תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

פרוטוקול יעיל לשמירה והגברה של נמטודה אנטומופתוגנית חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של פתוגניות נמטודה וחסינות נגד נמטודה מארחת. פרוטוקול זה מאפשר לנו לייצר מספר גבוה של בקטריופורה סימביוטית ואקסנית של הטרורהבדיטיס בקטריופורה ושטיינרנמה קרפוקפסה IJsae באמצעות מארח חרקים, גלריה מלונלה. התחילו בכיסוי צלחת הפטרי בפיסת נייר פילטר והוסיפו כ-10 עד 15 זחלי גלריה מלונלה.

באמצעות פיפטה, מחלקים שני מיליליטרים של מים המכילים כ-25 עד 50 צעירים מזהמים לכל 10 מיקרוליטרים של תרחיף על תולעי השעווה. ואחסנו את צלחת הפטרי בארון בטמפרטורת החדר. בהתאם ללחות של נייר המסנן, להוסיף אחד עד שני מיליליטרים של מים כל יומיים.

תולעי שעווה הנגועות בצעירים מדביקים מתות בדרך כלל תוך 48 שעות. הכינו את מלכודות המים של ווייט כ-10 ימים לאחר שתולעי השעווה נגועות בצעירים המזהמים. העבירו בזהירות את החרקים המתים אל החלק הלא מלוטש של נייר הסינון.

השתמשו במי ברז כדי למלא את צלחת הפטרי התחתונה והניחו מכסה של צינור 15 מיליליטר כמרווח לאוורור. השתמשו במי ברז במקום במים שעברו דה-מינרליזציה או שעברו דה-יוניזציה כדי להימנע מצבירת נמטודות, וודאו שמפלס המים במלכודת המים מגיע לכמחצית מגובהה של צלחת הפטרי. כאשר המים בצלחת הפטרי הקטנה הופכים מעוננים עקב נמטודות, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את הדור החדש של צעירים מדביקים לתוך בקבוקון T25 או T75 של תרבית תאים.

בהמשך, הוסיפו מי ברז לנפח של עד 40% או עד שתגיעו לצפיפות המתאימה. ואחסנו את בקבוק תרבית התאים בצורה אופקית כדי למנוע גודש נמטודות. העברה חוזרת ונשנית של צעירים מדביקים לתוך צלוחיות תרבית תאים ותוספת מים עד שהצעירים הדביקים מפסיקים להגיח מפגרי החרקים תוך כשלושה עד חמישה ימים.

באמצעות לולאת חיסון, שפשפו כמה פתיתים של תרבית קפואה של Photorhabdus temperata Ret16 על צלחת מקונקי ויצרו פסים למושבות בודדות. הדגירה של הצלחת למשך יומיים-שלושה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לחסן 10 מיליליטרים של ציר LB עם מושבה על אגר מקונקי בצינור 50 מיליליטר ולדגום את התרבית לילה ב 28 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד.

לאחר הדגירה, מעבירים 100 מיקרוליטרים של תרבית לילה מצינור 50 מיליליטר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, ואז שוטפים 100 את תרבית הלילה עם 900 מיקרוליטרים של PBS בעוצמה יחידה על ידי צנטריפוזיה, בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ב-17, 900 פעמים גרם. דקאנט הסופרנאטנט. לאחר מכן, לדלל את התרבות 10 פעמים בעוצמה אחת PBS ולהשאיר את הצינור על הקרח.

כעת, לטבול את תולעי השעווה לתוך תמיסת אתנול של 70%. לאחר ייבוש החרקים עם מגבת נייר, מניחים אותם בצינור 50 מיליליטר. הניחו את הצינור על הקרח למשך 20 דקות כדי לשתק את תולעי השעווה.

השתמשו בנייר פילטר כדי לכסות את החצאים העליונים והתחתונים של צלחת פטרי. השתמשו במכסה צלחת פטרי המכוסה בנייר סינון כתמיכה בסיסית להזרקה. לחים בנייר הסינון של צלחת הפטרי התחתונה ולהעביר אותה על קרח כדי לעזור לתולעי השעווה המוזרקות להתאושש.

פיפטה 50 מיקרוליטרים של חיידקים קרים כקרח על חתיכת Parafilm ואז מכינים מזרק מחט זיקוק של 22 מדים ולוחצים על הבוכנה בעדינות כדי להסיר את האוויר בקצה המחט. שמירה על תולעת שעווה קרוב לקצה האחורי מתחת לסטריאוסקופ. הזריקו תרבית חיידקים לצד הגבי של בית החזה.

רצוי בצומת בין שני מקטעים ממש מתחת לציפורן במקביל לתולעת השעווה כדי למזער את הנזק הפנימי ולשים לב לאופן שבו גוף הזחל מתחיל לבלוט. לאחר מכן, העבירו את החרקים המוזרקים לצלחת פטרי ההתאוששות. וברגע שכל החרקים מוזרקים ומונחים בצלחת ההתאוששות, מניחים את צלחת הפטרי בחושך.

תולעי שעווה נכנעות יומיים לאחר ההזרקה ונראות אדומות לבנים לאחר כשלושה עד ארבעה ימים. עם זאת, חרקים בצבע חום מצביעים על זיהום חיידקי לא מוצלח. לאחר שבעה ימים לאחר ההדבקה, מעבירים את החרקים עם הצבע האדום-לבנים האופייני על צלחת פטרי מרופדת בנייר מסנן טרי, וחוזרים על ייצור של נמטודה סימביוטית מדביקה צעירים.

כדי להתחיל עיקור פני השטח, לאסוף מספיק סימביוטי, Heterorhabditis bacteriophora ומועמד אקסני זיהומים צעירים על ידי צנטריפוגה. כדי להכין גלולה בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של 5% אקונומיקה לכדורית בכל צינור מיקרוצנטריפוגה והפכו את הצינור. לאחר דגירה במשך 10 דקות, צנטריפוגה ב 17, 900 פעמים g במשך דקה אחת ולהסיר את supernatant.

לאחר מכן לשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של מים סטריליים. צנטריפוגה זה, להסיר את supernatant ולחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות. הגרף מראה את תוצאות הערכת מצבם של נמטודות הטרוהבדיטיס בקטריופורה שעברו אקסניזציה.

הטרורהבדיטיס בקטריופורה מתרבית הסטוק נשאה תאי פוטורהבדוס זוהרים סימביוטיים. עם זאת, נמטודות נטולות חיידקי ה-Photorhabdus luminescens הקשורים אליהן היו אקסניות. כדי לשמור על יכולת השכפול של הניסוי שלכם, תמיד פזרו טרי מתרבית מלאי חיידקים ממושבה טרייה והוציאו את תרבית הלילה לפני שהיא מגיעה לפנים נייחות.

השתמשו רק בתולעת השעווה האדומה של גלריה למלכודת המים של ווייט והשליכו את השאר. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בנמטודות כדי לחקור את האינטראקציה עם מערכת החיסון של חרקים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר לחקור את הבסיס המולקולרי של טפילות נמטודה וחסינות מארחת נגד נמטודה.