Name: טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: למדו שיטה כימית לטריפוספורילציה של אוליגונוקלאוטידים בקצה 5' באמצעות salicyl phosphorochloridite ופירופוספט. הפרוטוקול מאפשר סינתזה של אוליגונוקלאוטידים מופוספורים כולל L-RNA לא טבעי ליישומים בביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגרג ספרינגסטין, נטשה פול, צ'ארלס אולה ג'וניור, ג'ונתן סצ'פנסקי וקטרינה טג'ונג על דיונים שימושיים על שיטות עבודה מומלצות לתגובות טריפוספוריות כימיות ולג'רלד ג'ויס על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק MCB 2114588 מהקרן הלאומית למדע.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הליך הטריפוספורילציה המתואר כאן תואם באופן נרחב לסינתזת אוליגונוקלאוטידים באמצעות כימיה סטנדרטית של פוספוראמידיט. נוקלאוזידים זרחניים צריכים להיות בעלי קבוצות הגנה על בסיס-לבילה התואמות להגנה מהירה ב-AMA39, כולל β-ציאנואתיל הסטנדרטי על הפוספיט, ואיזובוטיריל, דימתילפורמידיל, אצטיל, פנוקסיאצטיל או 4-איזופרופילפנוקסיאצטיל על האמינים האקסוציקליים של הנוקליאובסיסים. קבוצות ריבוז 2'-הידרוקסיל צריכות להיות מוגנות על ידי קבוצות הגנה על סיליל, או t-butyldimethylsilyl (TBDMS) או tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. כמו כן דווח כי קבוצת הפיוואלויליאוקסימתיל הבסיסית (PivOM) תואמת לטריפוספורילציה כימית30.
שיטות רבות תוארו עבור הטריפוספורילציה הכימית של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים 28,29,30,31,32,33,34,35. מצאנו כי טריפוספוריה באמצעות ריאגנט לודוויג-אקשטיין37 היא אחת הנגישות ביותר, ואינה דורשת סינתזה מיוחדת של ריאגנטים וללא ציוד מיוחד. Oligonucleotide 5′-triphosphates שהוכנו בשיטה זו שימשו באופן שגרתי כמצעים עבור RNA ligase ribozymes, כולל שימוש ב- L-RNA oligonucleotide triphosphates בלתי נגישים מבחינה אנזימטית כדי להשיג סינתזה ושכפול תלויי תבנית של חומצת גרעין "תמונת מראה" זו 14,16,17,18 . השיטה מתאימה גם להכנת רנ"א קטנים של 5′-triphosphorylated לולאת גזע, שהם מפעילים חזקים של התגובה החיסונית המולדת אצל בעלי חוליות 6,7.
הריאגנט לודוויג-אקשטיין, salicyl phosphorochloridite37, הוא תגובתי מאוד למים, ולמעשה מנקה כל מים שהוכנסו בעת המסת הריאגנט לפני ההעמסה על עמוד האוליגונוקלאוטיד. עם זאת, לאחר נקודה זו, אוליגונוקלאוטיד 5′-phosphitylated יגיב באופן מועדף עם כל מים המוחדרים למערכת על פני פירופוספט, ויצר תוצר צד של 5′-H-phosphonate לאחר עבודה 28,37,38. הכנה מדוקדקת של ריאגנטים של טריפוספורילציה ותא התגובה של הטריפוספוריה מבטיחים שמוצר צד זה לא נוצר. לייבוש ממסים, מסננות מולקולריות מסוג 4 Å נמכרות ארוזות מראש בשקיות טפלון התואמות לרוב הממסים האורגניים תחת שמות מותגים שונים על ידי רוב חברות הריאגנטים לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים. אמצעי זהירות נוספים, כגון ביצוע טריפוספורילציה בתא כפפות תחת אטמוספירה נטולת מים, בדרך כלל אינם נחוצים.
התגובה של 5′-phosphitylated oligonucleotide עם TBAP יוצרת ביניים מחזורי 5′-trimetaphosphite, אשר לאחר מכן מחומצן למחזור 5′-trimetaphosphate באמצעות תמיסת מחמצן סינתזה של אוליגונוקלאוטידים (יוד במים/פירידין/THF). יש לציין כי פתרונות מחמצנים מסחריים משתמשים בכמויות משתנות של יוד, וחיוני להשתמש בריכוז היוד הגבוה של 0.1 M כדי להבטיח חמצון מלא לטריפוספט. המכפלה המחזורית עוברת הידרוליזה ל-5′-triphosphate הליניארית הסופית באותה תמיסה37, ויש להשתמש בתמיסות מחמצנות חלופיות נטולות מים אם יש צורך בלינאריזציה עם נוקלאופילים שאינם מים (ראו בהמשך יישומים)33. כל טרימטפוספט מחזורי שיורי, לעומת זאת, יהיה ליניארי במהלך ההגנה האלקליין שלאחר מכן של האוליגונוקלאוטיד. הידרוליזה של 5′-טרימטפוספט מחזורי מניבה רק את הטריפוספט הליניארי, ולא המסתעף37,46.
בדרך כלל אין צורך לשנות את ההגנה של אוליגונוקלאוטיד כך שתתאים ל-5′-triphosphorylation, אך יש לנקוט כמה אמצעי זהירות. הטריפוספט יציב יחסית לחשיפה קצרה לתנאים אלקליין, אך יש להיזהר שלא לחשוף את הטריפוספט ל-AMA זמן רב מהנדרש. יש להימנע מהגנה על קבוצות הדורשות טיפול ממושך יותר באמוניה או ב- AMA במשך יותר מ -10 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. טיפולים עדינים יותר, כגון 2 שעות באמוניה בטמפרטורת החדר מקובלים כאשר הם תואמים לקבוצות הגנה אחרות על זרחן-אמידיט. שיטת הגנה נפוצה ומהירה עבור אוליגונוקלאוטידים RNA סינתטיים המוגנים על ידי סיליל משתמשת בטריאתילמין טריהידרופלואוריד ובטמפרטורה גבוהה47; עם זאת, יש להימנע מכך בעת הכנת RNA 5′-triphosphates מכיוון שנמצא כי התנאים החומציים הממושכים מאיצים הידרוליזה של טריפוספט31,32.
