Name: מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למד מדידה בזמן אמת של רמות נוירופפטידים בלב חזירי באמצעות ביוסנסור אימונופרוב קיבולי. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמעט מיידי בנבדקים בודדים ובמיקומים ספציפיים לחקר מערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר אולו אג'יג'ולה (מרכז UCLA להפרעות קצב לב) על תמיכת מומחים בניסויי in vivo . עבודה זו נתמכה על ידי NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (מהדורה 8, 2011). חזירי יורקשייר זכרים בוגרים במשקל של כ-75 ק"ג שימשו למחקרי in vivo 10.
1. ייצור אימונו-פרובינציה קיבולית ותפקודיזציה
<ol><li>חותכים חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי (PFA) באורך 25 ס"מ (PFA) (ראו טבלת חומרים) ומפשיטים כ-5 מ"מ של ציפוי PFA מקצה אחד באמצעות אזמל, תוך זהירות שלא לחתוך לחוט הפלטינה.</li>
	<li>הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לתוך פין מחבר זכר 1 מ"מ מצופה זהב וצמצם את שיני פין המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה באמצעות צבתות אף מחט (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הלחימו את חוט הפלטינה לפין המחבר המצופה זהב. היזהר לא להשתמש בכמות מוגזמת של הלחמה.</li>
	<li>הכינו תמיסת דופמין על ידי המסת 50 מ"ג דופמין הידרוכלוריד ב-50 מ"ל של 10 מ"מ מלוחים עם מאגר פוספט (PBS, pH 6.0) על ידי ערבוב.</li>
	<li>לאחר שהדופמין מומס לחלוטין, הניחו את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל את ה-PBS הטרי עם תוספת דופמין. חבר סיכת מחבר זהב לערוץ של הבמה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>חברו את אלקטרודת דיסק AgCl (אלקטרודת הארקה, ראו טבלת חומרים) לתעלת הקרקע בראש הבמה. הניחו את דיסק ה-AgCl בכלי המכיל PBS ותיל פלטינה עם תוסף דופמין; היזהרו רק כדי להטביע את אלקטרודת הדיסק ולא כל אורך של החוט או ההלחמה. חברו חוט תיל לערוצי הייחוס של הבמה לפני ההמשך.</li>
	<li>פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). הכן פרוטוקול פוטנציאל פקודה של אלקטרודת מסור עם הפרמטרים הבאים: התחל פוטנציאל = −0.6 V; פוטנציאל קצה = +0.65 V; קצב סריקה = 0.04 V∙s-1; משך התצהיר = 420 שניות. התחל את פרוטוקול התצהיר polydopamine, להבטיח כי כל החוטים מחוברים כראוי.</li>
	<li>לאחר השלמת תצהיר הפולידופאמין, הסר את גלולת הקרקע AgCl ואת קצה חוט הפלטינה מהכלי, תוך זהירות שלא להפריע לקצה אלקטרודת חוט הפלטינה. מכניסים את קצה החוט למיקרו-צינור המכיל PBS (pH 7.4) למשך 2-5 דקות בזמן הכנת תמיסת הנוגדן; ודא שקצה החוט אינו יוצר קשר עם הצדדים או בתחתית המיקרו-טיוב. הערה: תמיסת נוגדנים יכולה להיעשות במהלך תצהיר פולידופאמין; עם זאת, אין לדלג על העברת חוט הפלטינה מכלי המכיל דופמין למיקרו-צינור של PBS לאחר תצהיר פולידופאמין.</li>
	<li>הכן את פתרון הנוגדנים. שלבו את הנוגדן המעניין עם PBS (pH 7.4) ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים (למשל, מיקרו-צינורית). הערה: הנוגדן החד-שבטי נגד NPY (ראה טבלת החומרים) שבו נעשה שימוש כאן הוצמד ל-1 מ"ג/מ"ל; הכנה לדוגמה של נוגדנים כאן תהיה 4 μL של נוגדנים ל-76 μL של PBS.</li>
	<li>משרים את הקצה המופקע מפולידופאמין של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת נוגדנים למשך 2 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, ושוב מבטיחים שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא נח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור. הערה: יישום לאחרונה של טכניקה זו העדיף להשתמש באלקטרודת חוט הפלטינה מיד לאחר שלב זה במקום אחסון רטוב או יבש לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>לאחר השריית תמיסת הנוגדנים, יש לשטוף לזמן קצר את קצה החיסון הקיבולי החדש (CI probe) ב-PBS (pH 7.4). הגשושית מוכנה כעת לשימוש.</li>
</ol>2. מערך ניסויי לזיהוי ומדידת מבחנה של פפטיד
<ol><li>הכניסו את הקצה התפקודי של הגשושית CI לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן פעולה זו עלולה לפגוע בקצה החושי של הגשושית. הערה: תא הזרימה נוצר על ידי מזיגת אלסטומר סיליקון (ראו טבלת חומרים) לתוך צלחת תרבית של 35 מ"מ עם מילוי חלל ביצתי מוארך במרכז המנה. לאחר ההתקשות, צורת הביצית מוסרת מהאלסטומר. לאחר מכן, התא מועשר בתמיסת מלח עם חציצה משולשת (TBS) ומאפשר קצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. ודא שהזרימה והיציאה שומרות על רמת הנוזלים בתא כך שלא נצפתה פעולת גאות של הסופרפוזט. הזרימה חייבת להישאר במקומה כל עוד הגשושית CI נמצאת בשימוש.</li>
	<li>לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הגשושית CI. הגדר את פרוטוקול מתח הפקודה הבא: פוטנציאל צעד חיובי = +100 mV; פוטנציאל צעד שלילי = −5 mV; משך צעד = 20 אלפיות השנייה; משך הרכישה = 600 שניות. הערה: חשוב לאפשר את שיווי המשקל של הגשושית במהלך השלב הראשוני של פוטנציאל הפיקוד על מחזור לפני איסוף הנתונים.</li>
