Name: מדידת מספר עותק דנא מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: למד מדידת מספר עותקי דנ"א מיטוכונדריאלי ורמות הטרופלזמה ביחידות תאים באמצעות PCR דיגיטלי בטיפות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של מוטציות מיטוכונדריאליות בביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה לד"ר ל. בוז'ילובה על הייעוץ לגבי הניתוח הסטטיסטי של נתוני PCR של דור טיפות. תודה לד"ר ה. ג'אנג על שסיפק את הביציות ששימשו להפקת נתונים באיור 3C ובאיור 4B. עבודה זו בוצעה על ידי SPB ביחידה לביולוגיה מיטוכונדריאלית של המועצה למחקר רפואי (MC_UU_00015/9), אוניברסיטת קיימברידג', ומומנה על ידי מלגת מחקר ראשית של Wellcome Trust המוחזקת על ידי PFC (212219/Z/18/Z).

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li>
<li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription%2C+mass+and+respiratory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--%3EG%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146(2013).</li>
<li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells%3A+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li>
<li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA%28Lys%29+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+%28MERRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA%3A+age%2C+fiber+type%2C+and+mutation-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li>
<li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li>
<li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li>
<li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li>
<li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li>
<li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li>
<li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186(2016).</li>
<li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li>
<li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
<li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li>
<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן ישים על פני מגוון רחב של סוגי תאים ומינים בנוסף לאלה שנדונו לעיל, אם כי אופטימיזציה זהירה של עיצובי בדיקה חדשים תהיה המפתח להבטיח שהדיוק והחזרתיות של השיטה נשמרים כאשר מתרחקים משילובי פריימר/בדיקה שאומתו בעבר. כאשר עובדים עם תאים בודדים, חיוני לוודא שאיסוף הדגימות מתבצע בצורה מדויקת ככל האפשר (למשל, שימוש בפרמטרים מחמירים של תא בודד בעת מיון תאים לפי FACS) כדי להבטיח שהתוצאות המתקבלות משקפות באמת את אלה של תאים בודדים, וכן שכל עבודת ההכנה מתבצעת באזור נקי לפני PCR כדי להפחית את הסיכון להתרחשות זיהום....

דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא גנום דנ"א מעגלי קטן (כ-16.5 קילובייט) השוכן במטריצה המיטוכונדריאלית המקודדת 37 גנים, הכוללים שני rRNA, 22 tRNA ו-13 גנים המקודדים חלבונים1. בניגוד לגנום הגרעיני, המכיל עותק אחד (הפלואידי) או שניים (דיפלואידים) של כל גן לכל תא, mtDNA נמצא במספר עותקים במיטוכונדריה של כל תא, החל מעשרות עותקים (למשל, זרעונים בוגרים) ועד מאות אלפי עותקים (למשל, ביציות)2,3. תוצאה של ריבוי עותקים זה היא שמוטציות בגנום mtDNA, שעשויות להתקיים כפולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים (SNPs), מחיקות או כפילויות, יכולות להימצא ברמות משתנות בכל תא נתון, ולהוות בין 0% ל-100% מכלל אוכלוסיית ה-mtDNA של התא. קיומם של גנומים mtDNA מסוג בר ומוטנטי באותו תא נקרא הטרופלזמה, ומוטציות mtDNA הטרופלסמיות פתוגניות הן הגורם העיקרי למחלות מיטוכונדריאליות, עם מספר תסמונות נוירולוגיות נפוצות הקשורות למוטציות mtDNA הטרופלזמיות בסיסיות4.
שני פרמטרים מרכזיים התורמים לסבירות של מוטציית mtDNA הטרופלסמית הגורמת למחלה קלינית הם רמת ההטרופלזמה ומספר עותק mtDNA. מוטציות הטרופלזמיות רבות מציגות אפקט סף, כאשר הפנוטיפים הביוכימיים והקליניים מתגלים רק מעל רמה הטרופלסטית מסוימת, בדרך כלל סביב 80%5, ולאחר מכן מחמירים ככל שההטרופלסמיות עולה עוד4. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון את מספר העותקים של mtDNA הנמצאים בתא, שכן הדבר ישפיע על מספר הגנומים מסוג mtDNA פראי (כלומר, 'בריאים') הנמצאים ברמה הטרופלסטית נתונה. מחקרים בחולים במחלות מיטוכונדריאליות הדגישו את החשיבות של יחסי הגומלין האלה בין הטרופלזמה לעותק מספר5,6, ו- Filograna et al. דיווחו לאחרונה על עלייה במספר עותקי mtDNA המקלים על הסימפטומים למרות הטרופלזמה ללא שינוי במודל עכבר של מחלת המיטוכונדריה7.
בעוד שנעשה הרבה בשנים האחרונות כדי לשפר את ההבנה של פתוגנזה והעברה של מחלות הנגרמות על ידי הטרופלזמה mtDNA, רוב העבודה הזו נעשתה ברמה של רקמות ולא תאים, השוואת רמות הטרופלסמיות ממוצעות של רקמות ומדידות מספר עותקים שנרכשו מביופסיות רקמה בתפזורת ודגימות דם. כמה טכניקות מבוססות היטב, כגון מיקרודיסקציה של לכידת לייזר, מאפשרות מדידות כאלה ברמה התאית 8,9; עם זאת, ההתפוצצות האחרונה של שיטות ניתוח חד-תאיות בתפוקה גבוהה, או מה שמכונה "אומיקס חד-תאי"10, יצרה דרישה לשיטות שיכולות למדוד במדויק את הפרמטרים החיוניים האלה של mtDNA ברמת התא הבודד.
שיטת ה-PCR לייצור טיפות מנצלת את ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה המיקרופלואידית כדי לשפר את השיטות הקיימות לכמויות ריכוזי דנ"א לא ידועים באמצעות הגברת PCR של אמפליקוני מטרה ספציפיים בדגימת DNA11. בניגוד ל-qPCR, שבו הדנ"א של הדגימה מוגבר בתגובה אחת, כאשר הקצב היחסי של הצטברות תוצר ה-PCR משמש כקריאה, שיטה זו מפצלת את הדגימה הראשונית לאלפי טיפות בודדות, ובכך ממדלת את מולקולות הדנ"א של הדגימה לתגובות נפרדות מרחבית12. תגובת ה-PCR הבאה ממשיכה בכל טיפה בנפרד, כאשר מוצר ה-PCR מצטבר רק בטיפות המכילות את דנ"א המטרה. התוצאה של תגובה זו היא פלט דיגיטלי בצורת מאגר של טיפות המכילות עותק של דנ"א המטרה ותוצר PCR מוגבר, או שאינן מכילות דנ"א מטרה. באמצעות בדיקות דנ"א פלואורסצנטיות או צבע קושר דנ"א דו-גדילי (ds), ניתן לספור את הטיפות המכילות תוצר מוגבר, וניתן להשתמש ביחס בין טיפות 'חיוביות' ל'שליליות' כדי לחשב את המספר המוחלט של עותקי הדנ"א שהיו נוכחים בדגימה הראשונית. מדידה מוחלטת זו, בניגוד למדידה היחסית המתקבלת מתגובת qPCR, היא גורם המפתח המאפשר שימוש במתודולוגיה זו למדידה מדויקת של מספר עותק mtDNA והטרופלזמה בתאים בודדים11, ומספר מחקרים אחרונים כבר השתמשו בטכנולוגיית PCR לייצור טיפות למטרה זו13,14 . מאמר זה מציג שיטה למדידת מספר עותק mtDNA והטרופלזמה למחיקה בתאים בודדים מרקמות אנושיות ועכבריות כאחד.

