Name: קביעת זיקה מחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: למדו לקבוע זיקה מחייבת של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים באמצעות ניסויי קשירת רוויה. שיטה זו מאפשרת אפיון ספציפי ללא הפרעה מנוגדנים לא מצומדים ליישומים בדימות גרעיני וטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל-3D Imaging על הייצור של [89Zr]Zr-oxalate ולד"ר שרי מורס מחברת Janssen Pharmaceuticals על אספקת נוגדנים.

הערה: עיין באיור 2 לקבלת ייצוג גרפי של הפרוטוקול.
<img alt="דיאגרמת ELISA, אינטראקציה בין אנטיגן לנוגדנים, ניתוח מיקרו-לוחות, שיפוע ריכוז גבוה עד נמוך." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: שרטוט של הפרוטוקול. תוויות שורות ועמודות מסומנות כמדריך להגדרת הלוח הניתן לשבירה של 96 בארות. הכריכה הצפויה מוצגת בדוגמה היטב עבור האנטיגן וה- BSA. החץ המעוקל מציין את ה-rAb שצפוי להישטף מבארות עם BSA בלבד. דמות זו נוצרה עם BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63927/63927fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
1. הכנת מאגר
<ol><li>הכן 50 מ"ל של חיץ אימוביליזציה (תמיסה מימית של 50 mM Na2CO3; pH = 9.0).<ol>
<li>שוקלים 191 מ"ג של NaHCO3 ו-23.9 מ"ג של Na2CO3 על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 40 מ"ל של 18 MΩ מים ומערבולת כדי להתמוסס. התאם את ה- pH ל- 9.0 במידת הצורך לפני שתביא את הנפח הכולל ל- 50 מ"ל עם 18 MΩ מים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו כ-200 מ"ל של מאגר כביסה (מי מלח עם חציית פוספט (PBS) המכילים 0.05% Tween-20) על ידי הוספת 200 מ"ל של PBS ולאחר מכן 100 μL של Tween-20 לבקבוק של 250 מ"ל.</li>
	<li>הכינו 50 מ"ל של מאגר קשירה (PBS המכיל 0.05% Tween-20, ו-0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA)).<ol>
<li>שוקלים 50 מ"ג BSA על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 50 מ"ל של PBS ולאחר מכן 25 μL של Tween-20 לצינור. מערבולת בעדינות כדי לערבב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן 50 מ"ל של מאגר חסימה (3% BSA ב- PBS).<ol>
<li>שוקלים 1.5 גרם BSA על נייר שקילה ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 50 מ"ל של PBS, ומערבולת בעדינות כדי לערבב. הערה: מומלץ לאחסן את כל המאגרים למשך שבוע עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקבלת התוצאות הטובות ביותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אימוביליזציה של אנטיגן
<ol><li>דיללו את האנטיגן במאגר האימוביליזציה כדי להגיע לריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>הוסף 100 μL לכל באר של אנטיגן לתחתית של 24 בארות של לוח 96 בארות, שטוח-תחתון, הניתן לשבירה במערך של 8 x 3 (עמודות 1-3 עבור שורות A-H). מכסים את הצלחת בנייר דבק. הערה: ודא כי פני השטח של צלחת הבאר טופלו כדי למקסם את הספיחה של תחומים הידרופוביים והידרופיליים מעורבים. צלחות אלה שטופלו מראש זמינות באופן מסחרי.</li>
	<li>אינקובציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללילה.</li>
	<li>למחרת, לשטוף את הצלחת 3x עם חיץ כביסה.<ol>
<li>הופכים את הצלחת במהירות בכיור כדי להשליך את הנוזל ומקישים על הצלחת על ערימת מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל העודף.</li>
		<li>באמצעות פיפטה רב-ערוצית, יש להוסיף 300 μL לכל באר של מאגר כביסה לבארות המכילות את האנטיגן. הסר את הנוזל כמתואר ב- 2.4.1. חזור על שלב הכביסה בסך הכל שלוש פעמים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חסימת אתרים לא ספציפיים עם BSA
<ol><li>באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 μL לכל באר של מאגר חוסם ל-24 הבארות מצופות האנטיגן ו-24 בארות ריקות של לוחית 96 הבארות (עמודות 1-6 לשורות A-H).</li>
	<li>דגירה של הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה.</li>
	<li>שטפו את הצלחת עם 300 μL לכל באר של מאגר כביסה בסך הכל שלוש פעמים. עיין בשלב 2.4 לתיאור מפורט של שטיפת הצלחת. 
	 </li>
</ol>4. דילולים סדרתיים והוספת תמיסת rAb
אזהרה: השלבים הבאים כוללים רדיואקטיביות. הצעדים צריכים להתבצע רק על ידי אלה עם הדרכת בטיחות קרינה. החוקרים צריכים להכפיל את הכפפה ולבצע צעדים עם סיכוך הולם.
<ol><li>לסנתז את rAb תחת חקירה באמצעות שיטת הבחירה. ה-rAbs ששימשו כדוגמה סונתזו כפי שתואר קודם לכן19. הערה: פרוטוקול זה מתמקד באפיון של rAb לאחר תיוג רדיו.</li>
	<li>בצע דילולים טוריים של 8 x 3x (המיועדים לשורות A-H בלוח) של rAb במאגר הכריכה. הערה: הריכוזים של הדילולים הסדרתיים ישתנו עבור כל rAb. הפרטים נדונים בסעיף הדיון. אם גורם הדילול משתנה, יש לחשב מחדש את הנפח הדרוש לכל דילול כדי להבטיח נפח מספיק עבור 1) קשירה של rAb בכל באר, 2) זריעת הדילול הבא, ו-3) ציטוט פתרון סטנדרטי rAb לספירת גמא כדי למדוד את הרדיואקטיביות של סך ה-rAb שנוסף לכל באר.<ol>
<li>חשב את נפח ה-rAb הדרוש כדי ליצור תמיסה של 1.2 מ"ל של הריכוז הראשון (תווית כ-A).</li>
		<li>הוסף 800 μL של מאגר קשירה לצינורות microcentrifuge המסומנים B, C, D, ... ל-ח'. הוסף 1.2 מ"ל פחות הנפח המחושב בשלב 4.2.1 של מאגר קשירה לצינור microcentrifuge שכותרתו A.</li>
		<li>הוסף את נפח ה- rAb המלאי המחושב ב- 4.2.1 לצינור A. מערבולת בעדינות כדי לערבב ולאחר מכן להסתובב למטה באמצעות microcentrifuge מיני כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.</li>
		<li>הוסף 400 μL מצינור A לצינור B. מערבולת כדי לערבב ולאחר מכן להסתובב למטה באמצעות מיני microcentrifuge. חזור על הוספה מ - B ל - C, C ל - D, ..., G ל- H.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף 100 μL לכל באר של כל דילול לשלוש בארות משותקות עם אנטיגן ושלוש בארות חסומות עם BSA בלבד. לדוגמה, הוסף דילול A לבארות A1-A3 (אנטיגן) ו- A4-A6 (BSA).</li>
