Name: מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד כיצד ליצור מודל ניסיוני לדלקת ריאות בעכברים לחקר פציעת ריאות חריפה ורזולוציה שלה. שיטה זו מאפשרת הערכת אסטרטגיות טיפוליות בתחומי האימונולוגיה והמחלות הזיהומיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק R01 של ה-NIH HL131812 ו-R01HL163881.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים המתוארים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בית הספר לרפואה עבור פרוטוקול בעלי חיים MO21M160. בנוסף, הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות המוסדיות, המדינתיות והפדרליות למחקר בבעלי חיים.
זהירות: השכפול של כל הפרוטוקולים המתוארים להלן דורש להתבצע בארון בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2), בהתאם לכל הנחיות BSL-2 המוסדיות תחת ארון הבטיחות הביולוגית.
1. ציפוי מלאי חיידקים מלולאות מסחריות
הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש לגידול מלאי חיידקים עבור Spn (ATCC 49619) ו - Kpn (ATCC 43816), החל מלולאות הכת המתקבלות מהספק (ראה טבלת חומרים לפרטים).
<ol><li>חממו צלחת אגר 5% דם כבשים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור. אינקובטור תאים יכול לשמש למטרה זו.</li>
	<li>מתחת למכסה המנוע, מוציאים את הנדן מלולאת החיסון החיידקית ומפזרים אותו בזהירות, תוך כדי פסים לתוך צלחת האגר, לפי תבנית זיג-זג. חזור על שלב זה באמצעות לוח נפרד כעותק כפול. ניתן לפזר עד חמש צלחות באותה לולאה.</li>
	<li>יש לדגור על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C לצמיחת חיידקים אופטימלית. מעבירים את החיידקים מדי יום במשך 3 ימים. מחממים את צלחות אגר הדם במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לוקחים בין 15 ל -20 מושבות מצלחת האגר הראשונה באמצעות לולאת חיסון חד פעמית, ומפזרים אותם לצלחת אגר חדשה שחוממה מראש. תייגו את הצלחת בהתאם.</li>
</ol>2. גידול חיידקים ואחסונם לשימוש עתידי
<ol><li>לאחר 3 ימים, הרימו עד 30 מושבות מצלחת אגר הדם עם לולאת פסים, והניחו אותה ישירות לתוך בקבוק של 250 מ"ל המכיל מרק טוד יואיט (מרק TH). דוגרים ב-37°C, רועדים ב-250 סל"ד, עם 5%CO2 למשך כ-4 שעות.</li>
	<li>קח aliquots כל 15 דקות כדי למדוד את OD620nm עד שהוא מגיע 0.3, אשר שווה ערך כ 3 x 108 יחידות יצירת מושבה (CFU) לכל מ"ל.</li>
	<li>Aliquot החוצה 1 מ"ל של מלאי החיידקים החדשים מיד לתוך 2 מ"ל בקבוקונים קריוגניים. הקפיאו את הבקבוקונים הטריים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות. לאחסן aliquots של חיידקים במקפיא -80 מעלות צלזיוס (בקבוקונים יכולים לשמש עד 6-8 חודשים לפני שהם מאבדים עוצמה).</li>
	<li>לאחר 7 ימים של הקפאה, aliquots ניתן להשתמש עבור מחקרים בבעלי חיים. לכן, לקבוע את הריכוז החדש של החיידקים.</li>
</ol>3. הפשרת חיידקים לצורך החדרה תוך טרכאלית
<ol><li>מחממים צלחת אגר דם במשך 10 דקות ב 37 ° C בשייקר. קחו את אחד מבקבוקוני המלאי החדשים מהמקפיא והפשירו אותו על ידי תסיסה עדינה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-2 דקות. הימנעו מלגעת בטבעת ה-O או במכסה עם המים החמים.</li>
	<li>צלחת על צלחת אגר דם כדי לספור ידנית את מושבות החיידקים. בצע דילול 1 x 10-6 , צלחת 200 μL מן הדילול האחרון בצלחת אגר דם שחומם מראש. עשו זאת בכפילויות.</li>
	<li>לדגור על הצלחות במשך הלילה ב 37 ° C לצמיחה אופטימלית של החיידקים. למחרת, החל את הנוסחה הבאה כדי לקבוע את ריכוז החיידקים החדש: CFU/mL = (מספר מושבות x גורם דילול) / נפח מצופה מלאי</li>
</ol>4. החדרה intratracheal של חיידקים חיים
הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להחדרה של נפח של 50 μL תוך קנה הנשימה. ניתן לאחסן מלאי חיידקים עד 6-9 חודשים. כדי להבטיח את ה-CFU החיידקי בכל בקבוקון, הקפידו לצלוח אותו לפני כל ניסוי, לחשב את מלאי החיידקים CFU כמתואר לעיל, ולהשתמש בציר TH לדילולים הבאים.
זהירות: מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, בצע הליך הישרדות מכרסמים באמצעות כלי ניתוח סטריליים.
<ol><li>להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneally 100 מ"ג / ק"ג של קטמין ו 2.5 מ"ג / ק"ג של אצטילפרומזין. חזור על מספר העכברים המוזרקים בכל פעם. הערה: עכברים יכולים להיחשף לאיזופלורן כדי להקל על הטיפול בבעלי חיים. עם זאת, מטפל מנוסה המסוגל להזריק חומרי הרדמה תוך צפקיים מבלי לגרום למצוקה משמעותית של בעלי חיים יכול להימנע מחשיפה לאיזופלורן. מספר העכברים שיש להזריק תלוי במומחיות של המנתח.</li>
	<li>לאחר שכל העכברים נמצאים תחת הרדמה מתאימה, יש לאשר את ההרדמה על ידי צביטת זנב. הניחו את העכבר המרדים על משטח נקי ומעוקר, תלו את החיה ליד החותכות והדביקו בעדינות את הגפיים הקדמיות (איור 1A). הערה: כדי להבטיח את בריאות בעלי החיים, לספק סיכה הקרנית בכל בעלי החיים מורדמים. ניתן להשתמש בטיפות עיניים Carboxymethylcellulose, החלת טיפה אחת לכל עין.</li>
	<li>יש לגלח את אזור הצוואר ולחטא את האזור עם כלורהקסידין ו-70% אלכוהול. בעזרת מספריים כירורגיים, בצעו חתך שטחי של 1 ס"מ בצוואר בקו האמצע כדי להמחיש את קנה הנשימה (איור 1B). חתך קטן אחד אמור להספיק, אך אם רואים שפע של רקמת שומן, נתחו בזהירות את רקמת השומן אנכית כדי לדמיין את קנה הנשימה. הערה: השתמש בכפפות סטריליות ובמכשירים סטריליים באמצעות טכניקת הטיפים בלבד. הסיכון לזיהום הוא מינימלי אם ההליך מבוצע בתנאים סטריליים.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, intubate כל עכבר. משוך את הלשון החוצה בעדינות והכנס קטטר אנגיו 20 גרם דרך הפה, מקדם את הצנתר לתוך קנה הנשימה. הפעל לחץ עדין על קנה הנשימה כדי להקל על אינטובציה. הערה: מכיוון שקנה הנשימה הוא קדמי לגוף העכבר, כופף מעט את קצה הצנתר, מכיוון שזה יעזור לקבל את הזווית כדי לבצע אינטובציה מוצלחת לעכבר. החתך בצוואר מבוצע בעיקר למטרות הדמיה; לחילופין, המפעיל יכול לבצע אינטובציה עיוורת לקנה הנשימה.</li>
	<li>לאחר אינטובציה, חבר את העכבר למכונת הנשמה כדי לאשר אינטובציה. פרמטרי ההנשמה הרגילים המשמשים בהליך זה הם 200 מיקרוליטר של נפח שבץ ו -200 פעימות לדקה. הגבירו ו/או הנמיכו את קצב מכונות ההנשמה לזמן קצר לאישור מהיר וקל.</li>
	<li>לאחר אישור אינטובציה, נתק את העכבר ממכונת ההנשמה והחדיר בזהירות 50 μL של סוכן החיידקים דרך קטטר אנגיו באמצעות קצה העמסת ג'ל פיפט 200 μL. עבור עכברי ביקורת, להזריק 50 μL של מרק TH סטרילי.</li>
	<li>לאחר החדרת החומר החיידקי, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה כדי לסייע בחידוש הנשימה. השאירו את העכבר על מכונת ההנשמה למשך 30-60 שניות. לאחר הזרקת כל העכברים, לפקח על הנשימה שלהם. אם יש דפוס נשימה איטי, חברו שוב את העכברים למכונת הנשמה.</li>
	<li>סגור את החתך על ידי הוספת טיפה אחת קטנה של דבק על העור. חברו יחד את קפלי העור והפעילו לחץ עדין עד שהדבק מתייבש.</li>
	<li>הניחו את העכברים על כרית חימום להתאוששות ועקבו אחריהם מקרוב עד שיחזרו להכרה מספקת. העבירו את העכברים בחזרה לכלוב לאחר שהחלימו לחלוטין. לטיפול בכאב/מצוקה לאחר הניתוח, ניתן לטפל בעכברים באמצעות בופרנורפין, במינון של 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג תת עורית (SC). הערה: בעלי חיים עם ירידה במשקל של יותר מ -20% או חווים מצוקה משמעותית לאחר ההליך כגון עייפות, חוסר יכולת להגיע למים או מזון, נשימה מאומצת, תגובה לקויה לגירויים חיצוניים, או ירידה בערנות מנטלית יש להרדים.</li>
</ol>5. שטיפת סימפונות וקציר ריאות
<ol><li>הרדימו את העכבר על ידי הצבתו במיכל סגור המכיל 5% איזופלורן. המשך חשיפה לאיזופלורן למשך דקה אחת לאחר שהעכבר מפסיק לנשום. בצע thoracotomy כדי לאשר המתת חסד. הערה: יש לאשר המתת חסד באמצעות בדיקה חזותית וגופנית. הלב כנראה הפסיק לפעום והעכברים לא נשמו. ריריות צריכות להיות לבנות או חיוורות.</li>
	<li>הניחו את העכבר במצב שכיבה על לוח ניתוחים נקי ותלו אותו ליד החותכות. רססו את עור העכבר באתנול 70%. באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך צוואר קטן שטחי קו האמצע כדי לדמיין את קנה הנשימה של העכבר.</li>
	<li>לערבב את קנה הנשימה עם קטטר 20 גרם. בזהירות, הוסף 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט ללא סידן (PBS) intratracheally, באמצעות מזרק 1 מ"ל. אפשר הרחבת ריאות מלאה, ולאחר מכן לשאוף את הנוזל באמצעות אותו מזרק. חזור על שלב זה עבור סך של 2 מ"ל.</li>
	<li>העבר את BAL לתוך aliquot 2 מ"ל. בצע שלב זה פעמיים עבור נפח סופי של 2 מ"ל. אין לשטוף את הריאות עם יותר מ 1 מ"ל בכל פעם, בשל הסיכון הגבוה של הפרעה בחלל alveolar.</li>
	<li>פתחו את חלל בית החזה וחשפו את הריאה, הלב וקנה הנשימה באמצעות מספריים ומלקחיים. בזהירות לנתח את הסרעפת ולהסיר את כלוב הצלעות. הקפידו לא לצבוט את רקמת הריאה.</li>
	<li>לחצות את אבי העורקים הבטני כדי לאפשר exsanguination. יש לנקב את רקמת הריאה על ידי ביצוע חתך קטן של כ-2 מ"מ בחדר ימין באמצעות מספריים ולהזריק 5 מ"ל PBS קר באמצעות קטטר 20 גרם. PBS צריך לחורר את הריאה. אם מבוצע זילוח מתאים, רקמת הריאה תהפוך לבנה חיוורת וה- PBS יעזוב את התא התוך כלי דרך אבי העורקים הבטן.</li>
	<li>בזהירות, לחלץ את הריאות ולנתח אותם מן קנה הנשימה לבצע או היסטולוגיה או עיבוד נוסף השעיה תא בודד.</li>
	<li>אם עיבוד עבור היסטולוגיה, בזהירות להכניס קטטר 20 G כדי לנפח את הריאות עד 25 ס"מ H2O עם תמיסת פורמלין (ניטרלי חוצץ 10%). לאחר שהריאות אינן מנופחות, העבירו חוט תפר 3.0 באורך של כ-5 ס"מ מתחת לקנה הנשימה, וקשרו אותו בחוזקה פעמיים כדי להבטיח שהפורמלין יישאר ברקמת הריאה. בעדינות, לנתח את הריאה משאר הרקמות ומניחים אותו בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת פורמלין.</li>
</ol>6. עיבוד שטיפה ברונכואלבאולרי
<ol><li>צנטריפוגה את BAL ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. הסר את supernatant ללא תאים בצינור נפרד ואחסן ב -80 ° C. הערה: ניתן לבצע ניתוח נוסף בסופרנטנט BAL, כולל כימות חלבונים (למשל, בדיקת BCA13) או מדידה של סמנים ביולוגיים או ציטוקינים ספציפיים (מבחני ELISA ומבדקים מרובים עם פלטפורמות כגון MSD ולומינקס).</li>
	<li>Lyse את תאי הדם האדומים על ידי הוספת 100 μL של חיץ lysing במשך 1 דקות. נטרל את תגובת השקר על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS. צנטריפוגו את ה-BAL בטמפרטורה של 500 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות והסירו את הסופרנטנט.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב- PBS (100-300 μL; בהתבסס על גודל כדורי התא). בצע ספירת תאים עם 0.4% כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים ידנית או אוטומטית. השתמש בכדורית הנותרת לצביעת ציטומטריית זרימה ו / או שימור בהקפאה (על ידי השעיה בתמיסת שימור קריו) בחנקן נוזלי לבדיקות נוספות.</li>
</ol>7. עיבוד ריאות להשעיית תא בודד
<ol><li>נתחו בעדינות את הריאה משאר הרקמות והניחו אותה בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל PBS קר. הסר את הריאה מ PBS ולייבש אותו באמצעות מגבת נייר.</li>
	<li>הכינו קוקטייל לעיכול על ידי הוספת 1 מ"ג DNase ו-5 מ"ג קולגנאז ל-1 מ"ל של מדיום נשר (DMEM) דל גלוקוז של Dulbecco. מעבירים את הריאה לצינור C המכיל 1 מ"ל קוקטייל עיכול.</li>
	<li>העבר את צינור C למפזר הרקמה ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי לעיבוד רקמת ריאה14.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של PBS קר לתוך צינור C וערבב כראוי. סנן את מתלה התא הבודד באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. בצעו את הסינון פעמיים.</li>
	<li>צנטריפוגה את המתלה ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. מרוקנים בזהירות את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ"ל של חיץ שכיבה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מ"ל של PBS קר כדי לעצור את תגובת השקר ולהסיר supernatant.</li>
	<li>צנטריפוגה את המתלה ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. בזהירות decant supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של PBS קר.</li>
	<li>בצע ספירת תאים עם כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים ידנית או אוטומטית. השתמש בכדורית תא לצביעת ציטומטריית זרימה ו / או שימור בהקפאה בחנקן נוזלי לבדיקות נוספות.</li>
</ol>