<table><tbody><tr><td>תמיסת 50% Tween-20</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>שמן אוטומטי לייצור טיפות&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>פורמולציה מסחרית של שמן המשמשת לייצור תחליב שמן/טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.1)</td></tr> <tr><td>מכונת C1000 PCR עם בלוק באר עמוק</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>תרמו-ציקלר PCR המצויד בבלוק חימום באר עמוקה, המשמש לליזה תאים (פרוטוקול שלב 2.1.2.) ורכיבה על אופניים PCR (פרוטוקול שלב 5)</td></tr> <tr><td>בלוק קירור צלחת איסוף</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>בלוק קירור השומר על דגימות מקוררות במהלך יצירת טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)</td></tr><tr><td>ddPCR צלחות 96 בארות&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>96 בארות צלחות קצות פיפט המיועדות לשימוש במחולל הטיפות QX200 AutoDG, המשמשות להכנת דגימה (פרוטוקול שלב 3.4) ואיסוף טיפות (פרוטוקול שלב 4.3)</td></tr> <tr><td>שמן קורא טיפות ddPCR&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>פורמולציית שמן מסחרית המשמשת את קורא הטיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 6.1)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>סופר-מיקס מסחרי לשימוש בניסויי ddPCR תוך שימוש בבדיקות (בשימוש בפרוטוקול שלב 3.3)</td></tr><tr><td>DG32 מחסניות מחולל טיפות אוטומטיות&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>מחסניות מיקרופלואידיות המשמשות במחולל הטיפות QX200 AutoDG ליצירת תחליב שמן/טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>סרום בקר עוברי מוסמך</td></tr><tr><td>כיסויי צלחות נייר כסף&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>כיסויי צלחות נייר כסף המשמשים לאיטום לוחות איסוף טיפות לאחר יצירת טיפות (בשימוש בשלב פרוטוקול 4.6)</td></tr> <tr><td>תאי HEK 293T</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>תת-שיבוט מסחרי של קו תאי הכליה העובריים האנושיים שעברו טרנספורמציה, HEK 293, המבטא את תאי HeLa אנטיגן Large-T SV40</td></tr><tr><td></td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>תאי קרצינומה אפיתלואידים של צוואר הרחם האנושי</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, עם L-גלוטמין ונתרן פירובט</td></tr><tr><td>סייברידים אנושיים</td> פיברובלסטים עובריים <td>של עכבר אוניברסיטת מיאמי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>אוניברסיטת ניוקאסל</td><td>הונצחה מעכברי</td><td></td>C57Bl/6</tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>אטמי צלחת PCR</td><td>Pierce</td><td>SP-0027</td><td>אטמי צלחת דבק שקופים, בשימוש רק בייצור טרום טיפות (יש להשתמש באטם נייר כסף בשלב 4.6)</td></tr> <tr><td>פחי פסולת קצה פיפט</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>פח איסוף חד פעמי המשמש לאיסוף טיפות שהושלכו במחולל הטיפות QX200 AutoDG (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)</td></tr><tr><td>טיפים למערכת AutoDG&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>קצות פיפט מסוננים המיועדים לשימוש במחולל טיפות QX200 AutoDG (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.3)</td></tr> <tr><td>תאי פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים</td> פריימרים/בדיקות ביובנק <td></td><td></td><td>ניוקאסל</td></tr><tr><td></td><td>IDT</td><td>N / A</td><td>רצפי פריימר/בדיקה מדויקים יהיו תלויים בבדיקה. פריימרים ובדיקות ששימשו במחקר זה ניתנים בטבלה 1</td></tr><tr><td>תמיסת Proteinase K 20 מ"ג/מ"ל</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR אוטם צלחות</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>מחיל אטמי נייר כסף על לוחות דגימת ddPCR לאחר יצירת טיפות (בשימוש בפרוטוקול שלב 4.6)</td></tr> <tr><td>תוכנת QX Manager</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>תוכנת הגדרה וניתוח של קורא טיפות (בשימוש בשלבים 6 ו-7 של פרוטוקול)</td></tr><tr><td>מחולל טיפות QX200 AutoDG</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>מחולל טיפות מיקרופלואידי אוטומטי (בשימוש בפרוטוקול שלב 4)</td></tr> <tr><td>קורא טיפות QX200</td><td>קורא טיפות Bio Rad</td><td>1864003</td><td>(בשימוש בפרוטוקול שלב 6)</td></tr> <tr><td>Trizma גבישים מוגדרים מראש pH 8.3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