	<li>הוסף 100 μL של כל דילול לצינורות microcentrifuge המסומנים A std - H std. שמור צינורות אלה כתקני rAb שיש לבדוק במונה הגמא.</li>
	<li>דגירה של הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.</li>
</ol>5. לשטוף צלחות ולבחון רדיואקטיביות
<ol><li>סימון צינורות microcentrifuge עבור כל באר (A1 עד A6, B1 עד B6 ... דרך H1-H6). השתמש בשני סמנים צבעוניים שונים כדי לקודד דגימות צבע אם תרצה - אחד עבור בארות מצופות אנטיגן ואחד עבור בארות עם BSA בלבד.</li>
	<li>שאפו את ה-rAb מכל באר באמצעות שאיפת ואקום.</li>
	<li>באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 μL של מאגר כביסה לכל באר. שאפו את מאגר הכביסה. חזור על הכביסה בסך הכל חמש פעמים.</li>
	<li>מפרקים את הבארות לצינורות המיקרו-צנטריפוג' המתאימים.</li>
	<li>ספרו את הרדיואקטיביות בצינורות באמצעות מונה גמא. ספרו תחילה את הצינורות עם האנטיגן (H1, H2, H3 עד A1, A2, A3), ולאחר מכן את אלה עם BSA בלבד (H4, H5, H6 עד A4, A5, A6). כדי למזער את ההפרעות, ספרו בנפרד את התקנים עבור כל דילול (H std עד A std) בזמן אחר.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
הערה: הקבצים המשלימים מכילים תבניות מתאימות של גיליון אלקטרוני וניתוח סטטיסטי לניתוח והתוויה של הנתונים.
<ol><li>בגיליון אלקטרוני, חשב את האיגוד הכולל, הספציפי והלא ספציפי עבור כל דגימה (ראה את תבנית הגיליון האלקטרוני המצורפת כקובץ משלים).<ol>
<li>חשב "פעילות מאוגדת" כספירת לדקה (CPM) של המדגם (המתקבלת ממונה הגמא) חלקי CPM של התקן המתאים. חשב את "% מאוגד" כפעילות מאוגדת פעמים 100.</li>
		<li>חישוב "סה"כ מאוגד, מול/L" על ידי הכפלת "% מאוגד" בריכוז (mol/L) של rAb שנוסף. חשב "סה"כ מאוגד, מול" על ידי הכפלת "סה"כ מאוגד, מול/ל'" עם נפח rAb שנוסף בליטרים (0.0001 ליטר).</li>
		<li>חשב "איגוד ספציפי, מול" על ידי חיסור "סה"כ מאוגד, מול" של דילול BSA מתוך דילול האנטיגן כך ש- A1 מזדווג עם A4, A2 עם A5, A3 עם A6, B1 עם B4 וכו '.</li>
		<li>חשב "איגוד לא ספציפי, מול" על ידי חיסור "קשירה ספציפית, מול" מתוך "סך כל הכריכה, מול" עבור כל באר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בתוכנת האנליזה הסטטיסטית, שרטט את הריכוז של rAb שנוסף (nmol/L) על ציר x לעומת קשירה (מול) על ציר ה-y. צור קבוצות נפרדות כדי להתוות במשולש את הכריכה הכוללת, את הכריכה הספציפית ואת הכריכה הלא ספציפית. בצע ניתוח התאמה לא ליניארי על-ידי בחירת הפרמטרים הבאים בתוכנה שבה נעשה שימוש (טבלת חומרים; ראה את תבנית הניתוח הסטטיסטי המצורף כקובץ משלים).<ol>
<li>בחר ניתוח חדש. תחת ניתוחי XY, בחר רגרסיה לא ליניארית (התאמה עקומה). ודא שכל הנתונים נבחרים תחת נתח אילו ערכות נתונים? ולאחר מכן בחר אישור.</li>
		<li>בכרטיסיה מודל , תחת איגוד - רוויה, בחר אתר אחד - איגוד ספציפי. בכרטיסיה ביטחון עצמי , בחר זהה התאמות 'מעורפלות'. השאר את כל הפרמטרים האחרים כברירת מחדל ובחר אישור. הערה: פעולה זו תחשב את KD ו- Bmax עבור הכריכה הכוללת, הספציפית והלא ספציפית. ה-KD של הכריכה הספציפית הוא KD ב-nmol/L של ה-rAb הקשור לאנטיגן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeled+Peptides+and+Antibodies+in+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).</li>
<li>Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImmunoPET+imaging+of+hematological+malignancies%3A+From+preclinical+promise+to+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">ImmunoPET imaging of hematological malignancies: From preclinical promise to clinical reality.</a> Drug Discovery Today. 27 (4), 1196-1203 (2022).</li>
<li>Lohrmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+a+Blood-Based+Biomarker%3A+Phase+I+assessment+of+the+high-affinity+CA19-9+antibody+HuMab-5B1+for+immuno-pet+imaging+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Retooling a Blood-Based Biomarker: Phase I assessment of the high-affinity CA19-9 antibody HuMab-5B1 for immuno-pet imaging of pancreatic cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7014-7023 (2019).</li>
<li>Pandit-Taskar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I%2FII+study+for+analytic+validation+of+89Zr-J591+immunoPET+as+a+molecular+imaging+agent+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A phase I/II study for analytic validation of 89Zr-J591 immunoPET as a molecular imaging agent for metastatic prostate cancer.</a> Clinical Cancer Research. 21 (23), 5277-5285 (2015).</li>
<li>Rousseau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+clinical+results+of+a+novel+immuno-PET+theranostic+probe+in+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initial clinical results of a novel immuno-PET theranostic probe in human epidermal growth factor receptor 2-negative breast cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (8), 1205-1211 (2020).</li>
<li>Moek, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostics+using+antibodies+and+antibody-related+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Theranostics using antibodies and antibody-related therapeutics.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (2), 83-90 (2017).</li>