<ol><li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+patterns+of+care%2C+and+mortality+for+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+in+intensive+care+units+in+50+countries%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries.</a> JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>Hariri, L., Hardin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%2C+angiogenesis%2C+and+ARDS+endotypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Covid-19, angiogenesis, and ARDS endotypes.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (2), 182-183 (2020).</li>
<li>Ferguson, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berlin+definition+of+ARDS%3A+an+expanded+rationale%2C+justification%2C+and+supplementary+material%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material.</a> Intensive Care Medicine. 38 (10), 1573-1582 (2012).</li>
<li>Tomashefski Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+pathology+of+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary pathology of the adult respiratory distress syndrome.</a> Clinics in Chest Medicine. 11 (4), 593-619 (1990).</li>
<li>Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cytokines+and+ARDS%3A+Roger+S.+Mitchell+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture.</a> Chest. 116 (1 Suppl), 2S-8S (1999).</li>
<li>Colletti, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor-alpha+in+the+pathophysiologic+alterations+after+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathophysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat.</a> The Journal of Clinical Investigation. 85 (6), 1936-1943 (1990).</li>
<li>Donnelly, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+mortality+rates+and+decreased+concentrations+of+interleukin-10+and+interleukin-1+receptor+antagonist+in+the+lung+fluids+of+patients+with+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin-10 and interleukin-1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome.</a> Annals of Internal Medicine. 125 (3), 191-196 (1996).</li>
<li>Miller, E. J., Cohen, A. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+interleukin-8+concentrations+in+the+pulmonary+edema+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased interleukin-8 concentrations in the pulmonary edema fluid of patients with acute respiratory distress syndrome from sepsis.</a> Critical Care Medicine. 24 (9), 1448-1454 (1996).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (5), 725-738 (2011).</li>
<li>Kulkarni, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%3A+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), e1-e14 (2022).</li>
<li>Borsa, N., Pasquale, M. D., Restrepo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of pneumococcal pneumonia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4220(2019).</li>
<li>Rubins, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+pneumolysin+in+the+early+pathogenesis+of+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dual function of pneumolysin in the early pathogenesis of murine pneumococcal pneumonia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 95 (1), 142-150 (1995).</li>
<li>Thermo Scientific, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pierce+BCA+Protein+Assay+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pierce BCA Protein Assay Kit.</a> , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23225 Forthcoming.</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1266(2009).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+review+of+analytical+approaches%2C+pathologic+features%2C+and+common+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute respiratory distress syndrome: a review of analytical approaches, pathologic features, and common measurements.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1074-1092 (2015).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Pneumonia.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 25(2021).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+resolves+pneumonia+via+ER%CE%B2+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Estradiol resolves pneumonia via ERβ in regulatory T cells.</a> JCI Insight. 6 (3), e133251(2021).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resolution+of+experimental+ARDS+through+IL-4-mediated+lung+macrophage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).</li>
<li>D'Alessio, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+lung+injury+and+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute lung injury and ARDS.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מודלים ניסיוניים של PNA מציעים פלטפורמה להערכת המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס פגיעה ופתרון של ARDS. המרכיבים הפתופיזיולוגיים שניתן להעריך כוללים מסלולים דלקתיים מוקדמים, פינוי חיידקים, שינויים דינמיים בנוף המערכת החיסונית, רזולוציית דלקת, פיברובלציה ותיקון אפיתל וכלי דם16. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר היבטים כאשר מתכננים לשכפל מודל זה של פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי דלקת ריאות, כולל גיל, מין, זן עכבר, גורמים מארחים פנימיים (למשל, מצב מדוכא חיסון), הפתוגן הספציפי והעומס החיידקי בו נעשה שימוש, והניסיון של הצוות המבצע את ההליך.
PNA הוא בין הגורמים המובילים ל- ARDS. בחרנו להשתמש ב-SPN וב-Kpn חיים, שהם הגורמים השכיחים ל-PNA שנרכש בקהילה ובבית חולים בבני אדם, בהתאמה17. אנו מציעים למטב מודלים חיידקיים של PNA על ידי טיטרציה של מינונים של חיידקים חיים כדי להשיג את פרופיל התמותה והפציעה הרצוי המתאים ביותר להשערת החוקר. ביצענו אופטימיזציה של חיסון חיידקים תוך-טרכאליים של 3 x 106 CFU עבור Spn ו-200 CFU עבור Kpn בעכברים, אשר גרם לדלקת בנאדיות, הפרעה במחסום הנאדיות ותפקוד לקוי של איברים (איור 2). עם זאת, אצוות חיידקים ממקורות שונים או אפילו בתוך לולאות כפולות יכולות להציג דרגות שונות של דלקת ופציעה, אפילו כאשר משתמשים באותו זן ובאותו CFU.
לכן, כדי לשחזר את התוצאות המוצגות בכתב יד זה, על החוקרים להתחיל עם ריכוז החיידקים המתואר כאן; עם זאת, ייתכן שיהיה עליהם להגדיל או להקטין את המינון כדי לקבל פרופיל מודל דומה. לפיכך, כל אצווה חדשה של חיידקים המנוצלת צריכה להיות מותאמת לאפקט פתרון הפציעה הפוטנציאלי שלה. אנו מציגים מודל חזק של PNA עם שתי תוצאות רזולוציה שונות, האחת פתרון עצמי (Spn) והשנייה פתרון איטי / לא פותר (Kpn) אשר יכול לשמש פלטפורמות לחוקרים להעריך מנגנונים אימונולוגיים ולבחון התערבויות טיפוליות, במיוחד בשיא הזיהום או אחריו (למשל, יומיים לאחר ההדבקה).
גיל, מין, מתח וגורמים גנטיים משפיעים על הקינטיקה של דפוסי פתרון הפגיעה16. לדוגמה, יחסי מין מואצים ברזולוציה אצל נקבות בהשוואה לזכריםבני 18; לכן, עלייה בעומס החיידקים מובילה לתמותה מוגברת ולעיכוב ברזולוציה אצל זכרים בהשוואה לנקבות. הזדקנות היא גורם נוסף שיש לקחת בחשבון כאשר משתמשים ב-CFU של חיידקים המנוצלים. עכברים מזדקנים הציגו תמותה של 100% כאשר השתמשנו במינון Spn שצוין (לא מוצג כאן). עכברים צעירים נמצאים בשימוש הנפוץ ביותר במודלים PNA פנאומוקוקי (החל 6 עד 14 שבועות), בעוד עכברים מבוגרים (19-26 חודשים) מציגים תגובה חיסונית שונה ומשמשים לחקור את תפקיד ההזדקנות ב- PNA11. היינו צריכים להקטין את CFU עד 300% כדי להשיג הישרדות בבעלי חיים מזדקנים (לא מוצג כאן). עכברי C57BL/6 זכרים (בני 8-12 שבועות) שימשו במחקר זה והיו במעקב במשך 6 עד 10 ימים לאחר ההדבקה. הבדלים משמעותיים ברגישות ניתן למצוא גם בין זנים; לזנים מולדים כגון BALB/C ו-C57BL6/J יש תגובות שונות לזיהום11,19.
חיסון ישיר של חיידקים תוך קנה הנשימה מאפשר העברה מדויקת יותר של החיסון (עד 99%) לריאות12, המייצג חלופה לסרוטיפים פחות אלימים ומפחית את האירוסוליזציה של חיידקים11. עם זאת, ניתן לטעון כי מדובר בהליך פולשני. אינטובציה יכולה להיות מאתגרת, דורשת הרדמה מערכתית, ויכולה להוביל לטראומה בקנה הנשימה עם בצקת בדרכי הנשימה וסטרידור לאחר מכן. עכברים יכולים לפתח רפלקס vasovagal המוביל לדום נשימה, שעבורו נדרש מאוורר עכבר קטן כדי לספק תמיכה נוספת להנשמה בעת הצורך. מומחיותו של המנתח המבצע את ההליך היא מרכיב קריטי להבטחת אינטובציה מוצלחת11. במחקר שלנו, לא היה צורך להרדים עכברים עקב ניהול כאב מתאים ולא יותר מ-20% ירידה במשקל הגוף. לא נראו סימנים של כאב ומצוקה כגון עייפות, חוסר יכולת להגיע למים או למזון, נשימה מאומצת או ירידה בערנות המנטלית. שיטות חלופיות להעברה ישירה של חיידקים לריאות הן שאיפת הלוע, אם כי נראה כי פתרון הפגיעה בריאה מתרחש מהר יותר, וחלק מהחיידקים יכולים להסתיים בקיבה ובדרכי העיכול20.
מודלים פרה-קליניים של PNA מאפשרים לחוקרים להעריך את הנוף החיסוני. ניתן להעריך תאים ברונכואלבאולריים ואינטרסטיציאליים לשינויים דינמיים בתאי מערכת החיסון16. יתר על כן, תאים יכולים להיות בתרבית וגירוי ex vivo כדי לקבוע את הייצור הספציפי שלהם של ציטוקינים וכימוקינים. כאן, אנו מתמקדים בחקר נוף תאי החיסון בריאה וב-BAL באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת צבעים. ריצוף RNA של תא בודד יכול להתבצע גם כדי להבין את חתימות השעתוק הספציפיות לתא בשלבים שונים של פתרון פציעה.
מודלים של PNA-ARDS מייצרים השפעות מערכתיות שניתן לזהות בשלב מוקדם על ידי מדידת משקל הגוף במהלך המחלה10. למרות שאיננו מודדים ישירות השפעות מערכתיות של ARDS, תפקוד לקוי של איברים יכול להיות מוערך גם על ידי מדידת דם של פרופילים כימיים, ועל ידי קצירת רקמות שונות כגון טחול, כליות וכבד עבור היסטולוגיה. השפעות סיסטמיות של PNA-ARDS פנאומוקוקי תוארו בעבר על ידי קבוצות אחרות המשתמשות באותו זן חיידקים21.
כאן, מתואר מודל של PNA ניסיוני הדומה לחלק מהממצאים הפתופיזיולוגיים העיקריים העומדים בבסיס ARDS אנושי. למרות שאין מודלים אידיאליים המשחזרים לחלוטין את המורכבות וההטרוגניות של ARDS9 האנושי, מודלים אלה רלוונטיים וניתנים לשחזור לחקר מנגנוני הפגיעה והתיקון של ריאות, ומשמשים גם פלטפורמה לזיהוי מטרות פרמקולוגיות פוטנציאליות חדשות המתמקדות בהאצת הרזולוציה של דלקת ריאות ובקידום תיקון ריאות.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Host infection response graphs; body weight, protein, cell counts vs. days; infection comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">
to:
<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.

Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) נותרה תסמונת קטלנית ומשביתה נפוצה הפוגעת בכ-10% מהחולים ביחידות לטיפול נמרץ ועד 23% מהאנשים המונשמים, מה שמוביל לשיעור תמותה בבתי חולים של 35%-46%1. יתר על כן, מגיפת COVID-19 האחרונה הדגישה מחדש את החשיבות של לימוד ARDS. מקרים חיוביים ל- COVID-19 היוו עלייה בתמותה מ- ARDS, תוך הדגשת המגבלה של טיפולים תרופתיים2.
בבני אדם, ARDS מאופיין על ידי התפרצות מהירה של היפוקסמיה(PaO2 / FiO2 < 300) וראיות של בצקת ריאות דו צדדית לא הידרוסטטית עקב חדירות מוגזמת alveolar-capillary ו alveolitis3. למרות ש- ARDS תואר באופן מסורתי כדפוס של פגיעה ריאתית חריפה (ALI) משנית למגוון עלבונות, דלקת ריאות חיידקית ונגיפית (PNA) נותרה בין הגורמים השכיחים ביותר. תוארו שלושה שלבים פתופיזיולוגיים עיקריים, כלומר השלבים האקסודטיביים, השגשוגיים והפיברוטיים ואילו שני המאפיינים הקרדינליים העיקריים של ARDS הם דלקת לא מווסתת והפרעה בנאדיות4. במהלך תהליכים אלה, פגיעה בנאדיות נוצרת על ידי שחרור ציטוקינים דלקתיים (למשל, גורם נמק הגידול [TNF-α], אינטרלוקין [IL-1β, IL-6, IL-8 וכו ']), זרם של נויטרופילים ומקרופאגים דלקתיים, והצפה של נוזל עשיר בחלבון. בסופו של דבר, אירועים אלה מובילים לנזק מכתשית טלאי ודו צדדי 5,6,7,8.
למרות שהושגה התקדמות משמעותית בהבנת פגיעות ריאה ודלקות מוקדמות, המנגנונים העומדים בבסיס הרזולוציה של PNA ידועים פחות וצריכים להיות במוקד של חקירות מכניסטיות עתידיות. המטרה העיקרית של מאמר שיטה זה היא לספק לחוקרים מודל לפתרון פציעות של דלקת ריאות זיהומית שיכול לשכפל את התכונות הפתופיזיולוגיות העיקריות של ARDS. אנו מציעים כי מודל זה יסייע להבין טוב יותר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס הרזולוציה של דלקת ריאות ותיקונה, ובכך ישמש פלטפורמה לטיפולי הצלה.
השלבים הפיזיופתולוגיים העיקריים המתרחשים במהלך ARDS יכולים להיות משוכפלים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים של ALI, אשר צריכים לכלול עדות היסטולוגית של תגובה דלקתית, פגיעה ברקמות, תפקוד פיזיולוגי לקוי, alveolitis, ושינוי של מחסום alveolar-capillary9. מודל עכבר המשרה PNA ו- ALI הוא יתרון בשל יכולת הרבייה הגבוהה שלו, הרבייה המהירה והזמינות של כלים מרובים לביצוע מחקרים מכניסטיים ומולקולריים. אין מודל יחיד המשחזר באופן מלא את כל התכונות של ARDS9 האנושי.
מודלים של PNA בעכברים מאפשרים שכפול של המנגנונים הפתופיזיולוגיים העיקריים המיוצרים על ידי ARDS זיהומיות בבני אדם, כגון התפרצות מהירה, עדות לפגיעה ברקמות בהיסטולוגיה, פגיעה במחסום הנאדיות-נימי, עדות לתגובה דלקתית ותפקוד פיזיולוגי לקוי תוך יצירת תמותה צנועה10 . מודלים זיהומיים יכולים להיגרם על ידי משלוח מקומי או מערכתי של הפתוגן, עם ניהול intranasal, intratracheal, תוך ורידי להיות נתיבי הממשל השכיחים ביותר. המסלול התוך טרכאלי מאפשר חיסון ישיר של הגורם המדבק לריאות, הפחתת אירוסוליזציה ואופטימיזציה של הלידה11,12.
המתודולוגיה של מודל מורין פרה-קליני של PNA על ידי החדרה תוך טרכאלית של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס חיה (Spn) או דלקת ריאות קלבסיאלה (Kp) מתוארת כאן. מודלים אלה מייצגים תחליף טוב של ARDS המיוצר על ידי PNA חיידקי, בעל מספר יתרונות, כולל: גורמים נפוצים של PNA-ARDS אנושי (קהילה ובית חולים שנרכשו); יכולת שחזור גבוהה; תמותה ופציעה ניתן בקלות titrated (מודלים שונים של דלקת ריאות) כדי להציג תגובה דלקתית חזקה, המוביל alveolitis ותפקוד alveolocapillary; הערכת שלבים מוקדמים ומאוחרים של פגיעה ריאתית ופתרון; והערכת אסטרטגיות טיפוליות בשלבים שונים של PNA-ARDS.