דף הכנה הוכיח את עצמו כשיטה הפשוטה והאמינה ביותר לטיהור לאחר ההגנה של אוליגונוקלאוטידים 5′-טריפוספוריים (איור 3 ואיור 4). עם זאת, HPLC הכנה בפאזה הפוכה יכול לשמש גם לטיהור מוצרים משולשים. נוכחותם של 5′-דיפוספט, ובמידה פחותה יותר, 5′-מוצרים מונופוספטים נצפית באופן שגרתי בעת אימות טריפוספורילציה על ידי ספקטרומטריית מסה. צפינו בפיצול של 5′-triphosphate במהלך ספקטרומטריית מסה מחומר טהור מאוד שהוכן על ידי סינתזה כימית או שעתוק, במיוחד אם המכשיר אינו מותאם לניתוח של אוליגונוקלאוטידים. אף על פי כן, ניתוח RP-LC מראה לעתים קרובות ש-10%-20% מתוצר הצד של 5′-דיפוספט קיים באוליגונוקלאוטידים ארוכים יותר של 5′-טריפוספורלאטים (איור 4). תכשירים מסחריים של tributylammonium pyrophosphate יכול להיות מזוהם עם עד 20% מונופוספט, אשר יניב 5′-דיפוספט כמוצר צד במהלך triphosphorylation30,31. הכנה מדוקדקת של מגיב זה בתוך הבית יכולה להניב הרבה יותר מניות TBAP טהורות31. עם זאת, מצאנו שאוליגונוקלאוטידים טריפוספוריים באמצעות מקורות מסחריים של TBAP עדיין מראים תגובתיות דומה או גדולה יותר כאשר משתמשים בהם כמצעים בתגובות אנזימטיות (איור 5B), בהשוואה לחומר שהוכן על ידי שעתוק חוץ גופי.
שימוש נוסף ראוי לציון אחד בטריפוספוריה אוליגונוקלאוטיד עם ריאגנט לודוויג-אקשטיין מנצל את הטרימטופוספיט המחזורי ביניים33. אם שלב החמצון הבא מתנהל עם 1 M t-butyl peroxide בהקסנס, המשמש לעתים קרובות לחמצון אוליגונוקלאוטיד בתנאים נטולי מים, חמצון של הפוספיט מתרחש ללא הידרוליזה של פתיחת טבעת, המניבה את הטרימטפוספט המחזורי. לאחר מכן ניתן להגיב על ביניים זה עם נוקלאופילים ראשוניים של אמין או אלכוהול כדי להניב 5′-triphosphates עם שינויים γ-פוספט. שינויים אלה כוללים הוספת תג ליפופילי המקושר על ידי קשר פוספורמידאט, המאפשר טיהור מהיר של טריפוספט ספציפי על ידי RP-LC, ואחריו הידרוליזה חומצית של התג מהטריפוספט33. שינויים פלואורסצנטיים בעמדת γ-פוספט יכולים גם להיות מוצגים לשימוש ככתבים פלואורסצנטיים בזמן אמת לתגובות קשירת ריבוזים-מזורזות15,33.

הצורה 5′-triphosphorylated של RNA נמצאת בכל מקום בביולוגיה מכיוון שהיא נוצרת על ידי שעתוק RNA בכל תחומי החיים ועל ידי שכפול RNA במהלך מחזור החיים של נגיפי RNA רבים. טריפוספטים אלה משמשים כמצע להיווצרות של mRNA מכוסה 7-מתילגואנילט באאוקריוטים, ולכן ממלאים תפקיד חיוני בביטוי חלבונים1. לעומת זאת, הטריפוספט נשמר בחיידקים ובווירוסים; לפיכך, RNA 5′-triphosphates מוכרים על ידי מווסתי תגובת חסינות מולדת באאוקריוטים 2,3,4,5,6,7. מחוץ לביולוגיה, שורה של RNA ligase ribozymes פותחו כדי להשתמש במבחנה 5′-triphosphate 8 ושונו לשימוש במבחני אבחון 9,10,11,12,13,14,15. ריבוזים אחד כזה יכול לשמש לסינתזה תלוית תבנית של L-RNA, האננטיומר הלא-ביולוגי של "תמונת המראה" של D-RNA טבעי, מ-L-RNA קטן אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים 16,17,18. ההכנה השגרתית של אוליגונוקלאוטידים טריפוספוריים בעלי רצף משתנה והרכב עמוד שדרה חיונית לחקר מערכות אלה.
השיטה הנפוצה והנגישה ביותר להכנת RNA 5′-triphosphates במעבדה היא על ידי שעתוק חוץ גופי. עם זאת, RNA המיוצר על ידי שיטה זו מוגבל ברצף ובגודל על ידי דרישות מקדם וסובסטרט של אנזים RNA פולימראז. T7 RNA פולימראז ונגזרות מיוחדות הם הפולימראזות הנפוצות ביותר המשמשות למטרה זו 19,20,21,22. רנ"א מתועתק במבחנה שהוכן עם אנזימים אלה חייב להיות יזום עם פורין 5′-terminal והוא מוטה מאוד כלפי פורינים ב-10 הנוקלאוטידים הראשונים23,24. יתר על כן, שילוב אנזימטי של נוקלאוטידים שעברו שינוי בסיס או עמוד שדרה הוא במקרה הטוב לא יעיל ולעתים קרובות יותר בלתי אפשרי עם פולימראזות טבעיות, ומגביל את ההזדמנות לייצר אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים המורכבים מכל דבר מלבד D-RNA טבעי. גורם מגביל נוסף הוא שרנ"א שנוצר על ידי שעתוק חוץ גופי יכול להכיל הטרוגניות משמעותית של 5′ו-3′, והוא מיוצר כתוצרים הטרוגניים ביותר כאשר הוא קצר מ-20 nt 23,24,25,26,27.
לעומת זאת, טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים שהוכנה על ידי סינתזת פוספוראמידיט בפאזה מוצקה 28,29,30,31,32,33,34,35 יכולה לשמש להכנת אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים באורך 3-50 nt, מכל רצף. בנוסף, ניתן להוסיף מגוון עצום של שינויים בחומצות גרעין הנגישים לסינתזת פוספורמידיט לאוליגונוקלאוטידים לפני 5′-טריפוספורילציה 14,15,16,17,18,29,36. רבות משיטות אלה משתמשות בריאגנט הפוספילציה סליצ'יל פוספורוכלורידיט, אשר פותח על ידי לודוויג ואקשטיין עבור טריפוספורילציה בשלב התמיסה של מונונוקלאוזידים37. טריפוספורילציה של אוליגונוקלאוטידים עם מגיב זה מושגת על הפאזה המוצקת על ידי פוספטיצלציה של האוליגונוקלאוטיד 5′-הידרוקסיל, המרה לטריפוספט על ידי תגובה עם פירופוספט וחמצון, ולאחר מכן נהלים סטנדרטיים לביקוע של האוליגונוקלאוטיד מהתמיכה המוצקה, ההגנה והטיהור (איור 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> איור 1: סכימה לטריפוספורילציה של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים. בשלב הראשון, האוליגונוקלאוטיד 5ʹ-הידרוקסיל הוא פוספטיזציה עם SalPCl. בשלב הבא, הפוספיט 5ʹ-salicyl sphite מגיב עם TBAP כדי ליצור את המטפוספיט המחזורי, ואז בשלב השלישי מחומצן כדי ליצור את 5ʹ-טרימטפוספט מחזורי בתמיסת חמצון DNA/RNA סינתיסייזר (0.1 M יוד/פירידין/H2O/THF), שעובר הידרוליזה מהירה כדי להניב את ה-5ʹ-טריפוספט הליניארי באותה תמיסה28,33, 37. ביקוע אלקליין עוקב מתמיכת CPG מוצקה והגנה על האוליגונוקלאוטיד ב- MeNH2/אמוניה מימית תבצע הידרוליזה של כל טרימטפוספט מחזורי שיורי לצורה הליניארית. קיצורים: SalPCl = salicyl phosphorochloridite; TBAP = טריבוטילמוניום פירופוספט; THF = טטרהידרופורן; CPG = זכוכית נקבובית מבוקרת; MeNH2 = מתילאמין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
למרות שדוחות שפורסמו מוקדם באמצעות שיטה זו סבלו לעתים קרובות מתפוקות גרועות וממוצרי צד לא רצויים 28,37,38, תחזוקה קפדנית של תנאי מים היא כל מה שנדרש להשגת תפוקות גבוהות באופן שגרתי. זה יכול להיות מושגת על ידי הכנה זהירה של ריאגנטים ושימוש במכשיר תגובה פשוטה המורכבת מרכיבי פלסטיק סטנדרטיים. כאן אנו מדגימים את השלבים המתאימים לטריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים, כולל הכנת ריאגנטים, הרכבת תא התגובה, תגובת הטריפוספורילציה, ולאחר מכן הגנה וטיהור של אוליגונוקלאוטידים הטריפוספוריים. כמו כן נכלל השימוש הייצוגי באוליגונוקלאוטידים של 5′-טריפוספוריים כמצעים לריבוזימים של ליגאז לסינתזה של תוצרי חומצות גרעין גדולות יותר עם עמודי שדרה טבעיים של D-RNA ו-L-RNA אביוטי.