Name: בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: למדו לבודד פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר בשיטה יעילה לייצור תאים בעלי חיוניות גבוהה ויכולת דיפרנציאציה אדיפוגנית. מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של התפתחות שומן בלטאות ובבני אדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל- UT AgResearch ולמחלקה למדעי בעלי החיים על התמיכה והאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק USDA.

<ol><li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFryar%2C+CD+%22Prevalence+of+overweight%2C+obesity%2C+and+severe+obesity+among+children+and+adolescents+aged+2-19+years%3A+United+States%2C+1963-1965+through+2015-2016%22">Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016</a>. , (2018).</li>
<li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Animal+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li>
<li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+efficiency%2C+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957%2C+1978%2C+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li>
<li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Lipids+and+Lipid+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li>
<li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li>
<li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li>
<li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology%2C+development%2C+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li>
<li>Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022).</li>
<li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+cell+culture%3A+Advance+technology+for+modern+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li>
<li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li>
<li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crude+oil%2Fdispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+%CE%B3+activity+in+vitro+and+in+vivo%3A+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+%28DOSS%3B+CAS%23+577-11-7%29+as+a+probable+obesogen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausman%2C+DB+%22Adipose+Tissue+Protocols%22">Adipose Tissue Protocols</a>. , Springer. 201-219 (2008).</li>
<li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).</li>
<li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+swimming+dots+in+cell+culture%3A+the+identity%2C+detection+method+and+judging+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906(2018).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications%22">Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications</a>. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פרוטוקול זה מניב כדאיות גבוהה של אבות אדיפוציטים עובריים עם פוטנציאל התמיינות גבוה. יתר על כן, ההליך המוצג לבידוד פרדיפוציטים אינו מוגבל לעוברים אלא יכול לשמש אפרוחים לאחר הבקיע...

השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה"ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר1, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית 2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.
אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים 4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים 6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים5.
הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר8. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה'אומות' השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>Z683825</td><td>פיפטה חד ערוצית, 100 - 1000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>1 מ"ל קצה פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% איזופרופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל בקבוק</td><td>פיירקס</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות</td><td>פלקון פלקון</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בדיקה 96 בארות</td> שטופלה בתרבית <td>רקמות Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות, תחתית שחורה</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>טיפול בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>AdipoRed</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>מגב ספסל עליון (Kimtechwiper)</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>בטדין</td><td>למעלה & למעלה</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% פתרון עבודה</td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>קורנינג</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגטון</td><td>אפנדורף</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוף</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים, 15 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים, 50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים, 100 מ"מ</td><td>Roboz כירורגי</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים מעוקלים, 115 מ"מ</td><td>Roboz כירורגי</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>Millipore</td><td>SYNSV0000</td><td>מחולק לפי הצורך</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% פתרון עבודה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות פלורסנט</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>רדיד</td><td>ריינולדס ריינולדס</td><td></td><td>לעטוף רדיד אלומיניום כבד, 125 רגל רבוע.</td></tr><tr><td>מיכל הקפאה</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>2% פתרון עבודה</td></tr><tr><td>המטוציטומטר (תא ספירה)</td> <td>קורנינג</td><td>480200</td><td>0.1 מ"מ עמוק</td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>מעקר מכשירים</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>חומצה לינולאית-אולאית חומצה-אלבומין</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x פתרון עבודה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>רב ערוצי פיפטה</td><td>תרמו מדעי</td><td>4661070</td><td>פיפטרים 12 ערוצים, 30 - 300 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>IKA</td><td>מגבת נייר KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטפטומיצין (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x Working Solution</td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 100 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 60 מ"מ</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Plate Shaker</td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservior</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>קטנה, 100 מ"ל</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות ספקטרופוטומטר</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>גזה סטרילית</td><td>McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים, 120 מ"מ</td><td>Roboz כירורגי</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ישרים, 140 מ"מ</td><td>Roboz כירורגי</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>בקבוק קורנינג</td><td>430639</td> חממת תרבית <td>רקמות שטופלה בתרבית רקמות</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>מסננת רקמות, 250 ומיקרו; m</td><td>פירס</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כתם כחול</td><td>ג'יבקו</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>15400054</td><td>0.1% פינצטה תמיסת עבודה</td></tr><tr><td>, 110 מ"מ</td><td>רובוז כירורגי</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>סוג 1 קולגנאז</td><td>גיבקו</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman כיתה 1</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.

