מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

זו הפעם הראשונה שפותחה שיטה למדידת רמות המשדר הפפטידי in vivo. אנו יכולים למדוד את רמות המשדר הפפטידי בנבדקים בודדים ובמיקומים בדידים באמצעות ניתוח כמעט בזמן אמת. ראשית, חותכים אורך של 25 ס"מ של חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי.

לאחר מכן, באמצעות אזמל, מפשיטים כחמישה מילימטרים של ציפוי פרפלואורואלקוקסי מקצה אחד, נזהרים שלא לחתוך לחוט הפלטינה. כעת, הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לתוך פין מחבר זכר מצופה זהב, מילימטר אחד. לאחר מכן, באמצעות צבתות אף-מחט, צמצם את שיני הפין המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה והלחים את חוט הפלטינה לפין המחבר המצופה זהב.

לאחר מכן, להכין את תמיסת הדופמין על ידי הוספת 50 מיליגרם של דופמין הידרוכלוריד ב 50 מיליליטרים של 10 מילימולרי PBS עם pH6 ולערבב על ידי ערבוב על ידי ערבוב. לאחר המסה מוחלטת של הדופמין, מניחים את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל את ה-PBS הטרי עם תוספת דופמין. חברו את אלקטרודת הדיסק הכסופה כלוריד לתעלת הקרקע בשלב הראש.

לאחר מכן, הניחו את הדיסק הכסוף כלוריד בכלי המכיל PBS ותיל פלטינה המכילים PBS ותיל פלטינה בתוספת דופמין. לפני שתמשיך הלאה, חבר חוט לערוצי הייחוס של שלב הראש. פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים והגדר פרוטוקול פוטנציאל פקודת תצהיר אלקטרוני של sawtooth על-ידי הגדרת פוטנציאל ההתחלה במינוס 0.6 וולט, פוטנציאל הקצה ל- 0.65 וולט, קצב הסריקה ב- 0.04 וולט לשנייה ומשך התצהיר ל- 420 שניות.

לאחר השלמת תצהיר הפולי-דופמין, הסר את כדור הקרקע הכסוף כלוריד ואת קצה חוט הפלטינה מהכלי. מקם את קצה החוט במיקרו-צינור המכיל PBS של pH 7.4 למשך שתיים עד חמש דקות וודא שקצה החוט אינו יוצר קשר עם הצדדים או התחתית של המיקרו-צינור. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדן על ידי שילוב הנוגדן המעניין עם ה-PBS של pH 7.4 ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים.

לאחר מכן, השרו את קצה הפולי-דופמין המופקד של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת הנוגדנים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא נח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור. מכניסים את הקצה התפקודי של האימונו-פרוב הקיבולי לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן פעולה זו עלולה לפגוע בקצה החושי של הגשושית. לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הבדיקה האימונו-פרוביבית הקיבולית, ועבור פרוטוקול המתח, קבע את פוטנציאל הצעד החיובי ל-110 מיליוולט, פוטנציאל צעד שלילי למינוס חמישה מיליוולטים, משך צעד של 20 אלפיות השנייה ומשך הרכישה ל-600 שניות.

לאחר מכן, צור את התמיסה הפפטידית המעניינת באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב הסופרפוסאט. הגדר מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את ה-superfusate בין TBS ל-TBS עם תוספת פפטידים. השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של TBS והגדר את פרוטוקול איסוף הנתונים של חישת הפפטידים על-ידי הגדרת משך הרכישה ל-360 שניות.

לפני תצהיר הפולי-דופמין, משחילים את הקצה החשוף של אלקטרודת חוט הפלטינה דרך מחט היפודרמית בעלת 22 מדים, ומשאירים כשני מילימטרים מעבר לקצה המחט. השתמשו במלקחיים וכופפו בעדינות את קצה אלקטרודת חוט הפלטינה כדי ליצור מוט שתלוי מקצה המחט ההיפודרמית. משכו בעדינות את המחט מקצה התיל, והשאירו מספיק חוט כדי למקם בכלי מבלי שהמחט תיצור קשר עם הנוזל והמשיכו עם תצהיר דופמין כפי שהוכח קודם לכן.

כעת, שטפו את קצה הבדיקה עם PBS והניחו אותו בתמיסת הנוגדנים. לאחר מכן, הסר בעדינות את הקצה הפונקציונלי מה- PBS. הזיזו את המחט ההיפודרמית אל האימונו-פרוב הקיבולי של התיל והשתילו אותה בעדינות באזור העניין לפני חיבור סיכת מחבר הזהב לשלב הראש.

לאחר ההשתלה, למשוך את המחט ההיפודרמית, ולהשאיר את האלקטרודה במקומה. צעד חיובי בפוטנציאל הפיקוד מודד את זרם ההזרקה הנדרש להדק את מתח הגשושית ומאפשר מדידה של הזרם הקיבולי. שלב פוטנציאל הפיקוד השלילי מנקה את הפפטיד המאוגד מהנוגדן באמצעות דחייה אלקטרוסטטית.

צורת הגל של פקודת פונקציית הצעד תיארה את הגילוי והכימות האיטרטיביים של הפפטיד שנפתרו בזמן. העקבה התחתונה ייצגה את פוטנציאל הפקודה ואת הזרם שנוצר כתוצאה מכך תחת חליטת העל של הגשושית ב- TBS. החיסון הקיבולי המשוקלל הראה דעיכה ראשונית קטנה יותר ובסיס יציב במשך שש דקות.

הזרימה של נוירופפטיד Y לתוך תא הזרימה הגבירה את הזרמים הקיבוליים מעל קו הבסיס. זרמי אימונו-פרופ קיבוליים שנמדדו באמצעות בדיקה תפקודית של נוגדן נוירופפטיד Y הראו אות תלוי ריכוז הרגיש לנוירופפטיד נמוך פיקומולי Y לצורך כיול, נמדדה עקומה סטנדרטית עבור כל הריכוזים שנבדקו. הגירוי של גנגליון הסטלטים הדו-צדדי הראה נוירופפטיד Y גבוה כאשר הוא מתווה יחד עם הזרמים הקיבוליים של הבקרה השלילית.

שחרור נוראדרנלין שנמדד תחת גירוי סטלטי הראה שחרור סינכרוני עם נוירופפטיד Y, התואם תגובה סימפתטית מעוררת. הפיתוח של טכניקות אלה עשוי לספק קריאות תוך ניתוחיות של מודולטורים מרכזיים של פעילות לבבית, ובכך לספק הדרכה טיפולית או התערבותית מהירה פוטנציאלית. הטכניקה כפי שהוצגה כאן היא ספציפית לפריסה קרדיווסקולרית, אולם הטכניקה עצמה מתאימה למסגרות פיזיולוגיות אחרות, כגון שתן, שרירי שלד, כליות, רקמת שומן וכו '.