	<li>צור תמיסה של הפפטיד המעניין באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב הסופרפוסאט. הגדר מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את הסופר-פוסאט בין TBS ל-TBS עם תוספת פפטידים מבלי להכניס בועות למערכת הצינורות או לתא הזרימה. הערה: פפטיד NPY חזירי סינתטי (ראה טבלת חומרים) שימש במחקר הנוכחי.</li>
	<li>הגדר את פרוטוקול איסוף הנתונים של חישת הפפטידים באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של TBS (ראה שלב 2.2.). הערה: ביישום זה, משך הזמן של כל בדיקה ניסיונית היה 360 s (120 s TBS, 120 s TBS בתוספת פפטיד, 120 s TBS).</li>
</ol>3. התאמת הגשושית CI לשימוש in vivo
<ol><li>לפני שקיעת פולידופאמין (שלב 1.7.), משחילים את הקצה החשוף של אלקטרודת חוט הפלטינה דרך מחט היפודרמית של 22 גרם, ומשאירים כ-2 מ"מ מעבר לקצה המחט. באמצעות מלקחיים, כופפו בעדינות את קצה אלקטרודת חוט הפלטינה, ויצרו "ברב" שתלוי מקצה המחט ההיפודרמית.<ol>
<li>משכו בעדינות את המחט מקצה התיל, והשאירו מספיק חוט למקם בכלי מבלי שהמחט תיצור קשר עם הנוזל. המשך עם שלבים 1.4.-1.11. הערה: בהתאם להגדרת in vivo , ייתכן שיהיה צורך לחתוך אורך של חוט פלטינה ארוך מ -25 ס"מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפני חיבור הגשושית CI לראש הבמה, ודא שכל מערך החשמל מקורקע כראוי. אם לא תעשו זאת, הדבר עלול לגרום להפרעה חשמלית לא רצויה במהלך הקלטות הניסוי.</li>
	<li>להרדים את בעלי החיים בעקבות דו"ח10 שפורסם בעבר.</li>
	<li>בצע ניתוח כדי לחשוף את אזור העניין. הערה: עצם החזה החציונית בוצעה במחקר הנוכחי כדי לחשוף את הלב. אנא ראו Kluge et al.10 לקבלת פרטים על ניתוחים בבעלי חיים.</li>
	<li>הסר בעדינות את הקצה המתפקד משטיפת ה- PBS (שלב 1.11.), העבר את המחט ההידודרמית אל בוחן ה- C.I. התוחם והשתיל אותה בעדינות באזור העניין לפני חיבור פין מחבר הזהב לבמה הראשית. לאחר ההשתלה, למשוך את המחט ההיפודרמית, ולהשאיר את האלקטרודה במקומה. הערה: עבור המחקר הנוכחי, הגשושית הונחה בדופן האמצעית-צידית של שריר הלב בחדר השמאלי10.</li>
	<li>לאחר הבטחת התקנה חשמלית נכונה, המשך עם פרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים וניסיוניים (שלב 2.2. ושלב 2.4.).</li>
	<li>עם השלמת הניסויים, המתים את החיה על פי טכניקות שאושרו על ידי המוסד. הערה: במחקר הנוכחי, בעלי החיים מורדמים תחת הרדמה עמוקה באמצעות אינדוקציה של פרפור חדרים10.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Biomarkers+for+the+prevention%2C+assessment%2C+and+management+of+heart+failure%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li>
<li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+responses+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li>
<li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li>
<li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648(2019).</li>
<li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519(2020).</li>
<li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs%3A+comparison+of+VIP%2C+PHI%2C+NPY%2C+CGRP%2C+and+NT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li>
<li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li>
<li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitive+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li>
<li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedimetric+immunosensors-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li>
<li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li>
<li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li>
<li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+recombinant+Ca%28v%293.2%2C+T-type%2C+Ca%282%2B%29+channel+currents+by+CaMKIIgamma%28C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li>
<li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li>
<li>Chow, R. H., von Rüden, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+RH+%22Single-Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single-Channel Recording, Second Edition</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile%2C+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63(2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים, כספיים או אחרים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור ובדיקה של אימונו-פרוב קיבולי (CI probe) המסוגל לזהות ולמדוד סמנים ביולוגיים בעלי עניין הן במבחנה והן בסביבה in vivo . הגילוי מושג על ידי לכידת הסמן הביולוגי בקצה האלקטרודה. אירוע הלכידה משנה את הצומת הקיבולי בין אימונופרוב קיבולי של חוט פלטינה לבין סביבת הנוזל המוליך שמסביב, הנמדדת כשינוי בזרם המטען בתגובה לשינוי פוטנציאלי בגשושית. כמו כן הוצג פרוטוקול רכישה חשמלית ייחודי המאפשר "איפוס" של האימונו-פרוב בין מחזורי הגילוי על ידי דחייה אלקטרוסטטית של הסמן הביולוגי הלכוד מקצה הגש...

