שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

אנו משלבים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מיקרופלואידיקה כדי לחקור כיצד חלבונים קושרי אקטין מווסתים את ההרכבה, ואת הפירוק, של חוטי אקטין. באמצעות מיקרופלואידיקה, אנו מסוגלים לכמת תגובות המתרחשות על עשרות חוטי אקטין בודדים בו זמנית, תוך שליטה מדויקת בתנאים ביוכימיים ומכניים. זכור כי תמיסות מוזרקות תחילה במקביל עד שהן מגיעות לתא, ולאחר מכן, חוטים נחשפים ברצף לכל תמיסה על ידי שינוי הגדרת הלחץ.

כדי להתחיל את ההכנה של polydimethylsiloxane, או PDMS, הרכבה תא, לחמם מראש את הצלחת החמה ל 100 מעלות צלזיוס. חשפו תא PDMS אחד שנוקה וכיסוי זכוכית אחד מחליק בצלחת פטרי נקייה לאור אולטרה סגול למשך שלוש עד חמש דקות בחומר ניקוי UV עמוק. בסיום, מקם את תא ה- PDMS מעל החלקת הכיסוי כך ששני המשטחים החשופים ישירות ל- UV יוכנסו במגע.

כדי להסיר בועות אוויר הלכודות בממשק החלקת הכיסוי של PDMS, לחץ בעדינות על פני השטח של התא באצבע. לחצו חזק על פינות וצדדים, וודאו שתקרת החדר לא תבוא במגע עם משטח הזכוכית. הניחו את החדר עם תחתית הזכוכית הפונה לצלחת החמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן השתמשו בתא באופן מיידי, או אחסנו אותו בצלחת פטרי נקייה למשך שבוע. כדי לשטוף את צינורות הכניסה והיציאה, מלאו צינור מאגר אחד של 2 מיליליטר ב-300 מיקרוליטרים של חיץ F, הברגו אותו על מחזיק המיקרופלואידים והגדירו את הלחץ ל-300 מיליברס. תן חמש עד שמונה טיפות של F-buffer ללכת לבזבוז, ולאחר מכן להגדיר את הלחץ לאפס ולחזור על ההליך עבור כל ערוץ.

לאחר מכן, הגדר את הלחץ ליציאה בצינור המאגר ארבעה עד 50 מיליברס, ברגע שיוצאת טיפה מקצה הצינורות, חבר את הצינורות לשקע של תא PDMS. כאשר הנוזל ממלא את התא ויוצא מכל הכניסות, הגדר את לחץ היציאה ל -20 מיליברס. מאוחר יותר, הגדר את הלחץ עבור צינור המאגר ל 1 עד 50 millibars.

כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר, ודאו שהטיפה יוצאת מהצינורות ומכניסת ה-PDMS לפני שאתם מחברים את הצינורות לכניסה. הגדר את הלחץ של המפרצון ל 30 millibars. לאחר חיבור המפרצים שניים ושלושה כפי שהודגם, הורידו את הלחץ של כל הכניסות ל-20 מיליברס, ואת לחץ היציאה לאפס מיליברים.

ודא שקצבי הזרימה בכניסות שווים בערך. בעת שינוי המאגר, הגדר את כל לחצי הכניסה ל -12 מיליברס ולחץ היציאה ל -5 מיליברס. כדי להזריק במהירות תמיסה, הגדר את הלחץ של הכניסה המתאימה ל-150 מיליברס, והתאם את הלחץ בכניסות האחרות לכ-100 מיליברס, כך שקצב הזרימה המתקבל בכניסות הוא 500 ננוליטרים לדקה.

כדי לשנות את הפתרון, מלאו 200 עד 300 מיקרוליטרים של התמיסה בצינור מאגר חדש והגדירו את הלחץ להגדרת השינוי. לאחר מכן, פתח את צינור המאגר של המפרצון. לאחר שנוצרה טיפה קטנה בקצה הצינור, הברג את הצינור החדש עם הפתרון הטרי, שנה את הגדרת הלחץ לזרימה גבוהה.