פראדיפוציטים ראשוניים דומים מבחינה מורפולוגית לפיברובלסטים, עם צורות לא סדירות דמויות כוכבים וגרעין מרכזי (איור 2A-C). התאים נצמדים בקלות לפלסטיק תרבית רקמה ומתחילים להתרבות זמן קצר לאחר ההתקשרות. הם מתמיינים במהירות וצוברים טיפות שומנים (איור 3D) כאשר הן מסופקות עם חומצות שומן במדיה. הכדאיות (98%, בהתבסס על אי הכללת צבע) המדווחת בבידודים המיוצגים כאן היא אופיינית. בעוד שהתאים חזקים למדי, טיפול אגרסיבי במהלך הבידוד מוביל לנזק לת...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ"א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בחילוף החומרים של אדיפוציטים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות אדיפוציטים. שיטה זו עברה אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציט בוגר, אשר יכול לשמש לניתוח פונקציונלי של צמיחת שומן מוקדם בחיים ועובר התפתחות אצל אפרוחים.תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה מאוד בין תרנגולות לבני אדם. לכן, preadipocytes מבודדים יכולים לשמש כמודל מוצע כפול למחקרים רלוונטיים לבני אדם ועופות. כדי להתחיל לטבול את הגוף העובר עם 70% אתנול.לאחר מכן כדי למנוע הפרעות במהלך הסינון בשלבים מאוחרים יותר לאחר העיכול קרצפו בעדינות את פני העור עם גזה סטרילית כדי להסיר נוצות. לאחר מכן חתכו את העור בין הרגליים לאזור הבטן כדי לחשוף את זוג מחסני שומן הירך. השתמש במלקחיים מעוקלים ביד אחת כדי להחזיק את העור סביב הרגל ולהסיר בעדינות את השומן התת עורי הירך.עם היד השנייה. מאוחר יותר, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי למשוך בעדינות את המחסן הרחק מהרגל. מעבירים את הרקמות לצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטרים של מדיית איסוף וחוזרים על הנתיחה לצד השני של כרית השומן.כעת, העבירו את רפידות השומן שנאספו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת עיקור ושטפו לזמן קצר על ידי מערבולת המנה מספר פעמים. לאחר מכן יש לשטוף את תמיסת העיקור על ידי העברת רפידות השומן לצלחת פטרי 60 מילימטר המכילה PBS. סובבו בעדינות את הצלחת ושוב, התרחצו עם PBS.לעיכול של רקמות השומן, להעביר אותם לצינור 15 מילימטר המכיל תמיסה אנזימטית טרום חמה. לאחר מכן לטבול זוג מספריים ישרים ארוכים בצינור ולבסוף לטחון את רקמות השומן בתמיסה לחתיכות קטנות ככל האפשר. מעבירים את הרקמה הטחונה והתמיסה האנזימטית לבקבוקון אוטו-חלבי של 25 מיליליטר.עוטפים את הבקבוקון בסרט פרפין ומניחים את הבקבוקון באינקובטור שייקר מסלולי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. לאחר העיכול, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן הסר את כל הפיסות של רקמות ופסולת לא מעוכלות על ידי סינון דרך מסננת רקמה של 250 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר על ידי צנרת.כעת, הסר את התאים שנדבקו לבקבוקון על ידי שטיפת הבקבוקון עם ארבעה מיליליטרים של מדיית גדילה וסנן את תרחיף התא לאותו צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן יש לשטוף את המסננת על ידי צנרת מדיית הגדילה שוב כדי להסיר את כל התאים הלכודים במסנן. צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לפוצץ את שבר התא ולשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.יש לבצע החייאה עדינה של הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאי דם אדומים, לערבב היטב על ידי צנרת ולדגום במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דיללו את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של מדיית גדילה לצינור המכיל את התאים וערבבו אותם בעדינות על ידי צנרת. כעת, טפטפו את התאים למסננת תאים של 40 מיקרומטר וסיננו אותם לצינור חדש של 50 מיליליטר.לאחר מכן יש לשטוף את המסננת עם חמישה מיליליטרים נוספים של מדיית גדילה ולהשליך את התאים על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור התא הנותר במיליליטר אחד של מדיית גדילה על ידי צנרת כדי לקבוע את צפיפות התאים ואת יכולת הכדאיות, ערבבו 10 מיקרוליטרים של כל דגימה בכחול טריפאן על ידי צנרת.טען 10 מיקרוליטרים של התערובת על ההמוציטומטר וספור את התאים. ניתוח של פראדיפוציטים לאחר 24, 48 ו-72 שעות הראה מורפולוגיה ומספר תאים תקינים. אינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים הראתה התמיינות מהירה והצטברות של טיפות שומנים.טיפול אגרסיבי בפראדיפוציטים במהלך הבידוד גרם לנזק לתאים ולמספר תאים נמוך. זיהום מיקרוביאלי ניתן לראות למרות נקיטת אמצעי מניעה. צביעת שומנים בשמן אדום O הצביעה על כך שהפרדיפוציטים מתחילים לפתח במהירות טיפות שומנים תחת תמריצים אדיפוגניים והתקדמות ההצטברות לאורך זמן כפי שנצפה תוך 24, 48 ו-72 שעות.הצטברות השומנים ביחס למספר התאים כומתה באמצעות כתמי שומנים ודנ"א. גם הצטברות השומנים וגם התפשטות התאים גדלו עם הזמן. ניתן לראות מספר תאים נמוך או תאים פגומים כאשר שברי הרקמה מתעכלים זמן רב מדי.לכן, מומלץ כי שעה וחצי של עיכול הוא לא יעלה. פראדיפוציטים מבודדים יכולים לשמש למחקרי ביטוי גנים. ניתן להשיג מספיק RNA לשימוש בסינתזת cDNA ומעקב אחר qPCR או RNAseq.