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן מזרק פוליאתרסולפון</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>מסנן מזרק להסרת חלקיקי ג'ל פוליאקרילאמיד כתושים (סעיף 5)</td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן מזרק PTFE</td><td>MilliporeSigma</td><td>מסנן</td><td>מזרק SLLG013SL להסרת שרף CPG (סעיף 5)</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרקי פלסטיק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td> <td>רכיבים של מנגנון טריפוספורילציה (סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>1,4-דיוקסן,</td> ממס טריפוספורילציה <td>296309</td> נטול מים <td>MilliporeSigma</td><td>(סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>2-כלורו-4H-1,3,2-בנזודיוקספוספורין-4-אחד, סליציל פוספורוכלורידיט (SalPCl)</td> מגיב טריפוספורילציה 324124 <td>MilliporeSigma</td><td>(</td><td>סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>בקבוקי זכוכית 30 מ"ל</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>בקבוקים להכנת ממיסים טריפוספורילציה ותמיסת TBAP (סעיף 2)</td></tr> <tr><td>תלת כיווני Stopcock, Polycarbonate/Polypropylene</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>רכיב של מנגנון טריפוספורילציה (סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>תמיסת 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 19:1</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1610144</td><td>עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>אצטוניטריל, נטול מים, 100 מ"ל</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>ממס טריפוספורילציה (סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>מלכודת מנטרלת אמוניה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 ו-ANS121</td><td>לשימוש עם Speedvac DNA130 (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td> <td>מעבדות Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>עבור PAGE, זרז לפילמור אקרילאמיד (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>אמוניה מימית, 28%</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>להכנת ריאגנט להגנה מפני AMA (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>מתילאמין מימי, 40%</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>להכנת ריאגנט להגנה מפני AMA (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>סינתיסייזר אוטומטי של DNA/RNA אוליגונוקלאוטיד</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNA סינתיסייזר</td> כל <td>סינתיסייזר מבוסס עמודות מקובל (סעיף 1)</td></tr><tr><td>מגנט לכידת חרוזים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>ללכידת חרוזי סטרפטווידין (סעיף 7)</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>מעבדות ביו-ראד</td><td>1610404</td><td>למאגר טעינת אוריאה PAGE (סעיף 5)</td></tr><tr><td>משאבת שמן ואקום עמוק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>לשימוש עם ליופילייזר (סעיף 5)</td></tr><tr><td>חומר ייבוש דריריט, 10-20 רשת</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>חומר ייבוש לאחסון כימיקלים וציוד טריפוספורילציה (סעיפים 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>D-RNA 27.3t פולימראז חוצה כיראלי</td><td>שהוכן בבית 18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&PRIME;</td><td>לתגובות ריבוזימים צולבות כיראליות (סעיף 7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPG תומך מוצק, 1,000&Aring;, ארוז מראש 1 &micro; עמודות סינתזת שומה</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>נציג, לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים D-RNA (סעיף 1)</td></tr> <tr><td>נציג זרחנים מוגנים של D-RNA TOM</td><td>CHEMGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td>, <td>לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים D-RNA (סעיף 1)</td></tr><tr><td>עמודות סינתזה ריקות של זירוז, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>עמודות סינתזה לשימוש עם סינתיסייזר DNA/RNA Expedite (סעיף 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&prime;-(חומצה 3-פרופנסולפונית), רכיב</td><td>מאגר תגובת ריבוזים</td> מוצק <td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td> (סעיף 6)</tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), כלאטור</td> יונים מתכת דו-ערכי מוצק <td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>לשימוש במאגרים שונים ( סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>מסננים לזירוז עמודות סינתזה</td> Glen <td>Research</td><td>20-0021-0F</td><td>מסנני עמודות סינתזה בסגנון Expedite, לשימוש עם עמודות סינתזה ריקות (סעיף 1)</td></tr> <tr><td>סורק ג'ל פלואורסצנטי / זרחני</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>להמחשת PAGE אנליטי (סעיפים 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>פורממיד, נטול יונים</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>עבור מאגר טעינת ג'ל פורמיד PAGE (סעיפים 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>תוכנת כימות תמונת ג'ל</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>לכימות תמונות ג'ל סרוקות (סעיף 6)</td></tr> <tr><td>מייבש זכוכית</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>אחסון ממס Triphosphorylation (סעיף 2)</td></tr> <tr><td>תומך מוצק L-RNA CPG, 1,000&Aring;, ChemGenes בתפזורת</td><td></td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>סינתזת אוליגונוקלאוטידים L-RNA (סעיף 1)</td></tr><tr><td>תבנית פטיש L-RNA</td><td>שהוכנה בבית18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>לתגובות ריבוזימים צולבות כיראליות (סעיף 7)</td></tr><tr><td>פריימר L-RNA</td><td>מוכן בבית18</td><td>5&prime;-fluorescein-GGCUCGA-3&prime;</td><td>לתגובות ריבוזימים צולבות כיראליות (סעיף 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM-protected phosphoramidites</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-RNA אוליגונוקלאוטידים סינתזה (סעיף 1)</td></tr><tr><td>מייבש ליופילייזר/הקפאה</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>לריכוז אוליגונוקלאוטידים (סעיף 5)</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט, מוצק</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>לתגובות ריבוזיים (סעיפים 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>N, N-Dimethylformamide,</td><td>ממס Triphosphorylation</td> <td>227056</td> נטול מים של <td>Sigma</td> (סעיף 2)</tr> <tr><td>עמוד התפלה NAP-25 (שרף Sephadex G-25)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>עמודות כרומטוגרפיה חד פעמיות בגודל זרימת הכבידה המכילות שרף Sephadex G-25 (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>מחט נירוסטה ללא ליבה, 20 גרם</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>מחטים לניקוב מחיצות גומי (סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>מחשבון מקדם הכחדה של אוליגונוקלאוטיד</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות</td><td>OligoAnalyzer כלי</td> דגם <td>השכן הקרוב ביותר מחשבון מקדם הכחדה קצר אוליגונוקלאוטיד 260 ננומטר (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>תמיסת מחמצן, 0.1 M יוד ב- THF / פירידין / מים</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>מגיב