<table><tbody><tr><td>1-200 ומיקרו; L עגול 0.5 מ"מ עבה ג'ל עומס קצות פיפט</td><td>קורנינג</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל בקבוקונים קריוגניים</td><td>קורנינג משולב</td><td>431420</td><td>2 מ"ל עומד בפני עצמו, תחתית עגולה, מכסה אדום, פוליפרופילן</td></tr><tr><td>2 מ"ל Eppendorf&nbsp; Snap-Cap Microcentrifuge Biopur צינורות נעילה בטוחה</td><td>Fisherscientific</td><td>05-402-24C</td><td>צורה:&nbsp; עגול, אורך (מטרי):&nbsp; 38 מ"מ, קוטר (מטרי) חיצוני:&nbsp; 10 מ"מ, קיבולת (מטרי):&nbsp; 2 מ"ל</td></tr><tr><td>70 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>לבן, סטרילי, ארוז בנפרד</td></tr><tr><td>96 בארות בז תחתון עגול שקוף 96 בארות</td><td></td><td>353077</td><td>&nbsp; מיקרו-צלחת תרבית תאים שטופלה ב-TC, עם מכסה, עטופה בנפרד,</td></tr><tr><td>הזרקת אצפרומיזין מלאט סטרילית, USP 500 מ"ג/50 מ"ל (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>כל מ"ל מכיל: אצפרומזין מלאט 10 מ"ג, נתרן ציטראט 0.36%, חומצת לימון 0.075%, בנזיל אלכוהול 1% ומים להזרקה.</td></tr><tr><td>אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר ליסיינג</td><td>איכות ביולוגי</td><td>118-156-721</td><td>4 x 100 מ"ל</td></tr><tr><td>נגד עכבר I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cyanine7 אנטי-עכבר I-A/I-E [M5/114.15.2]; איזוטיפ:</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון</td> IgG2b BCA של חולדה <td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BD טריפטיקז אגר סויה&nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>5% צלחות מערם מדיה מוכנות מדם כבשים, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Biotix מאגרי ריאגנטים חד פעמיים</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td>509723</td><td>Integrin alpha E) אוגר ארמני נגד עכבר, FITC, שיבוט: 2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-טקסס אדום, שיבוט: M1/70.15, Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>אוגר נגד עכבר, APC-R700, שיבוט: N418, BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC נגד עכבר CD19 [1D3/CD19]; איזוטיפ: חולדה IgG2a, &kappa;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>עכברוש נגד עכבר, סגול מבריק 711, שיבוט: M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395; שיבוט: GK1.5</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 נגד עכבר CD45 [30-F11]; איזוטיפ: חולדה IgG2b, &kappa;;</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>אנטי מורין חולדות, אולטרה סגול מבריק 737, שיבוט: 53-6.7</td></tr><tr><td>שקופיות ספירת תאים&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>עבור מסננת תאים TC20 70</td></tr><tr><td>ומיקרו; L בז ניילון</td><td></td><td>198718</td><td>REF 352350</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג1&nbsp;</td><td>תאגיד הביוכימיה וורת'ינגטון</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטוקוקוס דלקת ריאות בלולאה קולטית&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>לולאות/מחטי חיסון חד פעמיות</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-603</td><td>צבע כחול; כרך 1 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני)</td><td>קורנינג</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc בלוק</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 חולדה נגד עכבר, ללא תווית, שיבוט: תמיסת פורמלין 2.4G2</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין</td><td>סיגמא-אלדריך</td><td>HT501640</td><td>פורמלין, ניטרלי חוצץ, 10%</td></tr> <tr><td>ספוגי גזה, Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-gentleMACS</td><td></td></tr> <tr><td>C Tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>SN: 4715</td></tr><tr><td>Hema 3 מערכת צביעה ידנית וחבילת סטטיסטיקה</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>23123869</tr><tr><td>אינהלציה נוזלית איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IV קטטר JELCO 20GX1.25 "</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת קטמין HCl</td><td>הנרי שיין</td><td>1049007</td><td>קטמין HCl הזרקה MDV 100 מ"ג/מ"ל 10 מ"ל 10 מ"ל 10 / קופסה</td></tr><tr><td>קלבסיאלה פנאומוניה&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7257009</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; איזוטיפ: עכברוש IgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>נגד עכבר, סגול מבריק 510, שיבוט: 1A8, BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent Type 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March (גרמניה)</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>עכבר נגד עכבר, PE, שיבוט: PK136, BD</td></tr><tr><td>שלב Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג</td> מי <td>מלח חוצץ פוספט</td><td>21-040-CV</td><td>1X ללא סידן ומגנזיום,</td></tr> <tr><td>תחתון עגול</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פוליסטירן תחתון עגול&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>עם מכסה הצמד מסננת תאים, 5 מ"ל</td></tr><tr><td>SealRite 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה טבעי</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>ללא רנאז, DNase, DNA ופירוגנים הניתנים לזיהוי.</td></tr><tr><td>Shandon EZ Single Cytofunnel</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>נגד עכברים, סגול מבריק 421, שיבוט: E50-2440</td></tr><tr><td>משי שחור קלוע 30 אינץ' (75 ס"מ) תפר כירורגי סטרילי, בלתי נספג U.S.P.</td><td>Ethicon</td><td>K-834</td><td>0 (3.5 מטרי)</td></tr> <tr><td>קליפ שקופיות נירוסטה</td><td>Epredia</td><td>59910052</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי חד פעמי מסנן ואקום יחידות</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>1660045</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 1 מ"ל</td><td>BD-Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TC20 אוטומטי מונה תאים</td><td>Bio-Rad</td><td>508BR05740</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 200 ul צהוב פיפט מילוי טיפ</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>מרק טוד יואיט RPI</td><td></td><td>T47500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תא מדגם TPX</td><td>Epredia</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>תא מדגם יחיד TPX, כובעים וכרטיסי סינון</td><td>Epredia</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Bio-rad</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>U-100 מזרקי אינסולין</td><td>BD-Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>כרית חום חשמלית רב-חום עמידה בפני רטיבות</td><td></td><td>דגם PR7791AB</td><td>120 volst AC; 45 וואט; רשום 562B/E26869</td></tr></tbody></table>

מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) גורמת לפגיעה ריאתית חריפה, המאופיינת בנזק מהיר לנאדיות והיפוקסמיה. זה, בתורו, מוביל לתחלואה ותמותה גבוהה. נכון לעכשיו, אין מודלים פרה-קליניים המשחזרים את המורכבות של ARDS. עם זאת, מודלים זיהומיים של דלקת ריאות (PNA) יכולים לשכפל את התכונות הפתופיזיולוגיות העיקריות של ARDS. במאמר זה אנו מתארים מודל של PNA המושרה על ידי החדרה תוך-טרכאלית של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס חיה ודלקת ריאות קלבסיאלה בעכברי C57BL6. על מנת להעריך ולאפיין את המודל, לאחר גרימת פציעה, ביצענו מדידות סדרתיות של משקל גוף ושטיפת סימפונות (BAL) למדידת סמנים של פגיעה ריאתית. בנוסף, אספנו ריאות עבור ספירת תאים ודיפרנציאלים, כימות חלבוני BAL, ציטוספין (cytospin), ספירת יחידות יוצרות מושבות חיידקים והיסטולוגיה. לבסוף, בוצעה ציטומטריית זרימה ממדית גבוהה. אנו מציעים מודל זה ככלי להבנת הנוף החיסוני בשלבי הרזולוציה המוקדמת והמאוחרת של פגיעה ריאתית.