מספר שיטות כימיות לאיתור וכימות סמנים ביולוגיים משמשות באופן שגרתי הן בכימיה של חלבונים והן באבחון קליני, במיוחד באבחנות סרטן ובהערכת התקדמות מחלות לב וכלי דם. נכון לעכשיו, שיטות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) וספקטרומטריית מסה מסתמכות על איסוף דגימות מתא כלי הדם 1,2,3 על ידי משיכת נוזלים בתפזורת או מהתא הבין-כוכבי על ידי מיקרודיאליזה. מיקרודיאליזה משתמשת בצינור ממברנה חצי-חדיר באורך ידוע הממוקם באזור עניין. נוזל האיסוף מחלחל דרך הצינור במשך מספר דקות4 כדי לאסוף את הדגימה לניתוח5, ובכך מגביל את הרזולוציה הטמפורלית. באופן זה, דגימות שנאספו מספקות רק ערך ממוצע לאורך זמן של המיקרו-סביבה המקומית ומוגבלות על ידי קצב הזלוף והאיסוף של נפח דגימה מספיק. יתר על כן, שיטות אלה דורשות איגום של נתונים ניסיוניים וממוצע אותות; לכן, הם עשויים שלא לתת דין וחשבון על השונות בין הנושאים. חשוב לציין כי הזמן שבין איסוף הדגימות לבין הניתוח הלא מקוון שלאחר מכן מונע התערבות קלינית וטיפולים מיידיים.
בפרוטוקול הנוכחי, מתואר השימוש בביו-סנסור אימונופרוב קיבולי (CI probe) לזיהוי חשמלי שנפתר בזמן של פפטידים ביו-אקטיביים ספציפיים. נוירופפטיד Y (NPY), המשתחרר מתאי עצב סימפתטיים פוסט-גנגליוניים המעצימים את כלי הדם, אנדוקרדיום, קרדיומיוציטים וגרעינים תוך-לבביים, הוא משדר פפטידים נוירומודולטוריים מרכזי במערכת הלב וכלי הדם 6,7,8,9. השיטה המוצגת כאן נועדה למדוד NPY, וההיתכנות הניסויית מודגמת במודל לב חזירי. עם זאת, גישה זו חלה על כל פפטיד ביו-אקטיבי שעבורו נוגדן סלקטיבי זמין10. שיטה זו מסתמכת על הצומת הקיבולי בין בדיקה של חוט פלטינה לבין הנוזל המוליך בקצה המתפקד11,12. ביישום זה, האינטראקציה הייתה מתווכת באמצעות נוגדן נגד נוירופפטיד המטרה (NPY), שהיה קשור לקצה האלקטרודה, והתממשק לסביבת הנוזל המוליך. פונקציונליזציה זו הושגה באמצעות אלקטרודפוזיציה של פולידופאמין תגובתי על קצה הגשושית חוט הפלטינה 10,13.
כאשר הגשושית המתפקדת על ידי נוגדנים ממוקמת באזור עניין in vivo, שחרור NPY אנדוגני מעורר מוביל לקשירת נוגדנים לוכדים על קצה הגשושית, והנוזל המוליך במשטח האלקטרודה נעקר על ידי חלבון NPY. שינוי מקומי בסביבה החשמלית גורם לתזוזה של נוזל דיאלקטרי בעל ניידות גבוהה עם מולקולה חסרת תנועה וטעונה סטטית. זה משנה את ממשק האלקטרודה-זורם, ובכך את הקיבוליות שלו, הנמדדת כשינוי בזרם המטען בתגובה לפוטנציאל פקודה של פונקציית צעד. פוטנציאל "איפוס" שלילי מופעל מיד לאחר כל מחזור מדידה בודד כדי להדוף NPY מאוגד מהנוגדן באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית, ובכך לנקות את אתרי הקישור של הנוגדנים לסבבים הבאים של מדידה10. זה למעשה מאפשר מדידה של NPY באופן שנפתר בזמן. טכניקת CI הייחודית מתגברת על המגבלות של השיטות האימונוכימיות מבוססות המיקרודיאליזה שתוארו לעיל כדי למדוד רמות סמנים ביולוגיים דינמיים מניסוי יחיד ללא אגום נתונים או ממוצע איתותים על פני מספר ניסויים9, ומספקת נתונים כמעט בזמן אמת. יתר על כן, היכולת להתאים שיטה זו לכל סמן ביולוגי בעל עניין שעבורו קיים נוגדן מתאים בקנה מידה פתור ומלוקלי מספקת התקדמות טכנית משמעותית במדידה אימונוכימית להערכת התקדמות המחלה והכוונת התערבויות טיפוליות.
התוכנה לאיסוף וניתוח נתונים נכתבה בהתאמה אישית ב- IGOR Pro (סביבת תוכנה אינטראקטיבית לחלוטין). מערכת ממיר אנלוגית לדיגיטלית (A/D) הוציאה מתח פקודה תחת בקרת מחשב ורכשה נתונים ממגבר מותאם אישית. המגבר היה בעל תכונות ייחודיות מסוימות. אלה כללו נגד משוב (ניתן להחלפה) עבור כל אחד מארבעת ערוצי הרכישה, המאפשר בחירה במעגלי מהדקי מתח משוב של 1 MOhm או 10 MOhm כדי לשלב את השונות של האלקטרודה. יחידת במה עם ראש יחיד ומעגל קרקע/ייחוס הדדי לכל ארבעת ערוצי הרכישה נבנתה גם היא כדי למקם את המכשיר קרוב לחזה במודול פיזי יחיד. הגדרת נגד משוב 1 MOhm שימשה לאיסוף כל הנתונים המדווחים.
הגדרות המסנן והרווח הועתקו מהמגבר ותועדו בתוך קובץ הנתונים. הנתונים סוננו ב-1 קילוהרץ באמצעות מסנן בסל אנלוגי בן 2 קטבים שעבר דיגיטציה ב-10 קילוהרץ. ההבדל בפוטנציאל בין הגשושית לתמיסה המוליכה הסובבת יוצר שכבה קיבולית של הלמהולץ בקצה הגשושית. קשירת ליגנד לנוגדן בקצה הגשושית גורמת לשינוי במטען המקומי, ובכך לשינוי בקיבוליות הלמהולץ. שינוי זה ברכיב הקיבולי של המעגל גורם לשינוי בגודל המטען המוזרק הנדרש כדי להביא את הגשושית לפוטנציאל בפרוטוקול המתח של פונקציית הצעד. לפיכך, קשירת ליגנד מסוים לבדיקה הפונקציונלית גורמת לשינוי במדידת קיבוליות האלקטרודה כשינוי בזרם הקיבולי הגבוה ביותר.