טריפוספורילציה (סעיף 4)</td></tr> <tr><td>לוחות עמוד</td><td>טימברוק / CBS</td><td>NGP-250-BO ו- NO</td><td>עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>ספק כוח PAGE</td><td>מעבדות Bio-Rad</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>מרווחים ומסרקים של PAGE (אנליטי)Timberrock</td><td>/CBS</td><td>VGS-0725 ו-VGC-0714</td><td>עבור PAGE (סעיפים 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>מרווחים ומסרקים של PAGE (הכנה)</td> <td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R ו-VGC-3001</td><td>עבור PAGE (סעיף 5)</td></tr><tr><td>מעמד PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>סרט איטום שעווה למנגנון טריפוספורילציה (סעיפים 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>PCR thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>לתגובות ריבוזיים צולבות כיראליות (סעיף 7)</td></tr> <tr><td>PD 10 עמוד התפלה (שרף Sephadex G-10)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>עמודות כרומטוגרפיה חד פעמיות בגודל זרימת הכבידה המכילות שרף Sephadex G-10, עבור אוליגונוקלאוטידים < 15 nt (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>מסכי זרחן</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>להמחשת RNA עם תווית 32P (סעיף 6)</td></tr><tr><td>ריאגנטים לסינתזה של זרחנים</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>נציג, לסינתזה סטנדרטית של RNA/DNA (סעיף 1)</td></tr><tr><td>צינור אטום עם מכסה בורג מפוליפרופילן</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם מכסה בורג וטבעת O מסיליקון, להגנה בטוחה מפני AMA ( סעיף 5)</td></tr> <tr><td>פירידין,</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>ממס טריפוספורילציה נטול מים (סעיף 2)</td></tr><tr><td>ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך/יינון אלקטרוספריי (RP-LC/ESI-MS</td><td>)Novatia</td><td>n/a</td><td>שירות מסחרי עבור LC/MS המתמחה באוליגונוקלאוטידים (סעיף 5)</td></tr><tr><td>מחיצת גומי (ID x OD 7.9 מ"מ x 14 מ"מ),</td><td>MilliporeSigma</td> לבן <td>Z564702</td><td>מחיצות להכנת ממיסים טריפוספורילציה ו-TBAP (סעיף 2)</td></tr><tr><td>ריבוזיים משכפל עצמי E</td><td>שהוכן בבית14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&PRIME;</td><td>לתגובות ריבוזים משכפל עצמי (סעיף 6)</td></tr><tr><td>מצע משכפל עצמי A</td><td>שהוכן בבית14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>לתגובות ריבוזים משכפל עצמי (סעיף 6)</td></tr><tr><td>מצע משכפל עצמי B, מתומלל</td><td>מוכן בבית14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>לתגובות ריבוזים משכפל עצמי (סעיף 6)</td></tr><tr><td>מלכודות ייבוש קטנות, 4 & Aring; מסננות מולקולריות</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>מלכודות ייבוש לסינתיסייזר DNA/RNA פוספורמידיטים וריאגנטים טריפוספורילציה (סעיפים 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>נתרן כלורי (NaCl),</td> מלח <td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td> מוצק <td>לשימוש במאגרים שונים (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH),</td> מלח <td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td> מוצק <td>לשימוש במאגרים שונים (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>תוכנה להתאמת נתונים סטטיסטיים</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>להתאמת נתונים מ- PAGE אנליטי למודלים קינטיים (סעיף 6)</td></tr> <tr><td>חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>ללכידת RNA עם תווית ביוטין בתגובות ריבוזיים צולבות כיראליות (סעיף 7)</td></tr> <tr><td>סוכרוז</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>עבור מאגר טעינת אוריאה PAGE (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>TBE מאגר ריצה, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>טטרה-בוטילאמוניום פלואוריד, תמיסה של 1.0 מ' ב-Tetrahydrofuran</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>להסרת קבוצות הגנה של 2&prime;-סיליל (סעיף 5)</td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>לפילמור אקרילאמיד עבור PAGE (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Tributylamine</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>מגיב Triphosphorylation (סעיף 2)</td></tr> <tr><td>Tributylammonium pyrophosphate (TBAP)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Triphosphorylation Reagent (סעיף 2)</td></tr> <tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>חומר חציצה לשימוש במאגרים שונים (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 חומר ניקוי פוליסורבט</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>חומר ניקוי ניטרלי לשימוש עם חרוזים מגנטיים (סעיף 7)</td></tr> <tr><td>אוריאה</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>עבור PAGE ומאגר טעינת ג'ל (סעיפים 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>ספקטרופוטומטר UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>למדידת ריכוזי אוליגונוקלאוטידים (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>צנטריפוגת ואקום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 רכז ואקום</td><td>להסרת AMA ו- THF (סעיף 5)</td></tr> <tr><td>מעבדות קסילן ציאנול</td><td>ביו-ראד</td><td>1610423</td><td>למאגר טעינת אוריאה PAGE (סעיף 5)</td></tr></tbody></table>

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5′-triphosphate הוא שינוי חיוני בחומצת גרעין שנמצא לאורך כל החיים ומשמש יותר ויותר כשינוי פונקציונלי של אוליגונוקלאוטידים בביוטכנולוגיה ובביולוגיה סינתטית. אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הוכנו באופן היסטורי במבחנה בשיטות אנזימטיות. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לאוליגונוקלאוטידים RNA טבעיים, יש העדפות רצף חזקות, והן נוטות לייצר מוצרים הטרוגניים. שיטות חדשות של טריפוספורילציה כימית משלימות הן את העלות המופחתת של סינתזת אוליגונוקלאוטידים אוטומטית על ידי כימיה של זרחן-אמידיט והן את המגוון המגוון של שינויים בנוקלאוטידים הזמינים כיום. לפיכך, הסינתזה של טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים של רצף ואורך שרירותיים, ובאופן אופציונלי המכילה שינויים לא טבעיים שונים, נגישה כעת.
מאמר זה מציג את השיטות והטכניקות המתאימות לטריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים באמצעות סליציל פוספורוכרידיט ופירופוספט. שיטה זו משתמשת בריאגנטים זמינים מסחרית, תואמת לרוב האוליגונוקלאוטידים שהוכנו בשיטות סינתזה סטנדרטיות של פאזה מוצקה, וניתן להשלים אותה תוך 2 שעות לאחר סינתזת אוליגונוקלאוטידים, לפני ההגנה והטיהור. שני שימושים של אוליגונוקלאוטידים טריגונוקלאוטידים בעלי טריפוספוריה כימית כסובסטרטים לאנזימי RNA קטליטיים, כולל סינתזה של גרסת תמונת מראה של ריבוזים של ראש הפטיש מטריפוספטים לא-ביולוגיים מסוג L-RNA טריפוספטים.

