Name: סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למדו פרוטוקול לספירת סינפסות סרט בשבלול גרביל צעיר וזקן באמצעות אימונו-תיוג ודימות קונפוקלי. השיטה מאפשרת הערכה כמותית של שלמות סינפטית ומחקר אובדן שמיעה הקשור לגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לליצ'ון ז'אנג על שסייע בהקמת השיטה וליחידת השירות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אוניברסיטת קרל פון אוסייצקי באולדנבורג, על השימוש במתקני ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

בעזרת השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן לאימונולציה של IHCs ומבנים סינפטיים בשבלול מגרבילים צעירים ומבוגרים, לזהות סינפסות פונקציונליות משוערות על ידי לוקליזציה משותפת של אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, להקצות אותם ל-IHCs בודדים ולכמת את מספרם, נפחם ומיקומם. הנוגדנים המשמשים בגישה זו תייגו גם תאי שיער חיצוניים (OHCs; myoVIIa) ואת הסרטים הקדם-סינפטיים שלהם. יתר על כן, חלופה בת קיימא לתיוג חיסוני הן של IHCs והן של OHCs היא נוגדן נגד אוטופרלין, כאשר OHCs נראים הרבה יותר חלשים מ- IHCs.
ניתן ל...

ליקוי שמיעה הקשור לגיל הוא אחת המחלות הנפוצות ביותר בעולם המשפיעה על יותר משליש מאוכלוסיית העולם בגילאי 65 ומעלה1. הסיבות הבסיסיות עדיין נמצאות בוויכוח ונחקרות באופן פעיל, אך עשויות לכלול את אובדן הסינפסות המיוחדות המחברות תאי שערה פנימיים (IHCs) עם סיבי עצב שמיעתיים2. סינפסות סרט אלה מורכבות ממבנה קדם-סינפטי שיש בו שלפוחיות מלאות במוליך העצבי גלוטמט הקשור אליו, כמו גם קולטני גלוטמט α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) קולטני גלוטמט 3,4,5. בגרביל, כ-20 סיבי עצב שמיעתיים אפרנטיים יוצרים קשר עם IHC אחד 6,7,8. הסיבים ב-IHC הפונים אל המודיולוס מנוגדים לסרטים סינפטיים גדולים, בעוד שהסיבים המתחברים בצד העמוד של ה-IHC מפנים סרטים סינפטיים קטנים (כלומר, בחתולים9, גרבילים7, שרקנים10 ועכברים 3,11,12,13,14). יתר על כן, בגרביל, גודלם של הסרטים הקדם-סינפטיים וכתמי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים מתואמים באופן חיובי 7,14. סיבים המתנגדים לסרטים גדולים בצד המודילרי של ה-IHC הם קטנים בקליבר ובעלי קצבים ספונטניים נמוכים וסף גבוה15. ישנן עדויות לכך שסיבים בעלי קצב ספונטני נמוך פגיעים יותר לחשיפה לרעש10 ולתרופות אוטוטוקסיות16 מאשר לסיבים בעלי סף נמוך ספונטני גבוה, הממוקמים בצד העמוד של מעגלים משולבים15.
אובדן הסינפסות של הסרט הוא האירוע הניווני המוקדם ביותר בליקוי שמיעה הקשור לגיל העצבי של השבלול, בעוד שאובדן תאי הגנגליון הספירליים וסיבי עצב השמיעה שלהם מפגרים אחרי17,18. קורלציות אלקטרופיזיולוגיות כוללות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי17 ופוטנציאלי פעולה מורכבים8; עם זאת, אלה אינם משקפים את הדקויות של אובדן סינפסה, שכן סיבי קצב ספונטני נמוך אינם תורמים לאמצעים אלה16. מדדים אלקטרופיזיולוגיים מבטיחים יותר הם האינדקס העצבי הנגזר מפוטנציאל המסה19 ותגובת הזמן של הפריסטימולוס20. עם זאת, אלה אמינים רק אם לבעל החיים אין פתולוגיות שבלול אחרות, מעבר לאובדן סיבי עצב שמיעתיים, המשפיעות על פעילותם של סיבי העצב השמיעתיים הנותרים8. יתר על כן, ערכי סף שהוערכו התנהגותית בגרביל לא היו מתואמים עם מספרי סינפסה21. לכן, כימות אמין של סינפסות הסרט ששרדו, ולכן, מספר סיבי העצב השמיעתיים התפקודיים אפשרי רק על ידי בדיקה ישירה של רקמת השבלול.
הגרביל המונגולי (Meriones unguiculatus) הוא מודל חייתי מתאים לחקר ליקוי שמיעה הקשור לגיל. יש לו תוחלת חיים קצרה, יש לו שמיעה בתדירות נמוכה הדומה לבני אדם, הוא קל לתחזוקה, ומראה קווי דמיון לפתולוגיות אנושיות הקשורות לליקוי שמיעה הקשור לגיל 2,22,23,24. גרבילים נחשבים לגיל מבוגר כאשר הם מגיעים לגיל 36 חודשים, שהוא לקראת סוף אורך החיים הממוצע שלהם22. חשוב לציין, אובדן תלוי גיל של סינפסות סרט הודגם בגרבילים שגדלו והתיישנו בסביבות שקטות 8,21.
כאן מוצג פרוטוקול לתבל, לנתח ולנתח שבלול מהגרבילים בגילאים שונים, ממבוגרים צעירים ועד זקנים. נוגדנים המכוונים נגד רכיבים של presynapse (CtBP2), מדבקות קולטן גלוטמט פוסט-סינפטי (GluA2) ו- IHCs (myoVIIa) משמשים. מופעל קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי המפחית את הרקע בשבבייה מזדקנת ומשאיר את האות הפלואורסצנטי ללא פגע. יתר על כן, ניתן תיאור של כיצד לנתח את השבלול כדי לבחון הן את האפיתל החושי והן את stria vascularis. אורך השבלול נמדד כדי לאפשר בחירה של מיקומי שבלול מובחנים המתאימים לתדרים הטובים ביותר הספציפיים25. כימות של מספרי סינפסה מתבצע עם התוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ26. כימות נוסף של נפחי סינפסה ומיקומים בתוך HC הבודד מבוצע עם תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב- Matlab. תוכנה זו אינה זמינה לציבור, מכיוון שלמחברים חסרים המשאבים לספק תיעוד ותמיכה מקצועיים.