isolation-of-preadipocytes-from-broiler-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף...

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

סרטון זה מדגים את בידודו של קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מעובר התרנגולת. ניתן להשתמש ב- CAM שנקצר ליישומים נוספים במורד הזרם.

קציר קרום צ'וריואלנטואי אפרוחים: שיטה לבידוד קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מביצת תרנגולת

מודלים תרבית תאים מספקים שליטה מפורטת על תנאים סביבתיים ובכך מספקים פלטפורמה רבת עוצמה על מנת להבהיר היבטים רבים של ביולוגיה של תא עצבי. אנו מתארים שיטה מהירה, זולה, ואמינה לבודד, לנתק, ותרבות תאי עצב תחושתי מעובר חומוס. פרטים של הכנת המצע וimmunocytochemistry גם מסופקים.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להפרדת תאי חלמון, גרנולוזה ותאי תקה בזקיקי קדם-ביוץ של עופות. טיפול מדויק זה מאפשר חקירות קריטיות של תפקידן של שכבות אלה בתפקוד הרבייה, ומסייע להבנת התפתחות הזקיקים, ויסות הורמונלי וחקר מחלות לשיפור התפוקה החקלאית ותובנות ביו-רפואיות.

הפרדה של גרנולוזה של זקיקי קדם-ביוץ של עופות ושכבות תאי Theca ליישומים במורד הזרם

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

למדו לבודד פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר בשיטה יעילה לייצור תאים בעלי חיוניות גבוהה ויכולת דיפרנציאציה אדיפוגנית. מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של התפתחות שומן בלטאות ובבני אדם.

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

גלה סרטונים נוספים