יש לסנתז את האוליגונוקלאוטידים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים המתאימים לזרחנים ולסינתיסייזר דנ"א/רנ"א אוטומטי, ולהשאיר את המוצר אוליגונוקלאוטיד מנותק מהתמיכה המוצקה בעמודת הסינתזה הפלסטית המקורית, כאשר קבוצת ה-5ʹ-terminal dimethoxytrityl הוסרה כדי להניב את ה-5ʹ-הידרוקסיל החופשי (סעיף 1). כל האוליגונוקלאוטידים ששימשו בהדגמה זו הוכנו באמצעות 1,000 שרף זכוכית נקבובית מבוקרת Å (CPG) כתמיכה המוצקה ונעשו בקנה מידה של 0.2 או 1 מיקרומול. דוגמאות מייצגות של עמודות סינתיסייזר, שרפים, ריאגנטים וזרחנים מסופקות בטבלת החומרים. עבור תגובות בקנה מידה גדול יותר, ייתכן שיהיה צורך להתאים את אמצעי האחסון והזמנים המשמשים בשלבים הבאים.
תגובת הטריפוספוריה מתבצעת על עמודה בתא תגובה שנבנה בהתאמה אישית (איור 2, סעיף 3) תוך שימוש ברכיבים סטנדרטיים וזמינים מסחרית המפורטים בטבלת החומרים ועוקבת אחר הסכימה המתוארת באיור 1 (סעיף 4)28. חיוני שהתנאים יישמרו נטולי מים לחלוטין במהלך הטריפוספורילציה, ושכל הממסים והריאגנטים יוכנו מראש על מסננות מולקולריות ויאפשרו להם להתייבש באופן מלא לפני השימוש (סעיף 2). טריפוספורילציה בדרך כלל לוקחת 2 שעות להתרחש, ולאחר מכן, ניתן לטפל בעמודה השטופה והמיובשת על פי הליכי הגנה וטיהור אוליגונוקלאוטידים סטנדרטיים (סעיף 5).
לאחר הסרת ההגנה, טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים מטוהרים על ידי דנטורציה של אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE), המציגה רצועת תוצר עיקרית אחת על ידי הצללה אחורית של UV שניתן לכרות ולהתרומם מהג'ל. המוצר 5′-triphosphate מופרד בקלות ממוצרי צד תגובה עבור אוליגונוקלאוטידים קצרים, כפי שמוצג עבור דנ"א טרינוקלאוטיד 5ʹ-טריפוספטים, pppAAA ו-pppCCC, ו-L-RNA טרינוקלאוטיד 5ʹ-טריפוספט pppGAA באיור 3A,B. גם המוצרים 5′-hydroxyl וגם 5′-triphosphate עבור גוזמי הדנ"א AAA וה-CCC נכרתו וזוהו על-ידי ספקטרומטריית מסות וסומנו בהתאם באיור 3A. רצועות נוספות, כפי שהן נראות לעין עבור גוזם הדנ"א AAA, בדרך כלל אינן מכילות מספיק חומר כדי לשחזר ולזהות. עם זאת, נוכחותם של פסים אלה מתואמת עם מסות מכפלה נוספות בתוצרי התגובה הלא-מזוהים (איור 3C), המייצגים בדרך כלל תוצרי צד של 5′-דיפוספט, מונופוספט ו-H-פוספונט, כפי שיפורט להלן.
לאחר טיהור PAGE, ניתן להבהיר אוליגונוקלאוטידים גדולים יותר באמצעות שיטת הריסוק והטבילה42 ומשקעי האתנול הבאים. עם זאת, אוליגונוקלאוטידים הקטנים מ-15 nt אינם יכולים להיות אתנול מזרזים ביעילות, ולכן דורשים הליך שונה לאליטיון ג'ל (שלב 5.11.3). עמודת אי הכללת הגודל החד-פעמי המופיעה בטבלת החומרים מדורגת רק לשימוש עם אוליגונוקלאוטידים הארוכים מ-10 nt. עם זאת, מצאנו כי אוליגונוקלאוטידים קצרים כמו טרימרים יכולים להיות מותפלים ביעילות באמצעות הפרוטוקול המומלץ של היצרן. עם זאת, מומלץ בעת התפלת אוליגונוקלאוטידים קצרים (כמו בשלבים 5.6 ו- 5.11.3) כי העמודה eluate תיאסף בשברים, ושברי המוצר יזוהו על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. עמודת אי-הכללת גודל המותאמת לאוליגונוקלאוטידים קצרים יותר מסופקת בטבלת החומרים כבחירה חלופית. התשואה הסופית מסינתזת אוליגונוקלאוטיד בקנה מידה של 1 מיקרומול לאחר הטיהור היא 50-300 ננומול.
טריפוספורילציה יכולה להיות מאושרת על ידי ספקטרומטריית מסה, שבה למכפלה הטריפוספורית יש מסה +239.94 Da גדולה יותר מ-5′-הידרוקסיל אוליגונוקלאוטיד, אם כי נוכחותם של חומרים המתאימים ל-5′-di ומונופוספט (+159.96 ו-+79.98 Da, בהתאמה) נצפית לעתים קרובות. ניתן לראות גם מכפלת צד של 5′-H-פוספונט עם מסה +63.98 Da ממסת 5′-OH, ורמות גבוהות של מוצר זה מצביעות על כך שהתנאים במהלך הטריפוספורילציה לא היו נטולי מים מספיק. לפני הטיהור, אוליגונוקלאוטידים מוגן בדרך כלל יציגו את כל המוצרים האלה (איור 3C), בעוד שחומר מטוהר יראה שיא המתאים לתוצר 5′-triphosphate יחד עם 5′-di- ומונופוספטים (איור 3D,E).
ספקטרומטריית מסות לבדה בדרך כלל לא תיתן מידה קפדנית של טוהר 5′-triphosphate עקב קצב דיפרנציאלי של יינון ופיצול של הטריפוספט במהלך היינון. כדי למדוד את טוהר המוצר הסופי, מומלץ כרומטוגרפיה נוזלית בפאזה הפוכה וטנדם ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), במיוחד עבור אוליגונוקלאוטידים ארוכים יותר. ניתוח של D-RNA 5ʹ-triphosphates pppACGAGG ו-pppGAGACCGCAACUUA על ידי RP-LC/ESI-MS (איור 4A,B, בהתאמה) מראה טוהר תוצר סופי טיפוסי, המכיל 20% 5ʹ-דיפוספט מכיוון שקשה להפריד בין שני מינים אלה כאשר הם נמצאים על אוליגונוקלאוטידים ארוכים יותר.