<table><tbody><tr><td>אלקטרודה דיסק AgCl</td><td>וורנר אינסטרומנטס (הוליסטון, מסצ'וסטס)</td><td>64-1307</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי אנטי-NPY</td><td>Abcam, (קיימברידג', מסצ'וסטס)</td><td>ab112473</td><td></td></tr><tr><td>מגבר רב-ערוצי מותאם אישית/ 1 M&Omega; נגד משוב רב-ערוצי</td><td>NPI Electronic, (Tamm, גרמניה)</td><td>NA</td><td>מבוסס על מגבר רב-ערוצי NPI VA-10M</td></tr><tr><td>Dopamine HCl</td><td>Sigma Aldrich (St. לואיס, מיזורי)</td> <td>H8502-10G</td><td></td></tr><tr><td>פין מחבר זכר מצופה זהב</td><td>AMP-TE חיבוריות (Amplimite)</td> <td>6-66506-1</td><td></td></tr><tr><td>HEKA LIH 8+8 התקן אנלוגי לדיגיטלי/דיגיטלי לאנלוגי</td><td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td><td></td>תוכנת רכישת נתונים NA <td></td></tr><tr><td>Igor Pro, v. 7.08</td><td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td><td></td><td>פוטנציאל פיקוד מניע תוכנה ורכישת נתונים נכתבו בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>Masterflex L/S משאבה פריסטלטית דיגיטלית סטנדרטית</td><td>קול פאלמר, (ורנון הילס, אילינוי)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חוט פלטינה מצופה PFA</td><td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td> <td>773000</td><td>קוטר חשוף 0.005 אינץ', קוטר מצופה 0.008 אינץ'</td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון</td><td>World Precision Instruments (סרסוטה, פלורידה)</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד NPY חזיר סינטטי</td><td>Bachem (טורנס, קליפורניה)</td><td></td><td></td>4011654</tr><tr><td>פפטיד NPY חזיר סינתטי</td><td>Bachem (טורנס, קליפורניה)4011654</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת in vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