דנ"א מיטוכונדריאלי של יונקים (mt)DNA הוא מולקולת דנ"א תוך-מיטוכונדריאלית קטנה, מעגלית, דו-גדילית, המקודדת 13 תת-יחידות של שרשרת הובלת האלקטרונים. שלא כמו הגנום הגרעיני הדיפלואידי, רוב התאים מכילים הרבה יותר עותקים של mtDNA, החל מפחות מ-100 ועד למעלה מ-200,000 עותקים, תלוי בסוג התא. מספר עותק MtDNA משמש יותר ויותר כסמן ביולוגי למספר מצבים ניווניים ומחלות הקשורות לגיל, ולכן, מדידה מדויקת של מספר עותק mtDNA הופכת לכלי מרכזי הן במסגרות מחקר והן בהגדרות אבחון. מוטציות ב-mtDNA, המתרחשות לעתים קרובות כפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) או כמחיקות, יכולות להתקיים בכל העותקים של ה-mtDNA בתוך התא (המכונה הומופלסמיות) או כתערובת של עותקי mtDNA שעברו מוטציה ו-WT (המכונים הטרופלזמה). מוטציות mtDNA הטרופלזמיות הן הגורם העיקרי לפתולוגיה מיטוכונדריאלית קלינית, בין אם במחלות נדירות או במספר גדל והולך של מחלות נפוצות מאוחרות כגון מחלת פרקינסון. קביעת רמת ההטרופלזמה הקיימת בתאים היא שלב קריטי באבחון מחלות מיטוכונדריאליות נדירות ובמחקר שמטרתו להבין הפרעות נפוצות מאוחרות שבהן המיטוכונדריה עשויה לשחק תפקיד. מספר עותק MtDNA והטרופלזמה נמדדו באופן מסורתי על ידי בדיקות כמותיות (q)מבוססות PCR או ריצוף עמוק. עם זאת, ההקדמה האחרונה של טכנולוגיית ddPCR סיפקה שיטה חלופית למדידת שני הפרמטרים. הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות קיימות, כולל היכולת למדוד מספר עותק mtDNA מוחלט ורגישות מספקת כדי לבצע מדידות מדויקות מתאים בודדים גם במספרי העתקה נמוכים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המתאר את המדידה של מספר עותק mtDNA בתאים בודדים באמצעות ddPCR, המכונה ייצור טיפות PCR מעתה ואילך, עם אפשרות למדידה בו זמנית של הטרופלזמה בתאים עם מחיקות mtDNA. כמו כן נדונה האפשרות להרחיב שיטה זו למדידת הטרופלזמה בתאים עם SNPs mtDNA.

לאחר יצירת הטיפות, ניתן לראות שכבה ברורה של טיפות אטומות מרחפת מעל שלב השמן בכל באר (איור 1B). היווצרות טיפות יכולה להיות מושפעת לרעה על ידי נוכחות של דטרגנטים בליזאט קלט בעת ביצוע ניסויים על תאים בודדים. באמצעות פרוטוקול התזה המתואר ב-2.1.2., תפוקות טיפות מעל הרמה המומלצת של 10,000 מושגות באופן שגרתי, למרות נוכחות של כמות שיורית קטנה של TWEEN-20 בדגימה הסופית (איור 1C). עם זאת, במאגרי תזה אחרים, כגון buffer RLT Plus, רואים ירידה דרמטית במספר הטיפות שנוצרו (<str...

