים מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לבריאות האדם ולמחלות.

קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול ליישם זרימות עבודה של EM נוזלי כדי לספק תצפיות דינמיות חדשות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם. מערכות Liquid-EM הזמינות מסחרית יכולות לספק זרימה, ערבוב, גירויים אלקטרוכימיים ובקרת טמפרטורה, החיוניים ליישומי הדמיה רבים בזמן אמת. שיטת כריך השבבים המוצגת כאן מתארת דרך פשוטה ברמת הכניסה לצפייה ראשונה בדגימות בנוזל לפני ביצוע הקפיצה למערכת מסחרית מורכבת יותר לניסויים באתרם.

כדי להתחיל, לנקות את שבבי סיליקון ניטריד על ידי דגירה כל שבב ב 150 מיליליטר של אצטון במשך שתי דקות, ואחריו דגירה ב 150 מיליליטר של מתנול במשך שתי דקות. אפשרו לשבבים להתייבש בזרימת אוויר למינרית. פלזמה לנקות את השבבים המיובשים באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים במשך 45 שניות באמצעות גז ארגון.

לאחר מכן, טען שבב בסיס יבש לתוך קצה מחזיק הדגימה והוסף כ -0.2 מיקרוליטר של הדגימה לשבב הבסיס. לאחר דגירה במשך דקה עד שתי דקות, מניחים את השבב העליון על שבב הבסיס הרטוב המכיל את הדגימה. שתלו את המכלול יחד כדי ליצור מארז אטום הרמטית המוחזק במקומו באופן מכני על ידי שלושה ברגי פליז.

שאבו את הקצה ל-10 עד מינוס שש טור באמצעות תחנת שאיבה יבשה עם שאיבה טורבו. המחזיק מוכן כעת להכנסתו ל- TEM. פלזמה לנקות את שבבים ורשתות פחמן באמצעות מכשיר פריקה זוהר במשך 45 שניות.

ולהוסיף כשני מיקרוליטרים של דגימה לשבב זוהר משוחרר המונח על חבילת ג'ל. הסר את הפתרון העודף באמצעות נייר סינון או פיפטה ודגרה במשך דקה עד שתי דקות. לאחר מכן הוסיפו את רשת הפחמן הזוהרת שנפלטה לשבב הרטוב המכיל את הדגימה.

שתלו את המכלול יחד באמצעות מחזיק דגימת הטיה יחיד בטמפרטורת החדר כדי ליצור מארז אטום הרמטית. לחלופין, השתמשו במהדקי רשת עם טעינה אוטומטית והניחו את מכלול הכריך על תפס C התחתון. הניחו את התפס העליון על גבי המכלול והשתמשו בכלי ההידוק הסטנדרטי כדי לאטום את המכלול.

הדגימה מוכנה כעת להחדרה ל- TEM. בדוק דגימות המונחות במעמיסים אוטומטיים בתנאי קריו או בטמפרטורת החדר. להדמיית נוזל-EM, טען את מחזיק הדגימה ל- TEM המצויד באקדח פליטת שדה ופעל במהירות של 200 קילו-וולט.

הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה על ידי שימוש בפונקציית הנדנדה, הטיית הדגימה ממינוס 15 מעלות לפלוס 15 מעלות בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון Z כדי להתאים לעובי הדגימה ומסייע להבטיח הגדלה מדויקת במהלך הקלטת התמונה. הקלט תמונות כסרטים ממוסגרים ארוכים או תמונות בודדות באמצעות חבילת התוכנה לאיסוף נתונים סדרתי, תוך יישום שגרות הדמיה אוטומטיות.

קבל תמונות בתנאים של מינון נמוך בהגדלה הנעה בין 28, 000X ל- 92, 000X ו- 40 פריימים לשנייה. התאם את זמני החשיפה כדי למזער את נזקי הקרן לדגימה והשתמש בטווח הפחתה של מינוס אחד עד ארבעה מיקרומטרים בהגדלה שצוינה. אם נתקלת בתמיסה עבה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר או בחר אזור עניין אחר.

ודא שהפתרון נמצא בדגימות לאורך כל סשן ההדמיה על ידי מיקוד קרן האלקטרונים באזור קורבן שאינו משמש לאיסוף נתונים עד ליצירת בועות. נתח סרטים עבור חלקיקי SARS-CoV-2 באמצעות תוכנית RELION-3.0.8 או כל תוכנה אחרת לעיבוד תמונה. בצע תיקון תנועה באמצעות תוכנית MotionCor2.

לאחר התיקון, חלץ חלקיקים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית בחבילת התוכנה של התוכנית. גדלים אופייניים של קופסאות הם 330 פיקסלים לדגימות נוזליות ו-350 פיקסלים לדגימות קרח. חשב את השחזורים הראשוניים באמצעות סימטריית C1 עם שגרת המודל הראשוני התלת-ממדי של התוכנית ואפשרויות מודל ab initio בחבילת התוכנה לעיבוד נתונים.

לאחר מכן בצע פרוטוקולי חידוד בתוכנת עיבוד הנתונים. בחן את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה לניתוח מבנה מולקולרי תוך הערכת שינויים דינמיים. השוואה של מבנים נוזליים-EM וקריו-EM בתת-סוג וירוס הקשור לאדנו שלוש או AAV מוצגת כאן.

התמונות המייצגות מראות את המבנה של AAV בתמיסה ובקרח. התצוגות הסיבוביות של תת-היחידה AAV VP1 המופקות ממבני הנוזל והקרח מוצגות כאן. תמונות אלה מייצגות את הערכים הדינמיים במבנים הנוזליים הנוצרים באמצעות פונקציית מפת שינוי הצורה בתוכנת ניתוח המבנה המולקולרי.

המבנים הממוצעים ממכלולי וירוסים מרובים מראים שינויים קונפורמיים עם שינוי בקוטר של כמעט 5% הנמדד באמצעות נתוני EM. תמונה של מכלולים תת-ויראליים של SARS-CoV-2 שבודדו משברי סרום מחולי COVID-19 מוצגת כאן. בועות לבנות אלה מצביעות על נוכחות של נוזל בדגימה.

שחזור EM של מכלולים תת-ויראליים אלה מוצג כאן עם צפיפויות רדיאליות צבעוניות בפרוסות של חמישה ננומטר דרך המפה. התמונה המייצגת מתארת את הניתוח של חלקיקים דו-שכבתיים של רוטה-וירוס שהוכנו בקרח זגוגי באמצעות טכניקת כריך השבב. יש למזער את השימוש בדטרגנטים, גליצרול, פוליאתילן, גליקולים ורמות גבוהות של סוכרים לצורך הדמיית נוזל-EM.

ריאגנטים אלה עשויים להציג חפצים, ליצור מבעבע מוגזם, מוצרי הידרוליזה ורדיקלים חופשיים עקב נזק לקרן. השימוש בפרוטוקולים אלה יאפשר למדענים להיות מסוגלים לחקור תהליכים דינמיים בפירוט אטומי. וזה משתרע על פני תחומים רבים של המדע כולל רפואה, מדעי החיים וחקר חומרים.

הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים כיצד כלים חדישים יכולים לספק אמצעי מרגש לדמיין מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות עיניים חדשות. שדה מיקרוסקופיית האלקטרונים הנוזלית עשוי לשפר את האופן שבו אנו חוקרים את הנגיפים החדשים האלה שמהווים איום על בריאות האדם, ואולי אפילו לתרום לאמצעי המוכנות שלנו למגפה.