Name: תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד את פרוטוקול התרבות וההכפלה של נמטודות אנטומופתוגניות Heterorhabditis bacteriophora ו-Steinernema carpocapsae באמצעות זחלי Galleria mellonella. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של פתוגניות הנמטודות וחסינות המארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון על הקריאה הביקורתית בכתב היד. כל הדמויות הגרפיות נעשו באמצעות BioRender. מחקר ב- I. E., J. H., ו- D. O'H. מעבדות נתמכו על ידי אוניברסיטת ג'ורג ' וושינגטון והמכללה הקולומביאנית לאמנויות ומדעים המסייעים לקרנות וקרנות מחקר בין-תחומיות.

<ol><li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).</li>
<li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode+infection+and+antinematode+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila.</a> Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).</li>
<li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li>
<li>Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+nematode+infection%3A+Virulence+and+immunomodulatory+molecules+from+nematode+parasites+of+mammals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 2983(2020).</li>
<li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immune+responses+to+nematode+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li>
<li>Eleftherianos, I., Heryanto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+insights+into+the+insect+immune+response+to+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection.</a> Genes. 12 (2), 202(2021).</li>
<li>Ciche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+genome+of+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora.</a> WormBook. , 1-9 (2007).</li>
<li>Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partners+in+crime%3A+symbiont-assisted+resource+acquisition+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), (2021).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).</li>
<li>Abd-Elgawad, M. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+spp.%3A+An+overview+of+the+beneficial+aspects+of+mutualistic+bacteria+of+insecticidal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes.</a> Plants. 10 (8), 1660(2021).</li>
<li>Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Xenorhabdus%2C+a+novel+source+of+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3177(2018).</li>
<li>Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematodes%2C+bacteria%2C+and+flies%3A+a+tripartite+model+for+nematode+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism.</a> Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).</li>
<li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+infecting+Drosophila+adult+flies+with+insect+pathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes.</a> Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).</li>
<li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+gene+transcription+in+Drosophila+adult+flies+infected+by+entomopathogenic+nematodes+and+their+mutualistic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).</li>
<li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus%2FPhotorhabdus+occupy+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).</li>
<li>Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+and+a+host+of+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus and a host of hosts.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).</li>
<li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+interactions+between+Drosophila+and+the+pathogen+Xenorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus.</a> Microbiological Research. 240, 126568(2020).</li>
<li>Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+generating+axenic+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes.</a> BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+entomopathogenic+nematode%2C+Steinernema+carpocapsae%2C+reared+on+mutant+and+wild-type+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila.</a> Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).</li>
<li>McMullen, J. G., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52096(2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הבנת הבסיס המולקולרי של זיהום נמטודות אנטומופתוגניות וחסינות חרקים נגד נמטודה דורשת הפרדת הטפילים מהחיידקים הקשורים הדדית 13,15,16. הנמטודות האנטומופתוגניות H. bacteriophora ו- S. carpocapsae חיות יחד עם החיידקים הגראם-שליליים P. luminescens ו- X. nematophila, בהתאמה17. שני מיני החיידקים הוכחו בעבר כמקודדים גורמים המעניקים פתוגניות על ידי התמקדות ברקמות חרקים ונטרול מער...