<table><tbody><tr><td>אלבומין Fraction V נטול ביוטין</td><td>קארל רות'</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CtBP2 (עכבר חד שבטי IgG1)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-GluA2 (עכבר חד-שבטי IgG2a)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עכבר (IgG1)-AF 488</td><td>בדיקות מולקולריות בע"מ.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anti-MyosinVIIa (ארנב פוליקלונלי IgG)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק להב & מפסק - לסתות שטוחות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לעורקי בון - קצה כדורי</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>עובי כיסוי 1.5H, 24 x 60 מ"מ</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי חד פעמי</td><td>הנרי שיין</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-בדיקות מולקולריות</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Fine</td><td>Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, מוחלט 99.8%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td> Corporation <td></td><td></td></tr><tr><td>Feather להב קצה כפול</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 צינורית</td><td>הנרי שיין</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>פיג'י</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, שמן טבילה 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 ס"מ (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td> <td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Ismatec</td><td></td><td>משאבה פריסטלטית</td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>מקור אור לסטריאומיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo מספריים טונגסטון קרביד ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>לשימוש בסביבה קרה</td></tr><tr><td>Narcoren (פנטוברביטל)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe ב.ו.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>קארל רוט</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי ללא פתחי אוורור</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מי מלח חוצץ פוספט:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום פוספט</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>מונופוטסיום פוספט</td><td>קארל רוט</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>קארל רוט</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי כובע בורג</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>קארל רוט</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>סטודנט אדסון מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>סטודנט Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ הידבקות סופרפרוסט</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher Biotium</td><td></td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים, 3 מ"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade הרכבה מעבדות</td><td>וקטור</td> בינוני <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR בסיסי</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 מצורף צלחת עבור Vibrax VXR בסיסי</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (סטריאומיקרוסקופ)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>אינו זמין עוד</td></tr></tbody></table>

סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

ההנחה היא שאובדן הסינפסות של הסרט המחברות בין תאי שערה פנימיים לסיבי עצב שמיעתיים עזים הוא אחד הגורמים לאובדן שמיעה הקשור לגיל. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי אובדן של סינפסות סרט היא סימון חיסוני מכיוון שהיא מאפשרת דגימה כמותית מכמה מקומות טונוטופיים בשבב בודד. עם זאת, המבנים המעניינים קבורים עמוק בתוך השבלול הגרמי. גרבילים משמשים כמודל לבעלי חיים לליקוי שמיעה הקשור לגיל. כאן מתוארים פרוטוקולים שגרתיים לקיבוע, אימונו-לבלים של שבלול גרביל, הדמיה קונפוקלית וכימות מספרים ונפחים של סינפסות של סרט. יתר על כן, האתגרים המסוימים הקשורים להשגת חומר טוב מאנשים מזדקנים בעלי ערך מודגשים. 
גרבילים מורדמים מורדמים ומופרעים קרדיווסקולרית, או שהבולות הטימפניות שלהם מנותחות בקפידה מתוך הגולגולת. השבלול נפתחים בקצה ובבסיס ומועברים ישירות לקיבוע. ללא קשר לשיטה הראשונית, השבלולים הם postfixed ולאחר מכן decalcified. לאחר מכן, הרקמה מסומנת בנוגדנים ראשוניים נגד מבנים ותאי שיער טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. לאחר מכן, השבלולים מודגרים עם נוגדנים משניים המתויגים פלואורסצנטית שהם ספציפיים כנגד אלה העיקריים שלהם. השבלול של גרבילים מזדקנים מטופלים לאחר מכן באמצעות קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי כדי להפחית את הפלואורסצנציה המשמעותית בדרך כלל ברקע של רקמות של בעלי חיים מבוגרים. 
לבסוף, שבלול מנותחים לתוך 6-11 קטעים. כל אורך השבלול משוחזר כך שניתן לקבוע באופן מהימן מיקומים ספציפיים של שבלול בין פרטים. ערימות תמונות קונפוקליות, שנרכשו ברצף, מסייעות לדמיין תאי שיער וסינפסות במיקומים שנבחרו. ערימות הקונפוקלים מתפרקות, והסינפסות נספרות באופן ידני באמצעות ImageJ, או שכימות נרחב יותר של מבנים סינפטיים מתבצע עם הליכי ניתוח תמונה שנכתבו בהתאמה אישית ב- Matlab.

שבלולים נקטפו לאחר זלוף קרדיווסקולרי עם קיבוע של החיה כולה או נותחו במהירות לאחר המתת החסד של החיה וטבילה קבועה. בשיטה השנייה, ה-IHCs נשארו במקומם במהלך הנתיחה, בעוד שבמקרים של זלוף לא מוצלח ולכן רקמה לא קבועה מספיק, האפיתל החושי הושמד לעתים קרובות. שימו לב שהמחברים נתקלו במקרים שבהם קיבוע השבלול לאחר זלוף טרנסקרדיאלי לא היה מספיק בזמן שקיבוע המוח עדיין היה מספיק. עדיין ניתן היה להציל רקמה מפיח נחות על ידי פתיחת חורים לתוך הפסגה והבסיס של השבלול ודחיית השבלול על ידי טבילה ב-4% PFA למשך יומיים.
<p class="jove_content"...

מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

פרוטוקול זה מאפשר את הערכת השלמות הסינפטית בשבב של הגרביל בכל הגילאים. זה חשוב למחקר בסיסי על בעיות שמיעה, בפרט, עקב הזדקנות. הפרוטוקול מהיר יחסית ומניב נתונים כמותיים מכמה מקומות לאורך השבלול.יתר על כן, הוא מטפל בבעיה ספציפית של רקמת הזדקנות על ידי שימוש ב- autofluorescence quencher. התנוונות של סינפסות היא הסימן המוקדם ביותר לאובדן תפקוד בשבב. כימותו הוא כלי חשוב במחקר לקראת פיתוח כלי אבחון לא פולשניים לסינפטופתיה.דיסקציית השבלול היא החלק המכריע ביותר הדורש תרגול, ולכן עדיף להתחיל עם שבלול לא ניסיוני. התחילו בהסרת הבולה. חותכים את העצם עם מספריים או מפצחים את העצם עם מלקחיים ומסירים אותה עם מלקחיים כדי להגיע לשבבייה.הסר את תעלות המאלאוס, האינקוס והחצי-עיגול. הסר בזהירות את העצם המכסה את פסגת השבלול ושרט את עצם השבלול עם מלקחיים כדי ליצור חורים קטנים בקצה ובפנייה הבסיסית או לתקוע בזהירות חורים בשני המקומות. מיד להעביר את bullae לתוך לפחות 50 מיליליטר של קיבוע קר.כדי לחתוך את השבלול לשניים, יש למקם חתיכת סכין גילוח ארוכה יותר מהאורך המפותל של השבלול למחזיק להב. לאחר מכן, הניחו את השבלול בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו. חותכים עודפי רקמות עם סכין גילוח או עם מספריים עדינים.החזיקו את השבלול במקומו עם מלקחיים עדינים וחתכו לשניים לאורך המודיולוס. הכן תמיסה של 5% של quencher autofluorescence על ידי ערבוב זה עם 70% אתנול. מניחים את השבלול בתמיסה זו ומדגרים אותו למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר ולאחר מכן שוטפים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS למשך חמש דקות.לצורך כריתת השבלול, אספו שני מלקחיים עדינים, מלקחיים עדינים במיוחד, וואנות, מספריים קפיץ, מחזיק להב, סכין גילוח, ומלאו צלחת פוליסטירול פטרי ומכסה שלה ב-PBS. לשבור חתיכות מסכין הגילוח כדי לקבל משטח חיתוך של שניים עד ארבעה מילימטרים. חותכים את השבלול לשניים כפי שמוצג בסעיף להכנת רקמות.בזהירות לתקן את חצי השבלול עם המלקחיים כך שקצה החתך פונה כלפי מעלה. השתמשו במספריים קפיציים עדינים כדי לחתוך את עצם השבלול מעל ההליקוטרמה המכסה את הפסגה. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לבודד את הפנייה האפית על ידי חיתוך דרך המודיולוס ועצב השמיעה וסקאלה וסקליבולי.בצע שני חתכים בכל צד של עצם השבלול למעלה, או אם stria vascularis אינו נחוץ להערכה נוספת, ישירות דרך stria vascularis של הפנייה האמצעית. השתמש בסכין הגילוח כדי להפריד בין חלקי השבלול. לחלופין, לחתוך בין האיבר של קורטי לבין stria vascularis.השאירו את ה-stria vascularis מחוברים לרצועה הספירלית והסירו את העצם המנופחת באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, העבירו את חלקי השבלול למכסה צלחת פטרי מלא ב-PBS. הסר רקמות עודפות על דפנות העמוד והטודיוליה כך שכל התושבות ישכבו מאוחר יותר על המגלשה שטוחה ככל האפשר.חתיכות שבלול גדולות, במיוחד אלה שמקורן בפנייה הבסיסית, יש לחתוך לשתי חתיכות. בזהירות להסיר את קרום tectorial עם מלקחיים סופר עדינים. מניחים את חתיכות השבלול על מגלשה לתוך טיפה של מדיום הרכבה, ומבטיחים שהאיבר של קורטי פונה כלפי מעלה.הזיזו את פיסת השבלול למישור הסגיטלי וחפשו אינוויגינציה של הלימבו הספירלי בסמיכות לתאי השערה הפנימיים. את האינווגינציה הזו של הלימבוס הספירלי ניתן לראות בצורה ברורה יותר בחלקי השבלול האמצעיים והבסיסיים. העבר את כל השבלול ואת כל הסטריה וסקולרית לשקופית המיקרוסקופ על ידי חזרה על שלבים אלה.מכסים מחליקים את המגלשה ומוסיפים לק שחור סביב הקצוות לאיטום. יבשו בחושך ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס. פתח עותק של הערימות המפורקות בתוכנת ImageJ הטעונה בתוסף BioVoxxel.