אוליגונוקלאוטידים סינתטיים 5′-triphosphate מתפקדים בדרך כלל טוב או טוב יותר מחומרים שהוכנו באופן אנזימטי במחקרים ביוכימיים. בסעיף 6, כדוגמה, הושוו בין מצעי RNA 5′-triphosphate 14 nt שהוכנו באופן סינתטי או על ידי שעתוק במבחנה בתגובת שכפול עצמי 14,15,43,44,45. ריבוזים E מזרזים צירוף של מצעים A ו-B כדי להניב עותק חדש של E בתגובה אוטוקטליטית המסוגלת לצמיחה מעריכית (איור 5A). רכיבי E ו-32P עם תווית A הוכנו על ידי תעתיק חוץ גופי, ומצע משולש B הוכן באופן סינתטי, כמתואר לעיל, או על ידי תעתיק חוץ גופי 14. התקדמות התגובה לשכפול עצמי נוטרה על ידי לקיחת דגימות תקופתיות שנותחו על ידי DENATURING PAGE וכומתו באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי/זרחני. הנתונים שהתקבלו, המתאימים לפונקציית גדילה לוגיסטית, גילו כי מצע B מתועתק או סינתטי תומך בצמיחה מעריכית, אך B סינתטי נותן כמות מעט גדולה יותר של מוצרים (איור 5B). תוצאה זו עשויה לשקף הטרוגניות קומפוזיציונית בקצה 5′של RNA שהוכן על ידי שעתוק חוץ גופי 23,24.
טריפוספורילציה כימית מאפשרת גם סינתזה של טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים שלא ניתן להכין ביולוגית, לא במבחנה ולא בתאים. בחלק 7, טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים לא-ביולוגיים המורכבים מ-L-RNA, האננטיומר של D-RNA טבעי, שהוכן כמו בסעיפים 1-5, שימשו כסובסטרטים עבור פולימראז ריבוזים 27.3t "חוצה כיראליות" של D-RNA, המזרז את הפילמור המכוון תבנית של תוצר L-RNA ארוך יותר מ-L-RNA קצר אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים באופן כללי ברצף כללי. לדוגמה, הריבוזים יכולים לסנתז גרסת L-RNA של מוטיב המחשוף העצמי של ראש הפטיש (איור 6B)18. טריפוספטים מטוהרים של L-RNA trinucleotide שולבו עם פריימר L-RNA בעל התווית פלואורסצין ותבנית L-RNA (איור 6C) והגיבו עם הליגאז הבין-כיראלי. דגימות במהלך התגובה נותחו על ידי PAGE והצטלמו באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי/זרחני כדי להדגים סינתזה של גרסת L-RNA של ריבוזים ראש הפטיש המקודדת על ידי התבנית (איור 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> איור 3: טיהור טרינוקלאוטיד 5ʹ-טריפוספטים. (A) ניתוח דף (שהודגם על ידי הצללה אחורית של UV) של טריפוספורילציה של טרינוקלאוטידים של דנ"א טרינוקלאוטידים טרי-דאוקסיאדנוסין (AAA, כחול) וטרי-דאוקסיציטידין (CCC, אדום), עמוס בכוונה כדי לדמיין תוצרי לוואי קלים. גם תוצר ה-5ʹ-טריפוספט (ppp) וגם החומר ההתחלתי 5ʹ-הידרוקסיל (OH) נכרתו וזוהו על-ידי MALDI-MS. (B) דף הכנה של טריפוספורילציה של L-RNA טרינוקלאוטיד GAA, עם רצועת מוצרים עיקרית שנכרתה וזוהתה כ-5ʹ-טריפוספט (ppp) על ידי ESI-MS. (C) MALDI-MS של מוצרי תגובה גולמית לאחר הגנה ו-(D) מוצרים מטוהרים מ-(A). 5ʹ-טריפוספט (ppp; pppAAA צפוי 1,119 Da, נצפה 1,118 Da; pppCCC צפוי 1,047 Da, נצפה 1,046); 5ʹ-דיפוספט (עמ'), 5ʹ-מונופוספט (p), 5ʹ-הידרוקסיל (OH) ו-5ʹ-H-פוספונט (Hp) מסומנים. (E) ספקטרום מסה מנותק מהזרקה ישירה של ESI-MS של תוצר מבודד של 5ʹ-טריפוספט מ-(B), עם פסגות מזוהות המסומנות (צפויות 1,181.6 Da, שנצפו 1,181.0 Da). כמו כן נצפו 5ʹ-דיפוספט (pp), כמו גם שיאי יונים של נתרן הן עבור תוצרי הטריפוספט והן עבור מוצרי הפוספטים (+22 Da). פסגות מזהמים נפוצות מסומנות בכוכבית. כדי להקל על ההשוואה, ספקטרום המסה מנורמל לעוצמה הגבוהה ביותר שנמדדה בכל ספקטרום ומדווחים כאחוז ביחס לערך זה. קיצורים: PAGE = אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד; MALDI-MS = ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה; ESI-MS = ספקטרומטריית מסת יינון אלקטרוספריי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> איור 4: RP-LC אנליטי של 6 nt ו-14 nt D-RNA אוליגונוקלאוטיד טריפוספטים. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ ו-(B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. טנדם ESI-MS זיהה את השיא העיקרי של שניהם (כ-70%) כ-5ʹ-טריפוספט (ppp), עם כמויות נמוכות יותר של 5ʹ-דיפוספט (pp). קיצורים: RP-LC = כרומטוגרפיה נוזלית בפאזה הפוכה; nt = נוקלאוטידים; ESI-MS = ספקטרומטריית מסת יינון אלקטרוספריי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> איור 5: השוואה בין מצעי אוליגונוקלאוטיד 5ʹ-טריפוספט שהוכנו על ידי סינתזה כימית או תעתיק במבחנה. (A) הריבוזים המשכפלים את עצמם E ligates RNA A ו-5′-triphosphorylated RNA B. (B) השוואה בין תגובות שכפול עצמי באמצעות 10 μM A ו-10 μM B, סינתטיים (מעגלים פתוחים) או מתועתקים במבחנה (עיגולים מלאים). (B) הנתונים היו מתאימים למשוואת הצמיחה הלוגיסטית: [E] = a / (1 + b e-ct), כאשר a היא התשואה הסופית, b היא דרגת הסיגמוידיות, ו- c הוא קצב הצמיחה האקספוננציאלי. שיעורי הצמיחה של שתי התגובות היו זהים, ב-1.14 h-1, בעוד שההיקף הסופי היה גבוה ב-10% עבור תגובות עם B סינתטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> איור 6: פילמור L-RNA חוצה כיראליות עם ריבוזים. (A) D-RNA 27.3t פולימראז ריבוזים, המזרז קשירת L-RNA תלוית תבנית של L-RNA. (B) מוצר ה-L-RNA המסונתז ב-27.3t מהווה חלק ממוטיב אנדונוקלאז של ראש פטיש. (C) פילמור L-RNA מזורז על ידי 27.3t באמצעות תבנית L-RNA שעברה ביוטינילציה (חום), פריימר L-RNA (מג'נטה) המסומן בסוף, וארבעה טרינוקלאוטידים טרינוקלאוטידים (ציאן) בעלי תווית קצה, וארבעה טרינוקלאוטידים טרינוקלאוטידים (ציאן) בעלי תווית קצה, המוכנים באופן סינתטי. (D) ניתוח דף של מכפלות הרחבה של (B) ב-4 שעות ו-24 שעות, המראה כל שילוב של טרינוקלאוטיד עד מכפלה באורך מלא (נקודה שחורה). פריימר L-RNA שלא שוחזר נכלל כסמן ייחוס. קיצורים: PAGE = אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד; M = סמן ייחוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הם מרכיבים הנמצאים בכל מקום במסלולים ביולוגיים חיוניים וראו שימוש הולך וגובר ביישומי ביוטכנולוגיה. כאן אנו מתארים טכניקות לסינתזה וטיהור שגרתיים של אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים, החל מאוליגונוקלאוטידים שהוכנו על ידי טכניקות סינתזה אוטומטיות סטנדרטיות.