<li>Chomet, M., van Dongen, G., Vugts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+radiolabeling+of+antibodies+with+common+and+uncommon+radiometals+for+preclinical+and+clinical+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">State of the art in radiolabeling of antibodies with common and uncommon radiometals for preclinical and clinical immuno-PET.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (7), 1315-1330 (2021).</li>
<li>Kumar, K., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiochemistry%2C+production+processes%2C+labeling+methods%2C+and+immunoPET+imaging+pharmaceuticals+of+Iodine-124%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Radiochemistry, production processes, labeling methods, and immunoPET imaging pharmaceuticals of Iodine-124.</a> Molecules. 26 (2), 414(2021).</li>
<li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+and+radiolabeling+of+monoclonal+antibodies+with+zirconium-89+for+PET+imaging+using+the+bifunctional+chelate+p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.</a> Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioconjugation+and+radiosynthesis+of+89Zr-DFO-labeled+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52521(2015).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImmunoPET%3A+concept%2C+design%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">ImmunoPET: concept, design, and applications.</a> Chemical Reviews. 120 (8), 3787-3851 (2020).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+immuno-PET+imaging+method+to+monitor+CD8-dependent+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An effective immuno-PET imaging method to monitor CD8-dependent responses to immunotherapy.</a> Cancer Research. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+strategy+for+the+synthesis+of+site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+multimodal+PET+and+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic strategy for the synthesis of site-specifically labeled immunoconjugates for multimodal PET and optical imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (12), 2123-2128 (2014).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Kristensen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specifically+labeled+89Zr-DFO-trastuzumab+improves+immuno-reactivity+and+tumor+uptake+for+immuno-PET+in+a+subcutaneous+HER2-positive+xenograft+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Site-specifically labeled 89Zr-DFO-trastuzumab improves immuno-reactivity and tumor uptake for immuno-PET in a subcutaneous HER2-positive xenograft mouse model.</a> Theranostics. 9 (15), 4409-4420 (2019).</li>
<li>Maguire, J. J., Kuc, R. E., Davenport, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaguire%2C+JJ+%22Radioligand+binding+assays+and+their+analysis.+in+Receptor+Binding+Techniques%22">Radioligand binding assays and their analysis. in Receptor Binding Techniques</a>. Davenport, A. P. , Humana Press. 31-77 (2012).</li>
<li>Davenport, A. P., Russell, F. D. Radioligand bindsing assays: theory and practice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavenport%2C+AP+%22Current+Directions+in+Radiopharmaceutical+Research+and+Development%22">Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development</a>. Mather, S. J. , Springer. Netherlands. 169-179 (1996).</li>
<li>Cavaliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%5B89Zr%5DZrDFO-amivantamab+bispecific+to+EGFR+and+c-MET+for+PET+imaging+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Development of [89Zr]ZrDFO-amivantamab bispecific to EGFR and c-MET for PET imaging of triple negative breast cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (2), 383-394 (2021).</li>
<li>Marquez, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%2889%29Zr-pertuzumab+in+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of (89)Zr-pertuzumab in breast cancer xenografts.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (11), 3988-3995 (2014).</li>
<li>Marquez-Nostra, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+PET+imaging+of+glycoprotein+non-metastatic+melanoma+B+in+triple+negative+breast+cancer%3A+feasibility+of+an+antibody-based+companion+diagnostic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Preclinical PET imaging of glycoprotein non-metastatic melanoma B in triple negative breast cancer: feasibility of an antibody-based companion diagnostic agent.</a> Oncotarget. 8 (61), 104303-104314 (2017).</li>
<li>Ghai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%5B%2889%29Zr%5DDFO-elotuzumab+for+immunoPET+imaging+of+CS1+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Development of [(89)Zr]DFO-elotuzumab for immunoPET imaging of CS1 in multiple myeloma.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (5), 1302-1311 (2021).</li>
<li>McKnight, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+EGFR+and+HER3+through+%2889%29Zr-labeled+MEHD7945A+%28Duligotuzumab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging EGFR and HER3 through (89)Zr-labeled MEHD7945A (Duligotuzumab).</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