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

פרוטוקול זה יכול לשמש למדידה מדויקת של מספר העותקים של דנ"א מיטוכונדריאלי הנמצאים בתאים בודדים ואת הרמה של סוגים מסוימים של מוטציה בדנ"א המיטוכונדריאלי. שיטות קודמות יכולות לבצע מדידות אלה במדויק בדגימות רקמה המכילות תאים רבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבצע את אותן מדידות בתאים בודדים.שיטה זו שימושית במיוחד למי שחוקר מיטוכונדריה ויהיו לה יישומים נרחבים בתחום זה. בידוד יעיל ותזה של תאים בודדים הוא המפתח לטכניקה זו. ניסיון קודם עם מיון תאים בודדים יעזור מאוד.כדי להתחיל, הכן את תערובת האב עבור PCR ללא DNA הדגימה על הקרח, כפי שמתואר בטקסט. לאחר מערבולת קצרה, הפיצו את הנפח הנדרש של תערובת האב המוכנה לכל באר של צלחת PCR 96-well מדור טיפות, תוך סידור הדגימות בעמודות מלאות. לאחר מכן, הוסף את תערובת האב לכל באר ריקה בעמודות לא שלמות לשימוש בהן כפקדים שאינם תבנית.לאחר מכן הוסף את הדנ"א הקלט לכל באר כדי להפוך את הנפח הכולל של כל באר 22 מיקרוליטר. אטמו את הצלחת עם חותם צלחת דבק והניחו אותה על שייקר במהירות של 2000 סל"ד למשך דקה אחת. לאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת ב 1000 פעמים G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס לפני הנחתה על קרח.עבור יצירת טיפות, תחילה ודא כי מחולל הטיפות מופעל ובדוק אם בקבוק של שמן המייצר טיפות נטען למיקום E של סיפון המכשיר. לאחר מכן לחצו על 'קביעת תצורה של צלחת לדוגמה' במסך המגע. לאחר בחירת כל העמודות בלוח הדגימה המכילות את הדגימות או הריקים, לחץ על בסדר כדי לאשר את תצורת הלוחית.לאחר מכן, טען את מחסניות מחולל הטיפות כדי למקם את B על סיפון המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים והניחו שוקת פסולת קצה ריקה למצב C.לאחר מכן טען תיבות קצה מסנן עם מכסים שהוסרו כדי למקם את D על במת המכשיר כך שכל האורות יהפכו לירוקים. לאחר מכן, הסר את חותם הדבק לפני טעינת צלחת הדגימה כדי למקם F של סיפון המכשיר כך שהאור יהפוך לירוק. כמו כן, טען אוסף טיפות ריק 96-באר צלחת המונחת לתוך בלוק קריר, מקורר מראש במינוס 20 מעלות צלזיוס, במיקום G כך שהאור הופך לירוק.לחץ על התחל יצירת Droplet במסך המגע של המכשיר ומכסה מחולל הטיפות ייסגר באופן אוטומטי. לאחר השלמת ייצור הטיפות, בדקו את צלחת איסוף הדגימות באופן חזותי כדי לוודא ששכבת תחליב טיפות נמצאת מעל שלב השמן בכל באר. לאחר מכן, הפעילו את איטום הצלחת והגדירו את הטמפרטורה ל-180 מעלות צלזיוס ואטמו את הזמן לחמש שניות.אפשר להתקן להגיע לטמפרטורת ההפעלה. לאחר מכן הניחו את צלחת איסוף הדגימה על מחזיק הצלחת של איטום הצלחת והניחו חותם נייר כסף טרי על החלק העליון של הצלחת כאשר הקו האדום פונה כלפי מעלה. כאשר איטום הצלחות הגיע לטמפרטורת ההפעלה שלו, לחץ על הוצא במסך המגע של המכשיר.לאחר הנחת מחזיק הצלחת במגירה של איטום הצלחות, לחץ על SEAL כדי לסגור את המגירה. לאחר השלמת האיטום, המגירה תיפתח באופן אוטומטי. הסר את הצלחת האטומה והנח אותה על בלוק קר.לאחר מכן כבה את איטום הצלחת. להפעלת ה-PCR, הניחו את צלחת איסוף הטיפות האטומה במכונת PCR עם בלוק עמוק של 96. לאחר השלמת ה-PCR, הפעל את קורא הטיפות ואת המחשב המחובר.טען את הצלחת עם דגימות ה- PCR שלאחר מכן לתוך מחזיק צלחת קורא הטיפות. תוך שמירה על מכסה נייר הכסף על צלחת הדגימה, הניחו את המכסה על החלק העליון של המחזיק והדקו אותו במקומו באמצעות מהדקי נעילה שחורים. לאחר מכן, כדי לפתוח את מכסה קורא הטיפות, לחץ על לחצן הפתיחה/סגירה.לאחר מכן טען את מחזיק צלחת קורא הטיפות עם צלחת הדגימה לתוך תא הקורא והנח אותו היטב על הבסיס המגנטי. לחץ שוב על לחצן הפתיחה/סגירה כדי לסגור את המכסה. פתח את ממשק תוכנת הניתוח.בחר בכרטיסיה הוסף לוח, לחץ על הוסף צלחת ולאחר מכן על קביעת תצורה של לוח. בכרטיסייה 'פרטי לוחית', הזן שם לוחית, בחר Supermix עבור בדיקות, ללא DUTP מהתפריט הנפתח Supermix והזן שם קובץ תחת שמור קובץ נתונים As.In הכרטיסיה בחירת בארות, סמן את הבארות לניתוח ולחץ על כלול בארות שנבחרו. לאחר מכן, בכרטיסייה מידע באר, בחר את הבארות שיש להוסיף להן ביאורים.בחר כימות ישיר מהתפריט הנפתח סוג ניסוי. לאחר מכן אכלס את תיאור הדוגמה, סוג הדגימה ותיבות שם היעד, והוסף הערות באר או הערות לוח לפי הצורך. לאחר מכן לחצו על 'החל'.לאחר השלמת תצורת הצלחת, לחץ על התחל הפעלה. לניתוח תוצאות, בחר בכרטיסיה ניתוח נתונים ופתח את הקובץ לניתוח מתפריט קבצי הנתונים שלי. לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה משרעת 1D עבור ניסויים בצבע יחיד, או על הכרטיסייה משרעת דו-ממדית עבור ניסויים בשני צבעים.לאחר מכן, בחר את הבארות הדורשות סף. השתמש בכלי מצב קו סף כדי להחיל ידנית את הסף במרחב הברור בין האוכלוסייה החיובית והשלילית בחלקת המשרעת, ולהבטיח שהכוונת תוצב כך שארבע אוכלוסיות הטיפות מופרדות בבירור. לאחר החלת הסף על כל הדוגמאות, ייצא את התוצאות כקובץ csv לניתוח נוסף על ידי לחיצה על הכרטיסייה טבלת נתונים, ייבוא/ייצוא ובחירה באפשרות ייצוא נתונים גלויים ל- CSV.הזן שם קובץ מתאים ולחץ על שמור. נהלי קריאת ה-PCR והטיפות ששימשו בפרוטוקול זה הדגימו את נוכחותן של אוכלוסיות מופרדות בבירור של טיפות חיוביות ושליליות, הן בערוצי fam והן בערוצי hex. ניתן גם להבחין בין אוכלוסיות דנ"א מיטוכונדריאליות חיוביות לשתי הגשושיות לבין ליזטים חד-תאיים.שיטה זו הראתה גם כי עבור דגימות עם מחיקות בדנ"א המיטוכונדריאלי, קיימת אוכלוסייה מעורבת של טיפות חיוביות כפולות וטיפות חיוביות רק עבור החלק שלא נמחק של הדנ"א. שיטה זו שימשה בהצלחה לספירת מספר עותק הדנ"א המיטוכונדריאלי לכל תא במגוון תאי יונקים, כולל ביציות עכבר ותאים עובריים ראשוניים של עכברים. יתר על כן, בתאים עם הטרופלזמה עם מחיקה גבוהה, האוכלוסייה החיובית עבור בדיקה בודדת נמצאה גדולה משמעותית מהאוכלוסייה החיובית הכפולה.עם זאת, בתאים עם הטרופלזמה עם מחיקה נמוכה, שתי האוכלוסיות היו בגודל דומה. כך שתוצאות מדויקות תמיד מבטיחות שיצירת הטיפות הייתה מוצלחת ושהסף יושם כראוי באמצעות תצוגת המשרעת החד-ממדית או הדו-ממדית. ליזאט שאינו בשימוש יכול לשמש עבור בדיקות אחרות של תאים בודדים, כגון pyrosequencing, אשר יכול למדוד הטרופלזמה פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד.הפיתוח של טכניקה זו אפשר לנו לבצע מדידות מדויקות של מספר עותק DNA מיטוכונדריאלי, ומחיקה heteroplasmy בתאים בודדים, אשר בעבר לא היה אפשרי.