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Triphosphorylation הוא שינוי של 5's של RNA בביולוגיה, והוא משמש יותר ויותר ביישומים ביו-טכנולוגיים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר 5'triphosphorylation של כל אוליגונוקלאוטיד שהוכן על ידי סינתזה אוטומטית סטנדרטית. טריפוספורילציה כימית פועלת על אוליגונוקלאוטידים המכילים רנ"א, דנ"א או חומצת גרעין לא טבעית.כאן, L-RNA שמאלי טריפוספורי, האננטיומר של D-RNA ביולוגי, מסונתז מטוהר ומשמש בתגובת ריבוזום. טריפוספורילציה מתבצעת לאחר סינתזה אוטומטית של אוליגונוקלאוטידים ולפני ההגנה. שלבים אלה אינם מוצגים כאן, אך החוקרים צריכים להכיר את השיטות הסטנדרטיות לשניהם.כדי להתחיל, ודא שבסביבת העבודה לזרחון יש סעפת גז עם לפחות שני קווים והבועה מחוברת למקור ארגון יבש בלחץ מתכוונן מכיוון שתגובת הטריפוספורילציה חייבת להתבצע תחת ארגון. לאחר מכן חברו מזרקי פלסטיק מיליליטר אחד לקווים כדי להקל על החיבור למנגנון התגובה. לאחר מכן, אספו את הציוד הכולל מזרקי פלסטיק של מיליליטר אחד, סטופר פוליפרופילן תלת-כיווני, מחטים לא מפרקיות, צינורות פוליפרופילן 1.5 מיליליטר, מרית מתכת קטנה, ואחסנו אותם במיכל אטום או במייבש כביסה עם חומר ייבוש בטמפרטורת החדר לפחות יום אחד לפני השימוש.תחת לחץ ארגון, למשוך 30 מיליליטרים של נטול מים 1, 4-דיוקסן מבקבוק אטום. מעבירים לבקבוק זכוכית יבש של 30 מיליליטר ומוסיפים מלכודת ייבוש. אוטמים עם ספטה מגומי ומאחסנים במייבש עם מייבש שומנים.באופן דומה, להכין 30 מיליליטרים של N, N-דימתילפורמיד, אצטוניטריל, ותערובת של שלושה חלקים דיוקסן וחלק אחד פירידין לפי נפח. הכן תמיסת TBAP על ידי ערבוב של טריבוטילמוניום פירופוספט מוצק עם דימתילפורמיד וטריבוטילאמין בבקבוק זכוכית של 30 מיליליטר כמתואר בכתב היד. הוסף שלוש מלכודות ציור.אוטמים את הבקבוק עם מחיצת גומי מתחת לארגון ובועות עם ארגון למשך 30 דקות. לאחר הכנת אוליגונוקלאוטיד עם 5'הידרוקסיל חופשי על עמודת סינתזה באמצעות סינתיסייזר DNA/RNA אוטומטי. הכן את התא על ידי הסרת הבוכנה ממזרק מיליליטר יבש אחד.חותכים את החלק העליון של המזרק באמצעות מספריים או סכין גילוח ומחברים את המזרק לעמודת הסינתזה. לחלק העליון של המזרק, חברו את הסטופר התלת-כיווני והצמידו את הכניסה הצדדית של ה-stopcock למקור הארגון היבש עם הבועה, כך שהכניסה העליונה של ה-stopcock תשמש כיציאת הזרקת הריאגנטים. הצמידו את המפעילים למעמד עם מלחציים ואטמו את כל המפרקים במעלה הזרם עם סרט איטום שעווה.לאחר מכן התאם את ה- stopcock כך שיציאת ההזרקה תהיה סגורה והמנגנון יהיה פתוח למקור הארגון. סגרו את הבועה ואפשרו לארגון בלחץ נמוך לזרום דרך תא הפעולה למשך חמש דקות. לאחר פתיחת הבועה מחדש, חברו מזרק לתחתית עמודת הסינתזה, שיהיה מזרק הפסולת.לאחר מכן, משוך ארגון דרך העמוד שוב ושוב באמצעות מזרק הפסולת ולאחר מכן חבר מחדש את המזרק עם הבוכנה שנדחפה במלואה פנימה. כדי להוסיף מגיב או ממס, חברו מחט למקור הארגון היבש והכניסו אותה למחיצה של הריאגנט או הממס, תוך הקפדה שלא לטבול את המחט בתכולת הבקבוק. לאחר מכן להרכיב מזרק יבש עם מחט ולהכניס אותו לתוך ריאגנט או ממיס בקבוק מחיצת מבלי לטבול אותו בתכולת הבקבוק.לאחר מכן, מלאו את המזרק בארגון, משכו את המחט מהמחיצה וגירשו את הארגון. לאחר מילוי המזרק בארגון וסילוק פעם נוספת, מלאו את המזרק בנפח הנדרש של ממס או מגיב בלחץ ארגון. התאם את ה-stopcock כך שמקור הארגון יהיה סגור ויציאת ההזרקה תהיה פתוחה.לאחר שהעצירה במכשיר מתכווננת במהירות, הסירו את המזרק והמחט המלאים מבקבוק המקור, נגבו כל ממס שנדבק לצד או לקצה המחט ולאחר מכן הכניסו את המחט ליציאת ההזרקה. לאחר מכן גירשו ריאגנט לתוך האנטי-תא של המפעילים, הסירו את המחט וסגרו את יציאת ההזרקה תוך פתיחת המנגנון מחדש למקור הארגון. משכו בעדינות את הנוזל מהאנטי-תא עד עמודת הסינתזה באמצעות מזרק הפסולת, כך שכל הנוזלים מוחזקים כעת במזרק הפסולת.כעת דחפו באיטיות את התמיסה בחזרה למעלה אל עמודת הסינתזה, תוך הבטחה שאין בועות גז בעמודה. כדי לערבב או להתסיס, משכו בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה מעל העמודה עם מזרק הפסולת. כדי להסיר מגיב או ממס מהעמודה, משכו באיטיות את התמיסה לתוך מזרק הפסולת.לאחר שעיקר התמיסה עברה למזרק הפסולת, משכו את ארגון דרך כדי לשטוף את הממס הנותר מהעמודה. לאחר מכן, הסר את סרט איטום השעווה סביב מפרק מזרק הפסולת. לאחר מכן להסיר את המזרק ולהשליך את פתרון הפסולת.לאחר מכן, החליפו את מזרק הפסולת במזרק יבש חדש ואטמו מחדש את המפרק. לאחר הרכבת מנגנון הטריפוספורילציה, התחל את תגובת הטריפוספוריה על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של פירידין דיוקסן לאנטי-תא כפי שהוכח בעבר. אבל אל תמשוך דגימה לעמודת סינתזה עדיין.