כחלק מהפיתוח של rAbs, חשוב לוודא ש-rAb נקשר באופן ספציפי למטרה שלו עם זיקה מחייבת גבוהה. קביעת זיקה מחייבת יכולה ליידע אם האימונו-פעילות החיסונית של ה-rAb מושפעת משילוב רדיו באמצעות בדיקת הרדיוליגנד והרוויה באמצעות אנטיגן משותק. קביעת איגוד rAb ל- BSA יכולה לשמש לכימות קשירה לא ספציפית כדי למדוד קשירה ספציפית לאנטיגן המשותק בצורה מדויקת יותר. שיטה זו בודקת את האיגוד של ריכוזים שונים של rAb כדי ליצור עקומת קשירה רוויה כדי לחשב את KD ולקבוע זיקה מחייבת.
כדי לבצע בדיקה זו, יש צורך באנט...

לנוגדנים בעלי תווית רדיו (rAb) יש מגוון שימושים ברפואה. בעוד שרובם משמשים באונקולוגיה כחומרי הדמיה וטיפול, ישנם יישומי הדמיה לדלקת הקשורה לראומטולוגיה, קרדיולוגיה ונוירולוגיה1. הדמיה rAbs יש רגישות גבוהה לאיתור נגעים ויש לו פוטנציאל לסייע בבחירת המטופלים לטיפול 2,3,4,5. הם משמשים גם לטיפול בגלל הספציפיות שלהם עבור האנטיגנים שלהם בהתאמה. באסטרטגיה המכונה תרנוסטיקה, אותו rAb משמש הן להדמיה והן לטיפול6.
באופן אידיאלי, הנוגדן שנבחר לתיוג רדיו הוא כזה שכבר הוכח כבעל זיקה וספציפיות מחייבת גבוהה בשיטות שאינן מתויגות. ניתן להשיג סימון רדיו של נוגדנים באמצעות שינוי כימי ישיר של נוגדנים עם רדיונוקליד היוצר קשרים קוולנטיים יציבים (למשל רדיו-יוד), או בעקיפין באמצעות הצמדה עם כלאטורים שמתואמים לאחר מכן לרדיומטלים 7,8. תיוג רדיו ישיר כגון עם רדיויוד משנה באופן ספציפי את שאריות הטירוזין וההיסטידין על הנוגדן. אם שאריות אלה חשובות לקשירת אנטיגן, אזי זיקת רדיו זו תשנה את זיקת הכריכה. לעומת זאת, ישנם פרוטוקולים מבוססים מרובים להצמדה ותווי רדיו-תיוג עקיף של נוגדנים. לדוגמה, כלטור נפוץ המשמש לקשירת זירקוניום-89 (89Zr) להדמיית PET של נוגדנים הוא p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO), אשר מצומד באופן אקראי לשאריות ליזין של הנוגדן 9,10. אם יש שאריות ליזין באזור קשירת האנטיגן, הצמדה באתרים אלה עלולה לעכב באופן סטריקי את קשירת האנטיגן ובכך לפגוע בקשירת הנוגדן-אנטיגן. לפיכך, שיטות הרדיו-קונז'וגציה השונות המשמשות לתיוג רדיו-תיוג עקיף או ישיר של נוגדנים עלולות להשפיע על פעילות חיסונית, המוגדרת כיכולתו של הנוגדן רדיו-קונג'וגאט להיקשר לאנטיגן 7,11 שלו. שיטות הצמדה ספציפיות לאתר יכולות לעקוף מגבלה זו, אך טכניקות אלה דורשות הנדסת נוגדנים כדי לשלב שאריות ציסטאין נוספות או מומחיות בתגובות אנזימטיות על שאריות פחמימות 12,13,14,15,16. ברגע שנוגדן מתויג, חשוב לבדוק אם פעילות חיסונית נשמרת כחלק מהאפיון של ה-rAb. אחת הדרכים למדוד את האימונו-פעילות החיסונית היא לקבוע את הזיקה המחייבת של rAb.
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר תהליך לקביעת זיקת האיגוד עבור rAbs באמצעות מבחן רוויה רדיוליגנד מבוסס כדי לכמת את קשירת rAb-antigen. מגמת הכריכה מתוארת באיור 1. כמות האנטיגן הקשורה תגדל ככל שיתווסף יותר rAb לכמות קבועה של אנטיגן משותק. ברגע שכל האתרים הקושרים אנטיגן יהיו רוויים, תגיע מישור, והוספת rAbs נוספים לא תשפיע על כמות האנטיגן הכבול. במודל זה, קבוע הדיסוציאציה של שיווי המשקל (KD) הוא ריכוז הנוגדן התופס מחצית מקולטני האנטיגן17. ה-KD מייצג עד כמה נוגדן נקשר למטרה שלו עם KD נמוך יותר המתאים לזיקה מחייבת גבוהה יותר. בעבר דווח כי rAb אידיאלי צריך להיות KD של 1 ננומולאר או פחות18. עם זאת, rAbs עדכניים יותר פותחו עם KD בתחום הננומולרי הנמוך, ונחשבים מתאימים ליישומי הדמיה לא פולשניים 19,20,21,22. פרמטר נוסף שניתן לקבוע בבדיקת הרוויה הרדיוליגנדית של rAbs הוא Bmax, אשר מתאים לכמות המרבית של קשירת אנטיגן. ניתן להשתמש ב-Bmax כדי לחשב את מספר מולקולות האנטיגן במידת הצורך.