היכולת למדוד סמנים ביולוגיים in vivo הרלוונטיים להערכת התקדמות המחלה מעניינת מאוד את הקהילות המדעיות והרפואיות. קבלת הרזולוציה של התוצאות המתקבלות מהשיטות הנוכחיות למדידת סמנים ביולוגיים מסוימים יכולה להימשך מספר ימים או שבועות, מכיוון שהם יכולים להיות מוגבלים ברזולוציה הן מבחינה מרחבית והן באופן זמני (למשל, מיקרודיאליזה של תאי נוזלים של נוזל אינטרסטיציאלי של נוזל אינטרסטיציאלי שנותחה על ידי בדיקה חיסונית המקושרת לאנזים [ELISA], כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [HPLC], או ספקטרומטריית מסה); לפיכך, ההנחיה שלהם לאבחון וטיפול בזמן מופרעת. במחקר הנוכחי מדווחת טכניקה ייחודית לאיתור ומדידה של משדרי פפטידים in vivo באמצעות שימוש בביוסנסור אימונו-פרובי קיבולי (CI probe). פרוטוקול הייצור והאפיון החוץ גופי של בדיקות אלה מתוארים. מדידות של נוירופפטיד Y (NPY) מעורר גירוי סימפתטי משחרר in vivo מסופקות. שחרור NPY מתואם לשחרור אוהד של נוראדרנלין לעיון. הנתונים מדגימים גישה למדידה מהירה ומקומית של נוירופפטידים in vivo. יישומים עתידיים כוללים הערכה תוך ניתוחית בזמן אמת של התקדמות המחלה ופריסה זעיר פולשנית מבוססת צנתרים של בדיקות אלה.