לאחר המסת SalPCl בדיאוקסן כמתואר בכתב היד, הוסיפו אותו לתא האנטי והועמסו על עמודת הסינתזה באמצעות מזרק יבש. לאחר מכן תן לו להגיב במשך 15 דקות ולאחר מכן הסר והשלך את פתרון SalPCl באמצעות מזרק פסולת כפי שהודגם בעבר. מיד לאחר הסרת תמיסת ה-SalPCl, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של תמיסת TBAP לאנטי-תא והועמסו על עמודת הסינתזה.תן לו להגיב 20 דקות עם תסיסה ולהשליך כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, שטף את העמוד עם 0.5 מיליליטרים של N, N-דימתילפורמיד, ואז 0.5 מיליליטרים של אצטוניטריל, והסיר את הממס לאחר כל תוספת. לאחר הוספת תמיסת מחמצן, הסרתו ושטיפת העמוד עם אצטוניטריל שוב באמצעות אותו הליך שהוצג, מפרקים את המנגנון ושוטפים את העמוד בחמישה מיליליטרים של אצטוניטריל.לאחר מכן, יבשו את העמודה. נקה את האוליגונוקלאוטיד הטריפוספורי מתוך התמיכה המוצקה וההגנה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, מומסים את האוליגונוקלאוטיד המיובש המוגן במאגר העמסת אוריאה, מחוממים ל-80 מעלות צלזיוס, ואז מעמיסים על ג'ל פוליאקרילאמיד ומריצים במשך שעה עד שעתיים ב-25 עד 35 וואט.בסוף האלקטרופורזה של הג'ל, לאחר הסרת צלחת הג'ל, מפרקים אותה ועוטפים את הג'ל בסרט פוליוויניל כלוריד. לאחר מכן, זהה את רצועות המוצר על ידי הצללה אחורית עם אור UV של 254 ננומטר והוציא את רצועת המוצרים העיקרית באמצעות סכין גילוח. מרסקים את הג'ל הכריתה על ידי הוצאתו דרך מזרק פלסטיק או מכני.עבור אוליגונוקלאוטידים קצרים מ -15 נוקלאוטידים, יש לגדל פי שלושה את נפח הג'ל של מים נטולי נוקלאז למשך 12 שעות לפחות עם תסיסה או רעד. לאחר מכן הסר חתיכות ג'ל מוצקות על ידי העברת התמיסה דרך מזרק המצויד במסנן 0.2 מיקרומטר והתרכז על ידי ליופיליזציה. לאחר הריכוז, הסירו את שאריות המלחים וההצדעה באמצעות עמוד הרחקה בגודל חד פעמי והתרכזו בליופיליזציה כפי שהוכח קודם לכן.לאחר הכנת 10 מיקרוליטרים של תמיסת RNA המכילה תבנית פריימר פולימראז ריבוזים ו-L-RNA וטריפוספט טרינוקלאוטידים כפי שמתואר בכתב היד, חישולו על ידי חימוםו ל-90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת וקירורו ל-23 מעלות צלזיוס ב-0.2 מעלות צלזיוס לשנייה בתרמוציפלר PCR. לאחר דגירה של תמיסת הרנ"א ב-17 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של ריכוז כפול של מאגר הזינוק ככל שהתגובה מתקדמת, קחו 10 אליקוטים של מיקרוליטר ומרווים עם חמישה מיקרוליטרים של 0.5 EDTA טוחנים ב-pH 8 ועבדו כל דגימה כדי לבודד RNA כמתואר בכתב היד. ממיסים את הרנ"א המחודד ב-10 מיקרוליטרים של מאגר טעינת ג'ל פורמלי ומכינים פריימר מסומן קצה שלא תוקן כמתואר בטקסט.לאחר הכנת הדגימות, מחממים ל-80 מעלות צלזיוס. טען חמישה מיקרוליטרים של הדגימה בכל באר והפעל את הג'ל ב-40 וואט במשך כ-40 דקות. לאחר הסרת צלחת הג'ל מהמעמד, יש לסרוק באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי או זרחני כדי לדמיין תוצרי הרחבה של L-RNA חוצי כיראליים.לאחר טיהור ג'ל, הצללה אחורית של UV חושפת את נוכחותם של 5'triphosphate כמוצר עיקרי יחיד כפי שמוצג עבור גוזם DNA AAA ו- CCC וטרימר GAA L-RNA. מוצר הצד של 5'hydroxyl נראה לעתים קרובות כפס נודד איטי יותר, אשר בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה עבור גוזמי DNA. רצועות נוספות במהלך טיהור ג'ל מתואמות עם תוצרי צד של 5'דיפוספט, מונופוספט ו-H-פוספונט בספקטרומטריית מסה של תוצרי התגובה הלא-מפורזים.מוצרי 5'triphosphate מראים שיא מסה ראשוני המתאים ל-5'triphosphate יחד עם מסות 5'di ומונופוספט. טרינוקלאוטידים הקשורים לטריפוספטים הקשורים לטריפוספטים כימיים שימשו עם פריימר L-RNA ותבנית L-RNA בתגובת פילמור RNA שנותחה על ידי PAGE וצולמה באמצעות סורק ג'ל פלואורסצנטי. המכפלה המורחבת המסומנת על ידי עיגולים שחורים הדגימה את הסינתזה של גרסת L-RNA של ריבוזים של ראש הפטיש המקודדת על ידי התבנית.חשיפה למים במהלך טריפוספורילציה תפחית את היבול. בצע את השלבים להכנת ריאגנטים יבשים ולהרכבת מנגנון התגובה בזהירות. הזז נוזלים דרך המנגנון באיטיות כדי למנוע שבר באטמים.טריפוספורילציה כימית חיונית להכנת טריפוספטים אוליגונוקלאוטידים לא ביולוגיים, כולל רנ"א שמאלי. זה איפשר סינתזה של ריבוזים חוצי כיראליים של גרסאות תמונת המראה של מולקולות RNA שנמצאו בביולוגיה.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

מכשירי Millifluidic מנוצלים לסינתזה מבוקרת של ננו, ניתוח של מנגנוני תגובה וזרימת קטליזה המתמשכת זמן נפתר.

Millifluidics לסינתזה כימית וזמן נפתר מכניסטית לימודים

למדו שיטה כימית לטריפוספורילציה של אוליגונוקלאוטידים בקצה 5' באמצעות salicyl phosphorochloridite ופירופוספט. הפרוטוקול מאפשר סינתזה של אוליגונוקלאוטידים מופוספורים כולל L-RNA לא טבעי ליישומים בביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

גלה סרטונים נוספים