<img alt="גרף זיקה מחייבת; אינטראקציה בין נוגדנים לאנטיגן, Kd, Bmax, ריכוז, עקומת רוויה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: עקומת קשירה מייצגת של רוויה. אחוז האנטיגן הקשור מתווה כנגד ריכוזים הולכים וגדלים של נוגדנים שנוספו לכמות קבועה של אנטיגן. חלונות קופצים מדגימים קשירה בנקודות שונות. הריכוז והקשירה המתאימים ל- KD ו- Bmax, בהתאמה, מוצגים. דמות זו נוצרה עם BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63927/63927fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
בדיקה זו חשובה במיוחד עבור מבני נוגדנים דו-ספציפיים בעלי תווית רדיו כדי לקבוע את ה-KD עבור כל אזור קושר אנטיגן מקטעי (Fab) של זרוע הנוגדן הדו-ספציפי בעל התוויות הרדיו-תוויות עם האנטיגנים המתאימים שלהם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את KD של כל זרוע Fab בנפרד על אנטיגנים משותקים כדי לאפיין באופן עצמאי אם הזיקה המחייבת של כל זרוע Fab עבור האנטיגן המתאים שלה הושפעה לאחר רדיו-קונסיגנציה. פרוטוקול זה מודגם על ידי שימוש ב- amivantamab עם תווית רדיו- radiolabeled, נוגדן דו-ספציפי לקולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) וחלבוני מעבר מזנכימלי-אפיתל ציטופלסמי (cMET)19. נוגדנים חד-זרועיים בעלי תווית רדיו, כאשר זרוע Fab אחת נקשרת ל-EGFR (α-EGFR) או ל-cMET (α-cMET) וזרוע ה-Fab השנייה היא בקרת איזוטיפ, שימשו גם הם כדוגמאות19. פרוטוקול זה מתאים גם לכל נוגדן עם תווית רדיו עם אנטיגן ידוע שיכול להיות משותק. בפרוטוקול זה, סדרת דילול של ה-rAb מתווספת לכמות קבועה של אנטיגן משותק בבארות ייעודיות ספציפיות לכל זרוע Fab של ה-rAb. ה-rAb מתווסף גם לבארות שנחסמו רק עם אלבומין בסרום בקר (BSA), ללא אנטיגן, כדי לקבוע קשירה לא ספציפית. כדי לקבוע קשירה ספציפית, קשירה לא ספציפית לאנטיגן משותק מופחתת מהכריכה הכוללת של rAb. עקומת קשירת הרוויה המתקבלת משמשת לאחר מכן לקביעת KD, כמתואר לעיל.
אחד היתרונות של שיטה זו הוא יכולת שכפול גבוהה יותר בעת שימוש באנטיגנים מטוהרים בהשוואה לשימוש בקווי תאים כמקור לאנטיגנים, בהתחשב בכך שרמות ביטוי אנטיגן עלולות להיות מושפעות במהלך תרבית תאים וכי לקווי תאים שונים יש רמות משתנות של ביטוי אנטיגן. במקרה של נוגדנים דו-ספציפיים בעלי תווית רדיולית, קווי תאים המבטאים רק אחד מהאנטיגנים ללא השני עשויים שלא להיות זמינים, מה שיהפוך את אפיון הזיקה המחייבת של זרועות ה-Fab הבודדות למאתגר מאוד. יש לציין כי היתרון העיקרי של שיטת בדיקת הרדיוליגנד והרוויה על פני שיטות שאינן מתויגות ברדיו הוא האפיון הספציפי של הזיקה המחייבת של ה-rAb ללא התרומה של השבר הלא-מתויג של ה-rAb. למיטב ידיעתם של המחברים, אין כיום טכניקות טיהור להפרדת ה-rAb מהנוגדן הלא-משועבד שלו. בהתחשב בגודל הקטן יחסית של הצ'לטור והרדיונוקליד, תרומתם למשקל המולקולרי הכולל של ה-rAb אינה משמעותית בכרומטוגרפיה של הרחקת גודל. לפיכך, המוצר שנוצר מכל טכניקת radiolabeling הוא כמעט תמיד תערובת של rAb ואת ההורה שלה נוגדן unjujugated. אפיון זיקה מחייבת באמצעות בדיקת הרוויה עם תווית הרדיו מבטיח שהמוצר הנבדק הוא אך ורק rAb.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Counter</td><td>Hidex</td><td>Hidex Automatic Gamma Counter</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad</td><td></td><td>גרסה 9.2; משמש לניתוחים סטטיסטיים במחקר זה</td></tr><tr><td>Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>473768</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Seal Tape</td><td>קורנינג</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסופט אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>JT Baker</td><td>3506-01</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7949</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת זיקה מחייבת (kd) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