ייצור ואפיון אלקטרודות אימונו-פרוב קיבולי גמיש (בדיקות CI) יוצר, ותמונה מייצגת מתוארת באיור 1A. פוטנציאל האלקטרודה נקבע על ידי מעגל מהדק מתח מבוקר מחשב (איור 1B), והאלקטרודה הייתה שקועה בתמיסת פולידופאמין המיוצרת ב-PBS. פולידופאמין הוצמד לאלקטרודפוזיט על קצה האלקטרודה המוליכה13 לצורך פונקציונליזציה. פוטנציאל הפיקוד הניע את מתח הגשושית, והזרקת זרם ההידוק נמדדה. זרם ההידוק שנמדד במהלך מחזור יחיד של תצהיר פולידופאמין מוצג...

שיטות אימונוכימיות מבוססות למדידת משדרי פפטידים in vivo מסתמכות על מיקרודיאליזה או על משיכת נוזלים בתפזורת כדי לקבל את הדגימה לניתוח לא מקוון. עם זאת, אלה סובלים ממגבלות מרחביות-טמפורליות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור והיישום של ביוסנסור אימונופרוב קיבולי המתגבר על מגבלות הטכניקות הקיימות.

מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

זו הפעם הראשונה שפותחה שיטה למדידת רמות המשדר הפפטידי in vivo. אנו יכולים למדוד את רמות המשדר הפפטידי בנבדקים בודדים ובמיקומים בדידים באמצעות ניתוח כמעט בזמן אמת. ראשית, חותכים אורך של 25 ס"מ של חוט פלטינה מצופה פרפלואורואלקוקסי.לאחר מכן, באמצעות אזמל, מפשיטים כחמישה מילימטרים של ציפוי פרפלואורואלקוקסי מקצה אחד, נזהרים שלא לחתוך לחוט הפלטינה. כעת, הכנס את הקצה המופשט של חוט הפלטינה לתוך פין מחבר זכר מצופה זהב, מילימטר אחד. לאחר מכן, באמצעות צבתות אף-מחט, צמצם את שיני הפין המחבר סביב הקצה המופשט של חוט הפלטינה והלחים את חוט הפלטינה לפין המחבר המצופה זהב.לאחר מכן, להכין את תמיסת הדופמין על ידי הוספת 50 מיליגרם של דופמין הידרוכלוריד ב 50 מיליליטרים של 10 מילימולרי PBS עם pH6 ולערבב על ידי ערבוב על ידי ערבוב. לאחר המסה מוחלטת של הדופמין, מניחים את קצה חוט הפלטינה בכלי המכיל את ה-PBS הטרי עם תוספת דופמין. חברו את אלקטרודת הדיסק הכסופה כלוריד לתעלת הקרקע בשלב הראש.לאחר מכן, הניחו את הדיסק הכסוף כלוריד בכלי המכיל PBS ותיל פלטינה המכילים PBS ותיל פלטינה בתוספת דופמין. לפני שתמשיך הלאה, חבר חוט לערוצי הייחוס של שלב הראש. פתח את התוכנה האינטראקטיבית לרכישת נתונים והגדר פרוטוקול פוטנציאל פקודת תצהיר אלקטרוני של sawtooth על-ידי הגדרת פוטנציאל ההתחלה במינוס 0.6 וולט, פוטנציאל הקצה ל- 0.65 וולט, קצב הסריקה ב- 0.04 וולט לשנייה ומשך התצהיר ל- 420 שניות.לאחר השלמת תצהיר הפולי-דופמין, הסר את כדור הקרקע הכסוף כלוריד ואת קצה חוט הפלטינה מהכלי. מקם את קצה החוט במיקרו-צינור המכיל PBS של pH 7.4 למשך שתיים עד חמש דקות וודא שקצה החוט אינו יוצר קשר עם הצדדים או התחתית של המיקרו-צינור. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הנוגדן על ידי שילוב הנוגדן המעניין עם ה-PBS של pH 7.4 ביחס של 1:20 בכלי בגודל מתאים.