כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

באמצעות המכשירים המיקרופלואידיים המוצגים, אנו יכולים לבחון אינטראקציות דינמיות בין פטריות למיקרובים אחרים באמצעות בקרה מרחבית וסביבתית מדויקת, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד. חשוב לציין, ניתן להגביל את הצמיחה הפטרייתית ולכוון אותה בתוך הערוץ המיקרופלואידי. מאפשרת קבלת תמונות באיכות גבוהה של חלוף זמן.

לכן, ניתן לחקור את המורכבות של אינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות ופטרייתיות-חיידקיות. הבנת אינטראקציות מיקרוביאליות פטרייתיות היא שלב חיוני בהגדרה ובשימור של המיקרוביום של הקרקע. ידע זה יכול להיות מנוצל לפיתוח של סוכני ביו-קונטרול חדשניים עם חקלאות בת קיימא.

כדי להתחיל, להכין כ -40 גרם של פולי (dimethylsiloxane) או PDMs, על ידי ערבוב יסודי של הבסיס ואת חומר הריפוי ביחס של 10 ל -1 באמצעות מרית בכוס פלסטיק נקייה. כדי להסיר את כל בועות האוויר, מניחים את הכוס בתא ואקום למשך שעה. לאחר מכן, באמצעות סרט שקוף, אבטח את התבנית הראשית לתוך תושבת פלסטיק והשתמש באוויר מסונן דחוס כדי להסיר את חלקיקי האבק, ואז שפך את ה- PDMs על מרכז התבנית הראשית ואפשר לה לשקוע.

כדי למנוע התיישבות של חלקיקי אבק על פני השטח של PDMs, מכסים באופן רופף את התבנית הראשית במכסה פלסטיק, ואז מעבירים את התבנית הראשית לתנור ומרפאים לילה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת תבנית המאסטר מהתנור ומתן אפשרות להתקרר, קלפו את ה-PDMs שנרפאו הרחק מהתבנית הראשית וממסגרת הפלסטיק מבלי לפגוע בתבנית הראשית ב-PDMs. לאחר מכן, כדי לשמור על משטח נטול אבק, הניחו סרט דביק שקוף על המיקרו-ערוצים המובלטים ב-PDMs.

לאחר מכן, השתמש בגיליוטינה רכובה או בסכין גילוח כדי לחתוך את ה- PDMs ללוחות כפי שצוין על ידי העיצוב. בעת חיתוך הפתח הצדדי של לוח ה- PDMs המשמש למכשיר האינטראקציה החיידקית-פטרייתית, או התקן ה- BFI, ודא שהמיקרו-ערוצים פתוחים במלואם. עם זאת, עבור לוחות PDMs המשמשים בהרכבה של התקן האינטראקציה הפטרייתית-פטרייתית, או FFI, יש לקצץ כל פינה כך שתתאים לצלחת פטרי תחתונה מזכוכית.

לאחר מכן, השתמש בחותך מדויק כדי לנקב חורי כניסה או שקע בהתאם לתכנון המכשיר. לאחר מכן, הטביע את לוחות ה- PDMs לתמיסת נתרן הידרוקסיד טוחנת 0.5. יש לשטוף את הלוחות במים סטרילים עם זיקוק כפול לפני העברתם לתמיסת אתנול של 70%.

לאחר הסרת האתנול ושטיפת הלוחות במים סטריליים מזוקקים כפולים שוב, טבלו את הלוחות במים מזוקקים כפולים סטריליים וסוניקטים במשך חמש דקות, ואז הסירו את לוח ה-PDMs מהמים, ייבשו אותם באוויר מסונן דחוס והניחו אותם בצלחת פטרי מרובעת סטרילית. לאחר מכן, דגירה של צלחת פטרי עם לוח PDMs בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר שהלוחות התקררו בסביבה נטולת אבק, נקו כל אבק מפני השטח שלהם באמצעות סרט הדבקה ואוויר מסונן דחוס.