measuring-single-cell-mitochondrial-dna-copy-number-heteroplasmy

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב ליצירת ננו-טיפות מתחלבות לזיהוי חומצות גרעין מטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית או dPCR.

תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית: שיטה ליצירת תגובות PCR ננו-טיפתיות לאיתור מוטציות סרטניות נדירות

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

סרטון זה מדגים את טכניקת תגובת השרשרת של פולימראז טיפות מרובות לכימות סימולטני של אזורי DNA מתילציה באוכלוסיות תאי דם לבנים שונות כסמן ביולוגי מוקדם לאבחון קליני ופרוגנוזה.

תגובת שרשרת של Multiplex Droplet Polymerase לזיהוי מתילציה של DNA בלויקוציטים

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

כאן נתאר שיטה לבצע בו זמנית quantitate ואת ribonucleotides מפה הגנום כולו ב- DNA מאוד שלם ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המשלב המחשוף אנזימטי של דנ א גנומי עם הידרוליזה אלקליין שלה סוף-5´ הבאים . רצף.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

מחקר זה מציג שיטה מהירה של ddPCR לכימות ביומסה מיקרוביאלית בקרקע ויחס פטרייתיה-חיידקים. למרות שפחמן ביומסה מיקרוביאלי שמקורו ב-ddPCR מראה רק קורלציה חלשה עם הערכות הפיוגציה של כלורופורם, השיטה מספקת גישה מולקולרית רגישה וניתנת להרחבה להערכת שפע מיקרוביאלי ללא דגימת קרקע נוספת או שימוש בדגימות קשות.

קביעת ביומסה מיקרוביאלית בקרקע באמצעות PCR טיפות דיגיטליות (ddPCR)

למד מדידת מספר עותקי דנ"א מיטוכונדריאלי ורמות הטרופלזמה ביחידות תאים באמצעות PCR דיגיטלי בטיפות. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק של מוטציות מיטוכונדריאליות בביולוגיה תאית.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

גלה סרטונים נוספים