קביעת זיקה מקשרת (KD) היא היבט חשוב של אפיון נוגדנים בעלי תווית רדיו-תווית (rAb). בדרך כלל, זיקה מקשרת מיוצגת על ידי קבוע הדיסוציאציה של שיווי המשקל, KD, וניתן לחשב אותה כריכוז הנוגדן שבו מחצית מאתרי הקישור של הנוגדנים תפוסים בשיווי משקל. ניתן להכליל שיטה זו לכל נוגדן בעל תווית רדיו או פיגומים אחרים של חלבונים ופפטידים. בניגוד לשיטות מבוססות תאים, הבחירה באנטיגנים משותקים שימושית במיוחד לאימות זיקות קושרות לאחר אחסון ארוך טווח של נוגדנים, הבחנה בין זיקות קשירת קשר של זרועות אזור קושר אנטיגן מקטעי (Fab) במבני נוגדנים דו-ספציפיים, וקביעה אם יש שונות בביטוי אנטיגן בין קווי תאים שונים. שיטה זו כוללת שיתוק כמות קבועה של אנטיגן לבארות שצוינו על לוחית 96 בארות הניתנת לשבירה. לאחר מכן, קשירה לא ספציפית נחסמה בכל הבארות עם אלבומין בסרום בקר (BSA). לאחר מכן, rAb נוסף בשיפוע ריכוז לכל הבארות. מגוון של ריכוזים נבחר כדי לאפשר ל-rAb להגיע לרוויה, כלומר ריכוז של נוגדנים שבו כל האנטיגנים קשורים באופן רציף על ידי ה-rAb. בבארות ייעודיות ללא אנטיגן משותק, ניתן לקבוע קשירה לא ספציפית של ה- rAb. על ידי חיסור קשירה לא ספציפית מהקשירה הכוללת בבארות עם אנטיגן משותק, ניתן לקבוע קשירה ספציפית של rAb לאנטיגן. KD של rAb חושב מתוך עקומת קשירה רוויה שנוצרה כתוצאה מכך. לדוגמה, זיקה מקשרת נקבעה באמצעות amivantamab עם תווית רדיו-תאית, נוגדן דו-ספציפי לקולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) וחלבוני מעבר מזנכימלי-אפיתליאלי ציטופלסמי (cMET).