המחקר על נמטודות אנטומופתוגניות (EPN) התעצם בשנים האחרונות בעיקר בשל התועלת של טפילים אלה באסטרטגיות משולבות של הדברה ומעורבותם במחקר ביו-רפואי בסיסי 1,2. מחקרים אחרונים ביססו את EPN כאורגניזמי מודל שבהם ניתן לבחון את המרכיבים הגנטיים של הנמטודה המופעלים בשלבים השונים של תהליך ההדבקה. מידע זה מספק רמזים קריטיים על טבען ומספר המולקולות המופרשות על ידי הטפילים כדי לשנות את הפיזיולוגיה של המארח ולערער את התגובה החיסונית המולדת של החרק 3,4. במקביל, ידע זה מתווספים בדרך כלל על ידי פרטים חדשים על סוג מסלולי האיתות החיסוניים של מארח החרקים ועל הפונקציות שהם מווסתים כדי להגביל את הכניסה וההתפשטות של הפתוגנים 5,6. הבנת התהליכים האלה חיונית כדי לדמיין את שני הצדדים של יחסי הגומלין הדינמיים בין EPN לבין מארחי החרקים שלהם. הערכה טובה יותר של הקשר בין EPN לחרקים מארחים תאפשר ללא ספק מחקרים דומים עם נמטודות טפיליות של יונקים, מה שעלול להוביל לזיהוי ואפיון של גורמי זיהום המפריעים למערכת החיסון האנושית.
נמטודות ה-EPN Heterorhabditis sp. ו-Steinernema sp. יכולות להדביק מגוון רחב של חרקים, והביולוגיה שלהם נחקרה באינטנסיביות בעבר. שני טפילי הנמטודה נבדלים זה מזה באופן הרבייה שלהם כאשר ההטרורהבדיטיס מופרה בעצמה ושטיינרנמה עוברת רבייה אמפימיקטית, אם כי לאחרונה הודגם כי S. hermaphroditum מתרבה על ידי הפריה עצמית של הרמפרודיטים או באמצעות פרתנוגנזה 7,8,9. הבדל נוסף בין הנמטודות ההטרורהבדיטיס לשטיינרנמה הוא ההדדיות הסימביוטית שלהם עם שני סוגים נפרדים של חיידקים גראם שליליים, פוטורהבדוס וקסנורהבדוס, בהתאמה, ששניהם פתוגנים חזקים של חרקים. חיידקים אלה נמצאים בשלב הצעירים הנגועים (IJ) של ה-EPN, אשר מזהים פונדקאים רגישים, מקבלים גישה להמוקול החרקים, שם הם משחררים את החיידקים הקשורים אליהם שמשתכפלים במהירות, ומיישבים רקמות חרקים. גם ה-EPN וגם החיידקים שלהם מייצרים גורמי אלימות שמפרקים את הגנות החרקים מנשקם ופוגעים בהומאוסטזיס. לאחר מות החרקים, הנמטודות IJs מתפתחות כדי להפוך ל-EPN בוגר ולהשלים את מחזור החיים שלהן. קבוצה חדשה של IJs שנוצרה בתגובה לחסך מזון וצפיפות יתר בתוך ציד החרקים סוף סוף מגיחה באדמה כדי לצוד פונדקאים מתאימים 9,10,11,12.
כאן מתואר פרוטוקול יעיל לשמירה, הגברה ומניפולציה גנטית של נמטודות EPN. בפרט, הפרוטוקול מתאר את השכפול של ה- H. bacteriophora ו- S. carpocapsae IJs הסימביוטיים, את הדור של נמטודה אקסנית IJs, את הייצור של H. bacteriophora hermaphrodites עבור microinjection, הכנת dsRNA, ואת טכניקת microinjection. שיטות אלה חיוניות להבנת הבסיס המולקולרי של פתוגניות נמטודה וחסינות מארחת נגד נמטודה.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97062-244</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Ambion Megascript T7 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>611770250</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>ChoiceTaq Mastermix</td> שמן תירס <td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>C775Y42</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>470200-112</td><td></td></tr><tr><td>סירופ תירס</td><td>MP ביומדיקלס / VWR</td><td>צינור</td> תרבית IC10141301 <td></td></tr><tr><td>10 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-14</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף פמטוטיפים טיפים מיקרו-מעמיס</td><td>אפנדורף</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>פלקון שפופרת 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>VWR</td><td>28320-100</td><td></td></tr><tr><td>Galleria mellonella waxorms</td><td>Petco-Glass</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>coverslip</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-553-464</td><td>50 x 24 מ"מ</td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>לולאת חיסון</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR</td><td>97062-956</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Fil נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-3</td><td>1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1425-500</td><td>LB אבקת טוחן אגר 500 גרם</td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1426-500</td><td>LB מרק מילר אבקת 500 גרם</td></tr><tr><td>Leica DM IRB מיקרוסקופ מחקר הפוך</td><td>מיקרוסקופ סנטרל-מקונקי</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>בינוני</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M7408-250G</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear ערכת ניקוי שעתוק</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>76332-064</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מחט</td><td>VWR</td><td>BD305155</td><td>22 גרם</td></tr><tr><td>מרק תזונתי</td><td>Millipore-Sigma</td><td>70122-100G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מחולקת</td><td>VWR</td><td>490005-212</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>97062-732</td><td>טבליות PBS מאגר ביוטק כיתה 200 כרטיסיות</td></tr><tr><td>PCR פריימרים</td><td>Azenta-Pestle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore-Sigma</td><td>BAF199230001</td><td>Bel-Art צלחת פטרי חד פעמית</td></tr><tr>6<td>ס"מ</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 10 מ"מ</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>35 x 10 מ"מ</td></tr><tr><td>פרוטאוז פפטון #3</td><td>תרמו פישר 211693</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שמרים תמצית</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