כדי להפעיל את המשטחים של לוחות ה-PDMs ואת צלחות הפטרי התחתונות מזכוכית, אשר יחוברו לאחר מכן יחד, הניחו אותם במנקה פלזמה כאשר המשטחים יופעלו פונים כלפי מעלה. לאחר הסרת לוח ה-PDMs בצלחות הפטרי ממנקה הפלזמה, קשרו אותם בעדינות על ידי הצבת המשטחים המופעלים במגע קונפורמי זה עם זה. לוח BFI ו-FFI PDMs של בונד עם צלחות פטרי בקוטר 35 מילימטר ו-55 מילימטרים, בהתאמה לבדיקת ההדבקה המוצלחת, מנסים למשוך את מעבדת ה-PDMs מצלחת הפטרי שלה עם פינצטה.

דמיינו את המכשיר בקפידה עם העין או על ידי מיקרוסקופיה גנרית כדי להבטיח שאין קריסה של פתחי החיסון או המיקרו-ערוצים. עבור תנאים רוויי מים או עשירים בחומרים מזינים, פיפטה 100 מיקרוליטרים של הפתרון הרצוי כדי למלא התקני BFI מיד לאחר ההדבקה. עבור התקני FFI, הוסף 30 מיקרוליטרים של המדיה לכל כניסה.

לבסוף, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים סטריליים לצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. עם זאת, עבור מים בתנאים בלתי רוויים, פשוט הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים מזוקקים כפולים לצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. לחיסון פטרייתי, בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי, באמצעות בור שעם מעוקר, מוציאים תקע אגר ממושבה בשולי תרבות בת שלושה ימים, ומבטיחים לשמור על חזית ההיפל ההולכת וגדלה ללא פגע.

לאחר מכן הכנס את תקע האגר לתוך הכניסה הפטרייתית של מכשיר ה- BFI ו/ או ה- FFI כאשר צד התפטיר למטה בחזית ההיפל מכוון לכיוון פתחי המיקרו-ערוצים כדי לעודד חדירה היפל של הערוצים. עבור מכשיר ה- FFI, הכנס תקע אגר נוסף עם מין פטרייתי שני לתוך המפרצון הנגדי. לאחר מכן, אטמו את צלחת הפטרי עם סרט שקוף ודגרו בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך עד להדמיה.

עבור חיסון חיידקים, לאחר הסרת מכשיר ה- BFI מהאינקובטור, פיפטה 10 מיקרוליטרים של תרחיף חיידקי לתוך המפרצון החיידקי בסביבה סטרילית. ברגע שצלחת הפטרי נאטמת בסרט שקוף, אחסנו את המכשיר זקוף בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך עד לתחילת ההדמיה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לדמיין בהצלחה את האינטראקציה בין הפטרייה Coprinopsis cinerea לבין החיידק Bacillus subtilis.

נצפה כי בנוכחות החיידק, קצב הגדילה של הפטרייה החל לרדת באופן דרסטי לאחר כחמש שעות של קוינוקולציה. יתר על כן, ההיפרה הפטרייתית הקשורה לחיידקים הייתה בעלת מראה דק ושקוף. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר חשפו גם קריסת היפא פטרייתית לאחר חמש שעות של קוינוקולציה עם Bacillus subtilis.

עם זאת, משש שעות ואילך, גם אוכלוסיית החיידקים החלה לרדת. הדמיה של אינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות הראתה כי Fusarium graminearum עיכב מאוד את הצמיחה של Trichoderma rossicum, אשר ניכר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה חשף גם שינויים מורפולוגיים משמעותיים בפטרייה Verticillium longisporum בנוכחות החיידקים Pseudomonas synxantha ו- Pseudomonas fluorescens.

טכניקת ההדמיה הדינמית ברזולוציה גבוהה ששימשה במחקר גילתה גם היווצרות ספטה ב- Fusarium graminearum בנוכחות הפטרייה Clonostachys rosea. תיוג פלואורסצנטי העניק את הכימות הדינמי של התפשטות ההיפל Clonostachys rosea במכשיר ה-FFI. התקנים אלה יכולים להיות מותאמים ומשונים על ידי המשתמש כדי לשלב מינים שונים של עניין ולהתייחס לשאלות הניסוי הספציפיות שלהם הנוגעות לאינטראקציות מיקרוביאליות פטרייתיות.

הן מכשירי ה-BFI והן מכשירי ה-FFI דחפו גבולות מדעיים, וחשפו כיצד פטריות מפיצות אותות הגנה וחומרים מזינים עם התקפה על ידי פטריות, וירוסים, נמטודות ומאפשרות לחקור את פיזור החיידקים.