שיטה זו מחשבת זיקה מחייבת (KD) עבור rAb בהתבסס על מבחן איגוד הרוויה שבו נוספו ריכוזים שונים של rAb לכמות קבועה של אנטיגן משותק. עקומת הקשירה צריכה לעקוב אחר הצמיחה הלוגריתמית שבה היא תלולה בתחילה ואז רמה כאשר האנטיגן רווי. כדי להבטיח שה-KD שנקבע מדויק, הריכוזים של rAb חייבים להיות גבוהים מספיק כדי להגיע לרוויה. לצורך בדיקה זו, נוגדנים בעלי תווית רדיו הוצמדו ל- DFO ותויגו ב- 89Zr, כפי שתואר קודם לכן19. איור 3 מציג חלקות איגוד רוויה מייצ...

כאן מתוארת שיטה לקביעת הזיקה המחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים. KD הוא קבוע דיסוציאציית שיווי המשקל שניתן לקבוע מניסוי קשירת רוויה על ידי מדידת הקשירה הכוללת, הספציפית והלא ספציפית של נוגדן בעל תווית רדיו בריכוזים שונים לאנטיגן שלו.

קביעת זיקה מחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

שיטה זו יכולה לקבוע את הזיקה המחייבת של נוגדן בעל תווית רדיו לאנטיגן שלו. הוא גם ימדוד את הספציפיות של הכריכה. היתרון העיקרי של שיטה פשוטה זו הוא האפיון הספציפי של זיקה מקשרת רק של הנוגדן בעל התווית הרדיולית ללא הפרעה מצד הנוגדן ההורי הבלתי מעורער.טכניקה זו מאמתת באופן כמותי את יכולתו של נוגדן בעל תווית רדיו להיקשר למטרה שלו. זה חשוב ליישומים בהדמיה גרעינית ובטיפול גרעיני במגוון מחלות. מי שתדגים את ההליך תהיה אריקה בליצקי, עמיתה לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, להכין מאגר אימוביליזציה על ידי הוספת 191 מיליגרם של נתרן ביקרבונט ו 23.9 מיליגרם של נתרן פחמתי לצינור חרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיליליטרים של 18 מגה-אוהם מים והתמוססו על ידי מערבולות. כעת, התאם את ה- pH ל- 9.0 לפני שתביא את הנפח הכולל ל- 50 מיליליטר.לאחר מכן, הכינו 200 מיליליטרים של מאגר כביסה על ידי הוספת 200 מיליליטרים של PBS ו-100 מיקרוליטרים של Tween 20 לבקבוק של 250 מיליליטר. כמו כן להכין 50 מיליליטרים של מאגר קשירת על ידי הוספת 50 מיליגרם של BSA ו -25 מיקרוליטרים של Tween 20 עד 50 מיליליטרים של PBS ולערבב על ידי מערבולת. הוסיפו 1.5 גרם של BSA ל-50 מיליליטר של PBS כדי להכין את המאגר החוסם ואת המערבולת בעדינות לערבוב.לדלל את האנטיגן במאגר האימוביליזציה. לאחר מכן, קחו צלחת שטוחה ניתנת לשבירה, בעלת 96 בארות, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של אנטיגן לתחתית כל באר של 24 בארות במערך של שמונה על שלושה. מכסים את הצלחת בסרט איטום ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ כביסה. הופכים את הצלחת במהירות בכיור כדי להשליך את הנוזל ומקישים על הצלחת על ערימת מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל העודף. לאחר מכן, לבארות המכילות את האנטיגן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר חוסם לכל באר הן לבארות מצופות 24 אנטיגן והן ל-24 בארות ריקות של צלחת 96 הקידוחים. לאחר מכן, דגירו את הצלחת למשך שעה אחת בטמפרטורת הסביבה ושטפו כל באר של הצלחת שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטרים של חיץ כביסה. בצע דילולים סדרתיים משולשים של הנוגדן בעל התוויות הרדיו-מתויגות במאגר הקישור עבור שמונה שורות המוגדרות כ-A עד H על הלוח.ראשית, חישבו את נפח הנוגדן בעל התוויות הרדיו המלאי הנדרשות ליצירת תמיסה של 1.2 מיליליטר בריכוז הראשון. לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ קשירת קשירה לצינורות microcentrifuge המסומנים ב-B ל-H והוסיפו את הנפח הנדרש של חיץ קשירת קשירה לצינור A ולמערבולת בעדינות לצינור A ולמערבולת בעדינות. לאחר מכן, סובבו כלפי מטה באמצעות מיני-מיקרו-צנטריפוג' כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של נוזל משני A לצינור B.לאחר מערבולת, סובבו אותו כלפי מטה באמצעות מיני-מיקרו-צנטריפוג'. באופן דומה, הוסיפו תמיסה מצינור B לצינור C, C עד D, עד צינור H.הוסף 100 מיקרוליטרים של כל דילול לכל באר לשלוש בארות משותקות עם אנטיגן ושלוש בארות חסומות עם BSA בלבד. כעת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל דילול לצינורות המיקרוצנטריפוגה המסומנים בתקן A לתקן H ושמרו את הצינורות הללו כתקני נוגדנים עם תווית רדיולית שיש לבדוק במונה הגמא.דגירו את הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה. תייג צינורות מיקרו-סנטריפוג' עבור כל באר כמתואר בכתב היד. שאפו את הנוגדן בעל התוויות הרדיו מהבארות של צלחת 96 הבארות באמצעות שאיפת ואקום.כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר כביסה לכל באר. שאפו למאגר הכביסה וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. מפרקים את הבארות לצינורות המיקרו-צנטריפוג' המתאימים.ספרו את הרדיואקטיביות בצינורות כאשר האנטיגן מסומן כ-H1, H2, H3, H3 עד A1, A2, A3, ולאחר מכן עם BSA המסומן רק כ-H4, H5, H6, ל-A4, A5, A6 באמצעות מונה גמא. Amivantamab עם תווית רדיו הראתה קשירת קשר ספציפית לחלבונים EGFR ו-cMET. זיקות דומות לקשירת קשר נשמרו גם על ידי פאבים בעלי תווית רדיו חד-זרועית הקשורים לחלבונים EGFR ו-cMET.חלקות קשירת הרוויה הראו שכאשר הריכוזים של נוגדנים בעלי תווית רדיו היו נמוכים מדי, לא הושגה רוויה, כפי שמעידה העקומה הליניארית. ריכוזים של נוגדנים בעלי תווית רדיולית שהיו גבוהים מדי הובילו לרוויה ללא צמיחה לוגריתמית מובחנת, כפי שמראה המישור האופקי. כמו כן, נצפתה קשירת קשר לא ספציפית גבוהה עקב ריכוזים גבוהים של נוגדנים בעלי תווית רדיו.הליך זה עשוי לדרוש ניסיונות מרובים לייעל את טווח הריכוזים עבור כל נוגדן ספציפי עם תווית רדיו. השתמש בנתונים מתוצאות שליליות כדי לסייע בתכנון ניסויים עתידיים. ברגע שידוע על זיקה מחייבת, ניתן להשתמש בה כאמת מידה לבדיקות חוץ גופיות אחרות כחלק מאפיון של נוגדן בעל תווית רדיו.