ההליכים שתוארו לעיל אפשרו מידול של המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס פגיעה ריאתית חיידקית הנגרמת על ידי דלקת ריאות בעכברים. כדי להתחיל למדל, עכברי בר מסוג C57BL/6 (WT) התקבלו ממעבדת ג'קסון וגודלו במתקן בעלי החיים של המכון. עכברי WT C57BL/6 זכרים, בני 8 שבועות, עברו חיסון תוך טרכאלי של מרק TH (ביקורת), 3 x 106 CFU של SPN חי, או 200 CFU של Kpn חי. לאחר ההדבקה, העכברים היו במעקב במשך 6 ו -10 ימים עבור Spn ו - Kpn, בהתאמה. אף על פי שהקבוצות שנדבקו הציגו משקל גוף נמוך יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא נדבקו, קבוצת Spn התאוששה ממשקל גופם לקראת נקודת ההתחלה, בעוד שעכברים שנדבקו ב-Kpn הציגו התאוששות איטית לאחר 6 ימי הדבקה (איור 2A). במהלך המחקר, אף עכבר לא נזקק להמתת חסד עקב משקל גוף מעל 20%, ולא נמצאה עדות לכאב ומצוקה.
מדדנו פגיעה ריאתית בפרקי זמן שונים. ריכוז חלבון BAL וספירת התאים הכוללת הן עבור ה-BAL והן עבור הריאות היו גבוהים באופן ניכר בקבוצות הנגועות (איור 2). חתכים היסטולוגיים מייצגים שהציגו את התהליך הדלקתי בשני המודלים התקבלו ביום 2, 4 ו-6 לאחר החיסון (איור 3), והראו עדות לדלקת מכתשית מתמשכת בעכברים שנדבקו ב-Kpn (איור 4), אפילו ביום ה-10. עכברים שנדבקו ב-Kpn המשיכו את הפציעה ביום ה-10 (איור 2 ואיור 4), בעוד שעכברים שנדבקו ב-Spn פתרו את דלקת הריאות ביום 6 (איור 2 ואיור 3).
תרחיפים של תאים בודדים ריאתיים שימשו להבחנה בנוף החיסון על ידי ציטומטריית זרימה בממדים גבוהים ביום 6 לאחר ההדבקה במודל Spn , באמצעות פאנל של 18 צבעים במיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). באמצעות הטבעה של שכן סטוכסטי מבוזר t (t-SNE), ניתן לדמיין הבדלים כוללים בהרכב תאי החיסון, להיות יוצא דופן עבור מספר מוגבר של גרנולוציטים (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), מקרופאגים interstitial (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), מונוציטים (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), תאי B (CD45+, CD19+), ותאי T (CD45+, CD3+), כולל תאי הרג טבעי (CD45+, CD3+, NK1.1+), כולל תאי הרג טבעיים (CD45+, CD3+, NK1.1+), כפי שמוצג באיור 5. אסטרטגיות גאטינג מוצגות באיור 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg"> איור 1: הליך כירורגי להחדרה תוך-קנה הנשימה של חיידקים חיים. (A) מיקום העכבר באזור הניתוח הסטרילי, תלוי ליד החותכות. (B) אזור החתך וחשיפה לקנה הנשימה. (C) תהליך אינטובציה להחדרת צנתר 20 גרם. איור שנוצר באמצעות Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg"> איור 2: פרופילי פגיעה ריאתית חריפה (ALI) לאחר מודלים של דלקת ריאות. (A) משקל גוף לאורך זמן ביחס לקו הבסיס, בקרה לעומת Kpn ו-Spn (n = 4, לכל קבוצה). (B) כימות חלבון כולל BAL על ידי בדיקת BCA (n = 4, לכל קבוצה). (C) ספירת התאים הכוללת של BAL בבקרה (n = 3), Kpn (n = 4) ו- Spn (n = 3). (D) ספירת תאי הריאות הכוללת בבקרה (n = 3), Kpn (n = 4) ו- Spn (n = 3). (ה-ג) דיפרנציאל תאי BAL לפי ספירת היסטולוגיה ידנית של ציטוספין BAL בבקרה (n = 3), Kpn (n = 4) ו- Spn (n = 3). בדיקות סטטיסטיות נעשו על ידי מבחן t בודד, המשווה את קבוצת הבקרה הלא נגועה לעומת הקבוצות הנגועות. *P &lt; 0.05. הנתונים מוצגים באמצעות שגיאת תקן (SE) עבור כל חלקה. ציר y הוא ימים לאחר ההדבקה עבור כל הפאנלים. קיצורים: BAL = שטיפה bronchoalveolar; Spn = דלקת ריאות סטרפטוקוקוס; Kpn = דלקת ריאות קלבסיאלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg"> איור 3: ממצאים היסטופתולוגיים של הריאות במהלך זיהום Spn . המטוקסילין ואוזין (H&amp;E) צביעה של חלקים היסטולוגיים של BAL מייצג וחתך ריאות לאחר זיהום intratracheal של Spn ובימים 2, 4, ו 6. הגדלה BAL = 100x; הגדלת ריאות = פי 10. קיצורים: BAL = שטיפה bronchoalveolar; Spn = דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg"> איור 4: ממצאים היסטופתולוגיים ריאתיים במהלך זיהום Kpn . המטוקסילין ואאוזין (H&amp;E) צביעה של חתכים היסטולוגיים של BAL מייצג וחתך ריאות לאחר זיהום תוך טרכאלי של Kpn בימים 2, 4, 6 ו -10. התמונות מציגות הגדלה בעוצמה גבוהה (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). קיצורים: BAL = שטיפה bronchoalveolar; Kpn = דלקת ריאות קלבסיאלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg"> איור 5: נוף תאי מערכת החיסון על-ידי ציטומטריית זרימה מרובת צבעים לאחר 6 ימים של זיהום Spn . (A) נעשה שימוש בהטבעה של שכן סטוכסטי מבוזר T (t-SNE) כדי לדמיין את אוכלוסיות תאי החיסון (CD45+) של הריאה, תוך השוואה בין קבוצת הבקרה הלא נגועה לעומת הקבוצה הנגועה. (B) סיכום של תדרי תאי החיסון מתוך סך תאי CD45+ בריאה. (C) ספירת התאים הכוללת של כל אוכלוסייה בנפרד. השוואות סטטיסטיות נעשו על ידי בדיקות t בין קבוצת הביקורת לבין הנדבקים. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0,001. הנתונים מוצגים באמצעות שגיאת תקן (SE) עבור כל חלקה. קיצורים: BAL = שטיפה bronchoalveolar; Spn = דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg"> איור 6: אסטרטגיות Gating לזיהוי תת-אוכלוסיית תאי החיסון בריאות בתחילת המחקר ולאחר דלקת ריאות. תרחיף תאי BAL ותאי ריאה עבר צביעה עבור ציטומטריית זרימה צבעונית. הפסולת גודרה תחילה באמצעות SSC-A ו-FSC-A, והתאים הבודדים גודרו על ידי שתי אסטרטגיות (SSC-W לעומת SSC-H ו-FSC-W לעומת FSC-H). תאים חיים זוהו באמצעות מבחין חי/מת לעומת SSC-A. אוכלוסיות תאים עוקבות זוהו על ידי סמנים שזוהו בעבר 15. קיצור: BAL = שטיפה bronchoalveolar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כתב יד זה מתאר את ביסוס מודל זיהומי של דלקת ריאות בעכברים ואת אפיון פתרון הפגיעה בהתאמה יחד עם שיטות לגידול חיידקים והחדרה תוך טרכיאלית. מתוארת גם גישה חדשנית המשתמשת בציטומטריית זרימה בממד גבוה להערכת הנוף החיסוני.