נמטודות אנטומופתוגניות בסוגים Heterorhabditis ו - Steinernema הם טפילים מחייבים של חרקים שחיים באדמה. המאפיין העיקרי של מחזור החיים שלהם הוא הקשר ההדדי עם החיידקים Photorhabdus ו Xenorhabdus, בהתאמה. טפילי הנמטודה מסוגלים לאתר ולהיכנס לפונדקאים מתאימים של חרקים, לחתור תחת התגובה החיסונית של החרקים ולהתרבות ביעילות כדי לייצר את הדור הבא שיצוד באופן פעיל טרף חרקים חדש להדבקה. בשל התכונות של מחזור החיים שלהם, נמטודות אנטומופתוגניות הן סוכני הדברה ביולוגית פופולריים, המשמשים בשילוב עם קוטלי חרקים להדברת מזיקים חקלאיים הרסניים. במקביל, נמטודות טפיליות אלה מייצגות כלי מחקר לניתוח פתוגניות של נמטודות ותגובות אנטי-נמטודיות מארחות. מחקר זה נעזר בפיתוח לאחרונה של טכניקות גנטיות וגישות תעתיק להבנת תפקידן של מולקולות מופרשות נמטודה במהלך זיהום. כאן, פרוטוקול מפורט על שמירה על נמטודות אנטומופתוגניות ושימוש בהליך פירוק גנים מסופק. מתודולוגיות אלה מקדמות עוד יותר את האפיון הפונקציונלי של גורמי זיהום נמטודות אנטומופתוגניים.

כדי להעריך את מצבם של נמטודות H. bacteriophora שעברו את האקסניזציה, נקבעה נוכחותן או היעדרן של מושבות חיידקים מסוג P. luminescens ב- IJs. לשם כך נאסף כדור של כ-500 התקנים תוך-גזעיים שעברו קודם לכן עיקור והומוגני ב-PBS. טיפול הבקרה החיובית כלל כדור של כ-500 IJs מתרבית הנמטודה שהכיל חיידקים סימביוטיים מסוג P. luminescens . הכדורים של נמטודות בקרה אקסניזציה וחיוביות היו הומוגניים ב-1x PBS. ההומוגנאטים הודבקו על אגר והתפשטו כדי להקל על צמיחתן של מושבות בודדות. לוחות האגר דוגרו בטמפרטורה של 28 מעלות...