determining-binding-affinity-kd-radiolabeled-antibodies-to

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה אנו מדגימים את השימוש בפוטומטריית מסה כדי לחקור אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים בתא זרימה. האור הממוקד מתפזר באופן שונה בהתאם למסת המולקולות. גלאי אוסף את האור המפוזר ויוצר את תבנית ההתאבכות ככתמים בעוצמות שונות, המתואמות את המסות המולקולריות.

פוטומטריה המונית לחקר אינטראקציות אנטיגן-נוגדנים ברמת מולקולה אחת

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

בשל זמן מחצית החיים הרדיואקטיבי הרב-יומי שלו ותכונות הדעיכה החיוביות, הרדיו-מתכת פולטת הפוזיטרונים 89Zr מתאימה מאוד לשימוש בתרופות רדיו-פרמצבטיות מבוססות נוגדנים להדמיית PET. בפרוטוקול זה יתוארו הביו-קונגוגציה, הרדיוסינתזה והיישום הפרה-קליני של 89נוגדנים המסומנים ב-Zr.

Bioconjugation וRadiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

הפרוטוקולים המוצגים מתארים שתי טכניקות מבוססות EIA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) לחקירה מהירה של אינטראקציות ליגנד-רצפטור: האסיי הראשון מאפשר את קביעת קבוע הדיסוציאציה בין ליגנד לרצפטור. האסיי השני מאפשר סינון מהיר של פפטידים חוסמי אינטראקציות ליגנד-רצפטור.

מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חלקיקי חלבון המכילים אנטיגנים לנוגדני IgM אנושיים ועכברים עם שרשראות קלות ספציפיות של קאפה (Vκ). פרוטוקול זה אינו מוגבל לנוגדנים מסוג IgM אלא חל על כל האיזוטיפים של אימונוגלובולין המכוונים לאנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק במהלך משקעים חיסוניים.

ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

אנו מתארים כאן פרוטוקולים לשקילה-אנטיגן הנוגדן מחייבת זיקת קינטיקה באמצעות פלטפורמות biosensor ארבע נפוצות.

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

אנו מתארים גישה של מולקולה אחת למדידות זיקה לאנטיגן-נוגדנים באמצעות פוטומטריה המונית (MP). הפרוטוקול מבוסס MP הוא מהיר, מדויק, משתמש בכמות קטנה מאוד של חומר, ואינו דורש שינוי חלבון.

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

מאמר זה מפרט מתודולוגיה לתיוג רדיואקטיבי של נוגדן חד-שבטי אנטי-CD19 ספציפי לבני אדם וכיצד להשתמש בו כדי לכמת תאי B במערכת העצבים המרכזית וברקמות היקפיות של מודל עכברי של טרשת נפוצה באמצעות הדמיית in vivo PET, ספירת גמא ex vivo וגישות אוטורדיוגרפיה.

הדמיה של תאי CD19+ B במודל ניסיוני של עכבר אנצפלומיאליטיס אוטואימונית באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים

למדו לקבוע זיקה מחייבת של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים באמצעות ניסויי קשירת רוויה. שיטה זו מאפשרת אפיון ספציפי ללא הפרעה מנוגדנים לא מצומדים ליישומים בדימות גרעיני וטיפול.

קביעת זיקה מחייבת (K_D) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

גלה סרטונים נוספים