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

פרוטוקול זה מספק מודל ניתן לשחזור של דלקת ריאות היוצרת פגיעה חזקה וחריפה בריאות. יתרונות נוספים של מודל זה הוא שניתן להשתמש בו כדי לשחזר ARDS זיהומיות או תסמונת מצוקה נשימתית חריפה בעכברים. כפי שציינתי, מודל זה ניתן לשחזור רב שבו ניתן בקלות לדרג את רמת התמותה והפציעה כדי להעריך שלבים מוקדמים ומאוחרים של פגיעה ריאתית חריפה ופתרון, המשמש פלטפורמה להערכת אסטרטגיות טיפוליות.למרות שפרוטוקול זה אינו מספק גישה חדשנית לאבחון או טיפול בפגיעה ריאתית, זהו מודל אמין שבו ניתן לבדוק טיפולים חדשים, שהוא שימושי במיוחד בתחומים הקשורים לאימונולוגיה, מחלות ריאה ומחלות זיהומיות. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא יכולת השחזור שלה. עם זאת, אנשים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה עלולים להיתקל בקשיים בהחדרת הצנתר תוך קנה הנשימה.לכן באופן אידיאלי, אנשים הלומדים טכניקה זו צריכים להתחיל לתרגל בעלי חיים מורדמים. כדי להתחיל, לחמם צלחת אגר דם במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מחומם או אינקובטור. מוציאים בקבוקון חדש של בקטריאל מהמקפיא ומפשירים אותו בתסיסה עדינה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שהבקבוקון מופשר לחלוטין.יש להימנע מלגעת בטבעת ה-O או במכסה במים חמימים. כדי לספור ידנית את מושבות החיידקים בצלחת, בצע דילול 1 פעמים 10 עד שש וצלחת 200 מיקרוליטר מהדילול האחרון על צלחת אגר דם שחומם מראש. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.למחרת, לקבוע את ריכוז החיידקים החדש על ידי יישום נוסחה נתונה. הניחו את העכבר המורדם על משטח נקי ומעוקר. תלו את העכבר ליד החותכות והדביקו בעדינות את הגפיים הקדמיות.יש לגלח את אזור הצוואר ולחטא את האזור עם כלורהקסידין ו-70% אלכוהול. לאחר מכן באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך צוואר של סנטימטר אחד, שטחי קו האמצע כדי לדמיין את קנה הנשימה. אם רואים שפע של רקמת שומן, לנתח בזהירות את רקמת השומן אנכית כדי לדמיין את קנה הנשימה.משוך את הלשון החוצה בעדינות והכנס צנתר אנגיו 20 מד דרך הפה, מקדם את הצנתר לתוך קנה הנשימה. הפעל לחץ עדין על קנה הנשימה כדי להקל על אינטובציה. לאחר אינטובציה, חבר את העכבר למכונת הנשמה כדי לאשר אינטובציה.הגדר את פרמטרי ההנשמה ל -200 מיקרוליטר נפח גאות ושפל ו -200 פעימות לדקה. לאחר אישור אינטובציה, לנתק את העכבר ממכונת ההנשמה בזהירות להחדיר 50 מיקרוליטר של סוכן חיידקי דרך קטטר אנגיו באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, קצה העמסת ג'ל. לאחר ההתקנה, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה כדי לסייע בהפעלה מחדש של הנשימה.השאר את העכבר על מכונת ההנשמה למשך 30 עד 60 שניות כדי לפקח על הנשימה. אם נצפה דפוס נשימה איטית, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה. סגור את החתך על ידי הוספת טיפה אחת של דבק לעור.חברו יחד את קפלי העור והפעילו לחץ עדין עד שהדבק מתייבש. הניחו את העכבר המרדים על לוח ניתוחים נקי ותלו אותו על ידי החותכות. לאחר ריסוס עור העכבר עם אתנול 70%, באמצעות מספריים, לבצע כריתה קטנה, שטחית, קו האמצע הצוואר כדי לדמיין את קנה הנשימה.לערבב את קנה הנשימה עם קטטר של 20 מד ולהוסיף בזהירות מיליליטר אחד של PBS ללא סידן תוך קנה הנשימה באמצעות מזרק של מיליליטר אחד. אפשר הרחבת ריאות מלאה, ולאחר מכן לשאוף את הנוזל באמצעות אותו מזרק. חזור על ההליך פעמיים עבור סך של שני מיליליטר.מעבירים את שטיפת הסימפונות, או BAL, לתוך aliquot שני מיליליטר. באמצעות מספריים, לפתוח את חלל החזה כדי לחשוף את הריאה, הלב קנה הנשימה. בזהירות לנתח את הסרעפת ולהסיר את כלוב הצלעות להבטיח לא לצבוט את רקמת הריאה.לחצות את אבי העורקים הבטני כדי לאפשר exsanguination. לנקב את רקמת הריאה על ידי ביצוע חתך קטן של כמילימטר עד שני מילימטרים בחדר הימני באמצעות מספריים והזרקת חמישה מיליליטר של PBS קר, באמצעות קטטר 20 מד. לאחר זילוח מוצלח, רקמת הריאה הופכת לבנה וחיוורת, וה- PBS עוזב את התא התוך כלי דרך אבי העורקים הבטן.לאחר מכן בזהירות לחלץ את הריאה לנתח אותו מן קנה הנשימה. לחלופין, אם הריאה משמשת להיסטולוגיה, הכנס בזהירות קטטר של 20 מד כדי לנפח את הריאות עד 25 ס"מ עם תמיסת פורמלין. לאחר שהריאות אינן מנופחות, העבירו חוט תפר 3/O באורך של כחמישה סנטימטרים מתחת לקנה הנשימה וקשרו אותו בחוזקה פעמיים כדי להבטיח שהפורמלין יישאר ברקמת הריאה.נתחו בעדינות את הריאה משאר הרקמות והניחו אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תמיסת פורמלין. צנטריפוגו את ה-BAL ב-500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנאטנט נטול התאים בצינור נפרד. Lyse תאי הדם האדומים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חיץ lysing במשך דקה אחת.נטרל את תגובת השקר על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגו את ה-BAL, והסירו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה ב-100 עד 300 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן, בצע ספירת תאים עם כתם כחול של 0.4% טריפאן על ידי ספירת תאים אוטומטית.נתחו בעדינות את הריאה מהרקמות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS קר. לאחר הנתיחה, הסר את הריאה מה- PBS וייבש אותה באמצעות מגבת נייר. לנתח את הריאה הימנית והשמאלית מרקמות אחרות שחולצו גם הן, כגון קנה הנשימה.הכינו קוקטייל עיכול כמתואר בכתב היד של הטקסט והעבירו את הריאה לצינור C המכיל מיליליטר אחד של קוקטייל עיכול. העבר את הצינור למפזר הרקמה ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי לעיבוד רקמת הריאה. לאחר דיסוציאציה, להוסיף 10 מיליליטר של PBS קר לתוך הצינור ולערבב כראוי.סנן את התרחיף החד-תאי באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. צנטריפוגר את המתלה והסר את הסופרנטנט. מוסיפים מילימטר אחד של חיץ שוכב למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר כדי לעצור את תגובת השקר ולהסיר את הסופרנטנט. השהה מחדש את התאים ב- PBS ובצע ספירת תאים עם כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים אוטומטית. לאחר פגיעה ריאתית חיידקית הנגרמת על ידי דלקת ריאות בעכברים, הקבוצות הנגועות הציגו משקל גוף נמוך יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא נדבקו.קבוצת Streptococcus pneumoniae או Spn התאוששה ממשקל גופם לקראת נקודת ההתחלה, בעוד ש-Klebsiella pneumoniae, או עכברים נגועים ב-Kpn הציגו התאוששות איטית לאחר שישה ימי הדבקה. ריכוז חלבון BAL וספירת התאים הכוללת הן עבור BAL והן עבור הריאות היו גבוהים במידה ניכרת בקבוצות הנגועות. חתכים היסטולוגיים מייצגים המציגים את התהליך הדלקתי בשני המודלים התקבלו ביום השני, הרביעי והשישי לאחר החיסון והראו עדות לדלקת מכתשית מתמשכת בעכברים שנדבקו ב- Kpn, אפילו ביום העשירי.עכברים שנדבקו ב-Kpn המשיכו את הפציעה עד היום ה-10, בעוד שעכברים שנדבקו ב-Spn פתרו את דלקת הריאות ביום השישי. נוף תאי חיסון על ידי ציטומטריית זרימה מרובת צבעים לאחר שישה ימים של זיהום Spn הראה מספר מוגבר של גרנולוציטים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, מונוציטים, תאי B ותאי T, כולל תאי הרג טבעיים. בעת ניסיון שיטה זו, החדרת הצנתר היא המפתח לזיהומים הניתנים לשכפול.זוהי שיטה אמינה המשמשת פלטפורמה לזיהוי מטרות לחקר פגיעה ריאתית חריפה ופתרון.