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

פרוטוקול יעיל לשמירה והגברה של נמטודה אנטומופתוגנית חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של פתוגניות נמטודה וחסינות נגד נמטודה מארחת. פרוטוקול זה מאפשר לנו לייצר מספר גבוה של בקטריופורה סימביוטית ואקסנית של הטרורהבדיטיס בקטריופורה ושטיינרנמה קרפוקפסה IJsae באמצעות מארח חרקים, גלריה מלונלה. התחילו בכיסוי צלחת הפטרי בפיסת נייר פילטר והוסיפו כ-10 עד 15 זחלי גלריה מלונלה.באמצעות פיפטה, מחלקים שני מיליליטרים של מים המכילים כ-25 עד 50 צעירים מזהמים לכל 10 מיקרוליטרים של תרחיף על תולעי השעווה. ואחסנו את צלחת הפטרי בארון בטמפרטורת החדר. בהתאם ללחות של נייר המסנן, להוסיף אחד עד שני מיליליטרים של מים כל יומיים.תולעי שעווה הנגועות בצעירים מדביקים מתות בדרך כלל תוך 48 שעות. הכינו את מלכודות המים של ווייט כ-10 ימים לאחר שתולעי השעווה נגועות בצעירים המזהמים. העבירו בזהירות את החרקים המתים אל החלק הלא מלוטש של נייר הסינון.השתמשו במי ברז כדי למלא את צלחת הפטרי התחתונה והניחו מכסה של צינור 15 מיליליטר כמרווח לאוורור. השתמשו במי ברז במקום במים שעברו דה-מינרליזציה או שעברו דה-יוניזציה כדי להימנע מצבירת נמטודות, וודאו שמפלס המים במלכודת המים מגיע לכמחצית מגובהה של צלחת הפטרי. כאשר המים בצלחת הפטרי הקטנה הופכים מעוננים עקב נמטודות, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדור החדש של צעירים מדביקים לתוך בקבוקון T25 או T75 של תרבית תאים.בהמשך, הוסיפו מי ברז לנפח של עד 40% או עד שתגיעו לצפיפות המתאימה. ואחסנו את בקבוק תרבית התאים בצורה אופקית כדי למנוע גודש נמטודות. העברה חוזרת ונשנית של צעירים מדביקים לתוך צלוחיות תרבית תאים ותוספת מים עד שהצעירים הדביקים מפסיקים להגיח מפגרי החרקים תוך כשלושה עד חמישה ימים.באמצעות לולאת חיסון, שפשפו כמה פתיתים של תרבית קפואה של Photorhabdus temperata Ret16 על צלחת מקונקי ויצרו פסים למושבות בודדות. הדגירה של הצלחת למשך יומיים-שלושה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לחסן 10 מיליליטרים של ציר LB עם מושבה על אגר מקונקי בצינור 50 מיליליטר ולדגום את התרבית לילה ב 28 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד.לאחר הדגירה, מעבירים 100 מיקרוליטרים של תרבית לילה מצינור 50 מיליליטר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, ואז שוטפים 100 את תרבית הלילה עם 900 מיקרוליטרים של PBS בעוצמה יחידה על ידי צנטריפוזיה, בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ב-17, 900 פעמים גרם. דקאנט הסופרנאטנט. לאחר מכן, לדלל את התרבות 10 פעמים בעוצמה אחת PBS ולהשאיר את הצינור על הקרח.כעת, לטבול את תולעי השעווה לתוך תמיסת אתנול של 70%. לאחר ייבוש החרקים עם מגבת נייר, מניחים אותם בצינור 50 מיליליטר. הניחו את הצינור על הקרח למשך 20 דקות כדי לשתק את תולעי השעווה.השתמשו בנייר פילטר כדי לכסות את החצאים העליונים והתחתונים של צלחת פטרי. השתמשו במכסה צלחת פטרי המכוסה בנייר סינון כתמיכה בסיסית להזרקה. לחים בנייר הסינון של צלחת הפטרי התחתונה ולהעביר אותה על קרח כדי לעזור לתולעי השעווה המוזרקות להתאושש.פיפטה 50 מיקרוליטרים של חיידקים קרים כקרח על חתיכת Parafilm ואז מכינים מזרק מחט זיקוק של 22 מדים ולוחצים על הבוכנה בעדינות כדי להסיר את האוויר בקצה המחט. שמירה על תולעת שעווה קרוב לקצה האחורי מתחת לסטריאוסקופ. הזריקו תרבית חיידקים לצד הגבי של בית החזה.רצוי בצומת בין שני מקטעים ממש מתחת לציפורן במקביל לתולעת השעווה כדי למזער את הנזק הפנימי ולשים לב לאופן שבו גוף הזחל מתחיל לבלוט. לאחר מכן, העבירו את החרקים המוזרקים לצלחת פטרי ההתאוששות. וברגע שכל החרקים מוזרקים ומונחים בצלחת ההתאוששות, מניחים את צלחת הפטרי בחושך.תולעי שעווה נכנעות יומיים לאחר ההזרקה ונראות אדומות לבנים לאחר כשלושה עד ארבעה ימים. עם זאת, חרקים בצבע חום מצביעים על זיהום חיידקי לא מוצלח. לאחר שבעה ימים לאחר ההדבקה, מעבירים את החרקים עם הצבע האדום-לבנים האופייני על צלחת פטרי מרופדת בנייר מסנן טרי, וחוזרים על ייצור של נמטודה סימביוטית מדביקה צעירים.כדי להתחיל עיקור פני השטח, לאסוף מספיק סימביוטי, Heterorhabditis bacteriophora ומועמד אקסני זיהומים צעירים על ידי צנטריפוגה. כדי להכין גלולה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 5% אקונומיקה לכדורית בכל צינור מיקרוצנטריפוגה והפכו את הצינור. לאחר דגירה במשך 10 דקות, צנטריפוגה ב 17, 900 פעמים g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.לאחר מכן לשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של מים סטריליים. צנטריפוגה זה, להסיר את supernatant ולחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות. הגרף מראה את תוצאות הערכת מצבם של נמטודות הטרוהבדיטיס בקטריופורה שעברו אקסניזציה.הטרורהבדיטיס בקטריופורה מתרבית הסטוק נשאה תאי פוטורהבדוס זוהרים סימביוטיים. עם זאת, נמטודות נטולות חיידקי ה-Photorhabdus luminescens הקשורים אליהן היו אקסניות. כדי לשמור על יכולת השכפול של הניסוי שלכם, תמיד פזרו טרי מתרבית מלאי חיידקים ממושבה טרייה והוציאו את תרבית הלילה לפני שהיא מגיעה לפנים נייחות.השתמשו רק בתולעת השעווה האדומה של גלריה למלכודת המים של ווייט והשליכו את השאר. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בנמטודות כדי לחקור את האינטראקציה עם מערכת החיסון של חרקים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר לחקור את הבסיס המולקולרי של טפילות נמטודה וחסינות מארחת נגד נמטודה.