לאחר מכן, השרו את קצה הפולי-דופמין המופקד של אלקטרודת הפלטינה בתמיסת הנוגדנים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מה שמבטיח שקצה חוט הפלטינה תלוי בתמיסה ולא נח על המשטח הפנימי של המיקרו-צינור. מכניסים את הקצה התפקודי של האימונו-פרוב הקיבולי לתא הזרימה, תוך הקפדה שלא להפריע לקצה האלקטרודה בשום צורה, שכן פעולה זו עלולה לפגוע בקצה החושי של הגשושית. לפני הבדיקה הניסיונית הראשונה, בצע ריצה סטנדרטית של TBS כדי להתנות את הבדיקה האימונו-פרוביבית הקיבולית, ועבור פרוטוקול המתח, קבע את פוטנציאל הצעד החיובי ל-110 מיליוולט, פוטנציאל צעד שלילי למינוס חמישה מיליוולטים, משך צעד של 20 אלפיות השנייה ומשך הרכישה ל-600 שניות.לאחר מכן, צור את התמיסה הפפטידית המעניינת באמצעות אותו TBS כדי לשמור על הרכב הסופרפוסאט. הגדר מערכת סעפת שבה ניתן להחליף את ה-superfusate בין TBS ל-TBS עם תוספת פפטידים. השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של TBS והגדר את פרוטוקול איסוף הנתונים של חישת הפפטידים על-ידי הגדרת משך הרכישה ל-360 שניות.לפני תצהיר הפולי-דופמין, משחילים את הקצה החשוף של אלקטרודת חוט הפלטינה דרך מחט היפודרמית בעלת 22 מדים, ומשאירים כשני מילימטרים מעבר לקצה המחט. השתמשו במלקחיים וכופפו בעדינות את קצה אלקטרודת חוט הפלטינה כדי ליצור מוט שתלוי מקצה המחט ההיפודרמית. משכו בעדינות את המחט מקצה התיל, והשאירו מספיק חוט כדי למקם בכלי מבלי שהמחט תיצור קשר עם הנוזל והמשיכו עם תצהיר דופמין כפי שהוכח קודם לכן.כעת, שטפו את קצה הבדיקה עם PBS והניחו אותו בתמיסת הנוגדנים. לאחר מכן, הסר בעדינות את הקצה הפונקציונלי מה- PBS. הזיזו את המחט ההיפודרמית אל האימונו-פרוב הקיבולי של התיל והשתילו אותה בעדינות באזור העניין לפני חיבור סיכת מחבר הזהב לשלב הראש.לאחר ההשתלה, למשוך את המחט ההיפודרמית, ולהשאיר את האלקטרודה במקומה. צעד חיובי בפוטנציאל הפיקוד מודד את זרם ההזרקה הנדרש להדק את מתח הגשושית ומאפשר מדידה של הזרם הקיבולי. שלב פוטנציאל הפיקוד השלילי מנקה את הפפטיד המאוגד מהנוגדן באמצעות דחייה אלקטרוסטטית.צורת הגל של פקודת פונקציית הצעד תיארה את הגילוי והכימות האיטרטיביים של הפפטיד שנפתרו בזמן. העקבה התחתונה ייצגה את פוטנציאל הפקודה ואת הזרם שנוצר כתוצאה מכך תחת חליטת העל של הגשושית ב- TBS. החיסון הקיבולי המשוקלל הראה דעיכה ראשונית קטנה יותר ובסיס יציב במשך שש דקות.הזרימה של נוירופפטיד Y לתוך תא הזרימה הגבירה את הזרמים הקיבוליים מעל קו הבסיס. זרמי אימונו-פרופ קיבוליים שנמדדו באמצעות בדיקה תפקודית של נוגדן נוירופפטיד Y הראו אות תלוי ריכוז הרגיש לנוירופפטיד נמוך פיקומולי Y לצורך כיול, נמדדה עקומה סטנדרטית עבור כל הריכוזים שנבדקו. הגירוי של גנגליון הסטלטים הדו-צדדי הראה נוירופפטיד Y גבוה כאשר הוא מתווה יחד עם הזרמים הקיבוליים של הבקרה השלילית.שחרור נוראדרנלין שנמדד תחת גירוי סטלטי הראה שחרור סינכרוני עם נוירופפטיד Y, התואם תגובה סימפתטית מעוררת. הפיתוח של טכניקות אלה עשוי לספק קריאות תוך ניתוחיות של מודולטורים מרכזיים של פעילות לבבית, ובכך לספק הדרכה טיפולית או התערבותית מהירה פוטנציאלית. הטכניקה כפי שהוצגה כאן היא ספציפית לפריסה קרדיווסקולרית, אולם הטכניקה עצמה מתאימה למסגרות פיזיולוגיות אחרות, כגון שתן, שרירי שלד, כליות, רקמת שומן וכו '.