פצל את הערוצים על-ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן על צבע ולאחר מכן על פיצול ערוצים. מזג אותם על-ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן על צבע ולאחר מכן מיזוג ערוצים כדי להקצות צבעים שונים. המר את התמונה למחסנית RGB על-ידי לחיצה על תמונה ולאחר מכן עבור אל צבע ולחץ על מחסנית ל- RGB.התאם את הבהירות והניגודיות על-ידי לחיצה על תמונה, כוונן ולאחר מכן על בהירות/ניגודיות. השתמשו ב'אוטומטי' או ב'סליידר' כדי לוודא שהמבנים שלפני ואחרי הסינפטיה ותוויות תאי השיער הפנימיים נבדלים מהרקע. סמן חמישה תאי שיער פנימיים באמצעות כלי הטקסט על-ידי לחיצה על המיקום הרצוי בתוך הערימה.לאחר מכן, עבור אל נתח, ולאחר מכן כלים, ובחר מנהל החזר על ההשקעה. סמן את תוויות תיבת הסימון כדי לתייג את הנקודות במספר. התקרבו לתא השיער הפנימי המעניין.לחץ לחיצה ימנית על כלי הנקודות כדי לבחור במצב ריבוי נקודות. גלול בממד Z וספור את הסינפסות הפונקציונליות של הסרט, אשר מזוהות על-ידי סרט טרום-סינפטי בשילוב עם מדבקת גלוטמט פוסט-סינפטית. לאחר בחירת כל המבנים המעניינים, לחץ על הוסף את מנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן לחץ על השם השרירותי ובחר שנה שם.בעזרת כלי היד, התאם את התמונה כך שתציג באופן מלא את תא השיער הפנימי הבא. שנה מכלי ריבוי נקודות לכלי נקודה כדי להימנע מהוספת פונקטה נוספת לנתונים שאוחסנו בעבר. לחץ על מבנה מעניין בתוך תא השיער הפנימי הבא ושנה לכלי Multi-point.המשך להוסיף את סינפסת הסרט הפונקציונלית במנהל ההחזר על ההשקעה עד שכל תאי השיער הפנימיים יוערכו. לחץ על ערכת נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן על מדידה. המתן להופעת חלון חדש המפרט את נקודות הנתונים שנמדדו ולחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור רשימה זו כגיליון אלקטרוני.שמור את התמונה על-ידי הפעלת 'הצג הכל' במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על Flatten כדי להוסיף לצמיתות את תוויות הנקודות לערימה ולחץ על הסכימו לסגור על ידי שמירת השינויים. הקרנות של מחסנית Z מהשבלול של גרביל צעיר בן 10 חודשים מראות שתאי השיער הפנימיים המסומנים במיוזין 7A המתוארים כאן בקווים מקווקווים לבנים היו בניגוד חד לרקע.הסרטים הטרום-סינפטיים סומנו ב-anti-CtBP2 שניים שהוצגו בירוק, ואילו טלאי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים סומנו באנטי-גלו-גלו-2 המוצג באדום. השבלול מגרביל זקן בן 38 חודשים טופל בקוונצ'ר האוטופלואורסצנטי והראה תאי שערה פנימיים מובחנים עם מבנים ברורים לפני ואחרי הסינפטיה. כדי לבחון את יציבות האימונו-לבל, אותה פיסת שבלול מהגרביל הצעיר צולמה לאחר שלושה חודשים ו-29 וחצי חודשים.למרות יחס האות לרעש המופחת, הסינפסות הפונקציונליות היו נבדלות וניתנות לכימות. גם אם חתך נכשל, הרכיבו את פיסת הרקמה הנותרת כדי להעריך מאוחר יותר את אורך השבלול המלא בצורה המדויקת ביותר. הנתונים מפרוטוקול זה הם בעלי ערך רב במיוחד אם הם קודמים לבדיקות שמיעה אלקטרופיזיולוגיות או פסיכופיזיות, ולאחר מכן מתואמות בנפרד עםן.

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

סרטון וידאו זה מדגים שיטה להערכת סינפסות רצועת הכלים באזורים ספציפיים של שבלול העכבר. הוא משתמש בטכניקות דימות חיסוני וקונפוקלי כדי לזהות סינפסות תפקודיות על פני אזורי תדר שונים בכל סיבוב שבלול.

הערכה של סינפסות ברצועת הכלים באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר

הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

למדו פרוטוקול לספירת סינפסות סרט בשבלול גרביל צעיר וזקן באמצעות אימונו-תיוג ודימות קונפוקלי. השיטה מאפשרת הערכה כמותית של שלמות סינפטית ומחקר אובדן שמיעה הקשור לגיל.

סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

גלה סרטונים נוספים