experimental-model-to-evaluate-resolution-of-pneumonia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום הריאות במודל מכרסם חיסוני באמצעות אינטובציה והתקנת תרחיפים חיידקיים באונות הריאה. מודל זה מאפשר מחקרי יעילות אנטיבקטריאליים בבעלי חיים בעלי יכולת חיסון.

החדרה תוך סימפונית של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס במודלים של מכרסמים חיסוניים

Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

פיתחנו מודל פגיעה ריאתית של עכבר על ידי הזרקה תוך-קנה של חיידקים Pseudomonas aeruginosa. מודל זה מחקה פגיעה ריאתית במהלך דלקת ריאות והוא רלוונטי מבחינה קלינית.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

מתוארת שיטה לקביעת זיהומי ריאות במכרסמים בעלי יכולת חיסונית. עם מיומנות, ניתן לבצע שיטה זו במהירות ובקלות כדי לגרום לזיהום יציב עם מבודדים רבים של S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ו-A. baumannii.

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

דלקת ריאות זיהומית היא בין הזיהומים הנפוצים ביותר של האדם. מודל המתאים ויוו חיוני להבנת הפתוגנזה של המחלה, בדיקת יעילותם של הריפוי. עם מודל דלקת ריאות השאיפה הלוע התחתון מאתר זה, ניתן לבחון הפתוגנזה של טיפולים חדשים נגד זיהומים קטלניים אלה.

השאיפה הלוע התחתון מאתר מודל של הנשמה-הקשורים ו רכשה החולים בדלקת ריאות חיידקית

כאן, אנו מציגים שיטות כדי לשפר את מחקרי דלקת ריאות משנית על ידי מתן תוואי לא פולשני של חוסר החלטיות לתוך דרכי הנשימה התחתונה ואחריו שחזור הפתוגן וניתוח תעתיק. הליכים אלה ניתנים לעיקור וניתן לבצעו ללא ציוד מיוחד כגון צינורית, חוטי מדריך או כבלי סיבים אופטיים.

משלוח הפתוגן מדויק מערכת השחזור של מודלים Murine של דלקת ריאות משנית בקטריאלי

הטיות סלקטיבית של חומצת הסימפונות לריאה השמאלית בעכברים גורמת לפגיעה בריאה חד צדדית ועצמית מוגבלת, אשר מודלים תסמונת מצוקה נשימתית חריפה של האדם (ברווזים) הנגרמת על ידי שאיפה חומצת קיבה.

מודל של פגיעה עצמית מוגבלת בריאה חריפה על ידי ברונכיט חד צדדית של חומצה בסימפונות

מאמר זה מתאר מודל עכברי חדשני למעבר של פנאומוקוק ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן הגורם למחלה במהלך זיהום ויראלי. מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות ומארח-פתוגן במהלך השלבים השונים של התקדמות המחלה ועל פני מארחים שונים.

מודל עכברי למעבר של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מקולונייזר לפתוגן עם זיהום משותף ויראלי מחזיר מחלה המחמירה בגיל

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים...

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

למד כיצד ליצור מודל ניסיוני לדלקת ריאות בעכברים לחקר פציעת ריאות חריפה ורזולוציה שלה. שיטה זו מאפשרת הערכת אסטרטגיות טיפוליות בתחומי האימונולוגיה והמחלות הזיהומיות.

מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

גלה סרטונים נוספים