בהתאם לתצורה המיקרופלואידית ולגיאומטריה של התא, המתן שלוש עד חמש דקות עד שהתמיסה תמלא את הצינורות ותגיע לתא. ניתן לעקוב אחר התהליך על ידי מדידת העלייה בפלואורסצנציה לאורך זמן. לצורך פונקציונליזציה של פני השטח, החליפו את התמיסה 3 עד 200 מיקרוליטרים של 50 זרעי ספקטרין-אקטין פיקומולריים ב-F-buffer, והזיקו את התמיסה למשך שתי דקות עם זרימה גבוהה שלוש.

עבור מעבר פני השטח, החלף צינור שלוש עם 300 מיקרוליטרים של 5% BSA ב- F-buffer, ולאחר מכן, הזריק במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש, ואחריו חמש דקות באמצע זרימה שלוש, עם לחץ מופחת של שבעה עד שמונה מיליברס בתעלות אחת ושתיים כדי לקבל זרימה נגדית של 100 ננוליטרים לדקה. כל משטח התא יהיה BSA passivated. החלף את הצינור שלוש ל- F-buffer כדי לשטוף את התעלה במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש.

מאוחר יותר, החליפו את הצינורות אחד לשלושה עם פרופילין אקטין מיקרומולרי אחד, אקטין מיקרומולרי 0.15 ומאגר F, בהתאמה, כפי שמוסבר בכתב היד, והזריקו תמיסות מוכנות טריות באמצעות הזרימה הגבוהה, כולן מוגדרות מראש במשך שלוש עד ארבע דקות. הפעילו את המיקרוסקופ והתאימו את זמן החשיפה של המצלמה ל-100 עד 200 אלפיות השנייה, לייזר עירור ל-10 עד 20% הספק, וסך הכל פלואורסצנציה פנימית של השתקפות פנימית, או עומק TIRF, ב-200 עד 300 ננומטר כדי לצלם את התמונות עם מטרה של פי 60. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הלחץ לאמצע זרימה אחת למשך 10 דקות כדי לרשום את פילמור החוטים בקצב של מסגרת אחת כל 20 שניות, ולאחר מכן את זרימת הביניים שתיים למשך 15 דקות להזדקנות נימה.

לכידת דה-פולימריזציה במצב אפיפלואורסצנציה בפריים אחד כל חמש שניות, לאחר פעימה אחת עד שתיים, עבור לזרימה האמצעית שלוש כדי לרשום נימים מתפרקים בסביבות 10 תת-יחידות בשנייה. כדי לאפס את הניסוי, שברו את כל החוטים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי חשיפה רציפה שלהם ללייזר בעוצמה מקסימלית למשך שתי דקות. בדקו תנאים שונים על ידי שינוי תמיסות אחת, שתיים או שלוש והזרקתן בזרימה גבוהה במשך שלוש עד ארבע דקות.

התוצאה של ניסוי הפילמור/דה-פולימריזציה הבסיסי מוצגת כאן. הקימוגרפים שהתקבלו שימשו לכימות שיעורי הפילמור והדה-פולימריזציה. כאשר חוטי האקטין הגדלים נחשפו לתמיסת קופילין המסומנת באופן פלואורסצנטי, צבירי הקופילין נוקו וצמחו לעבר הקצוות המחודדים והתוחמים.

כאשר חוטים בודדים נחשפים לקסין הם יוצרים צרורות שנראים בהירים יותר ולא מיושרים בצורה מושלמת עם הזרימה. חשוב מאוד להימנע מהכנסת בועות אוויר במערכת בעת החלפת צינורות ולשים לב לא לקבל צינורות מאגר ריקים. טכניקה זו הייתה קריטית להפעלת כוחות משיכה על פני עשרות חוטים בודדים, התבוננות ברגישות מכנית של פורמין וקופילין, והתפרקות ARP2/3.