time-resolved-vivo-measurement-neuropeptide-dynamics-capacitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי וכימות משדרי פפטיד באמצעות ביו-חיישן קיבולי של מערכת החיסון. האלקטרודה המתפקדת, המצופה בנוגדנים, מתקשרת עם פפטידים מעניינים, מה שמוביל לשינוי אות המאפשר מדידה וזיהוי מדויקים של פפטידים.

זיהוי ומדידה של פפטיד מטרה באמצעות חיישן ביולוגי קיבולי של אימונופרוב

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של האפנון של מערכת העצבים האוטונומית intracardiac, את ההערכה של השפעתה על בסיסי אלקטרופיזיולוגיה, arrhythmogenesis מחנה dynamics באמצעות התקנה Langendorff ex-vivo .

ההשפעה של נוירונים Intracardiac על הלב אלקטרופיזיולוגיה, Arrhythmogenesis במערכת Langendorff Vivo לשעבר

מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.

האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.

הקלטה של מערך Microelectrode של קצב הירי של צמת Sinoatrial כדי לזהות פגמים מהותיים בקצב הלב בעכברים

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל מבטיח במבחנה לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ומידול מחלות. כאן אנו מפרטים פרוטוקול למדידת התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה של hiPSC-CMs.

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

פרוטוקול זה מתאר ייצור חומרים מתקדם ושיטות לב חולדות ex vivo לממשק ביולוגי דו-כיווני אופטי וחשמלי, המאפשר גירוי לבבי מדויק, הקלטה ומידול אוטם למחקר ביו-אלקטרוניקה.

ממשקים חשמליים ואופטו-אלקטרוניים דו-כיווניים בלבבות חולדות ex vivo בריאים ואיסכמיים

למד מדידה בזמן אמת של רמות נוירופפטידים בלב חזירי באמצעות ביוסנסור אימונופרוב קיבולי. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמעט מיידי בנבדקים בודדים ובמיקומים ספציפיים לחקר מערכת העצבים.

מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

גלה סרטונים נוספים