culturing-and-genetically-manipulating-entomopathogenic-nematodes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים...

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

השפעות טרנס ומרובות הדורות של כימיקלים מתמידים הם חיוניים לשפוט את ההשלכות לטווח הארוך שלהם בסביבה ועל בריאות האדם. אנו מספקים שיטות מפורטות הרומן ללמוד טרנס ואפקטים רב הדורי באמצעות בעלי חיים בחינם ה, האלקאנס.

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

אנו מציגים שתי שיטות לחקלאים להתרבות המונית של נמטודות אנטומופתוגניות כקוטלי חרקים ביולוגיים. השיטה הראשונה משתמשת בג'ל פוליאקרילאמיד כמצע גידול הנמטודות, בעוד שהשנייה משתמשת בצמר גפן מצופה פולימר כמצע הגידול. שתי השיטות מתבססות על התרבות נמטודות בתוך גופות חרקים.

רבייה מבוססת גידול בחיים של נמטודות אנטומופתוגניות

למד את פרוטוקול התרבות וההכפלה של נמטודות אנטומופתוגניות Heterorhabditis bacteriophora ו-Steinernema carpocapsae באמצעות זחלי Galleria mellonella. שיטה זו מאפשרת מחקר מולקולרי של פתוגניות הנמטודות וחסינות המארח.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

גלה סרטונים נוספים