כימות דינמיקת שלד ציטוסקלטון באמצעות מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית

הפרוטוקול שלנו יכול לכמת את הדינמיקה במערכות רבות באמצעות מגוון טכניקות מיקרוסקופיה אופטית. אנו מדגישים כיצד שיטה זו יכולה, בפרט, לעזור לאפיין את הדינמיקה של רשתות ציטוסקלטון משוחזרות. היתרון העיקרי של שימוש בחבילת התוכנה שלנו למיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית הוא שהיא מתועדת היטב, יש לה קבצי ניתוח לדוגמה מרובים וניתן להתאים אותה בקלות לחקר סוגים שונים של דינמיקה.

ניתן להשתמש בחבילת התוכנה שלנו כדי לכמת דינמיקה לא רק ברשתות שלד ציטו-שלד משוחזרות, אלא גם בחומרים רכים ורלוונטיים ביולוגית אחרים. בהתבסס על סולמות הזמן והאורך כדי לחקור את רצפי התמונה של מעל 1, 000 מסגרות באמצעות תוכנת בקרת מיקרוסקופ, כגון Micro-Manager. תחת תיקיית הדוגמאות המופיעה במאגר הקוד PyDDM, צור עותק של קובץ הפרמטרים בשם, example_parameter_file.yml.

פתח קובץ EML זה עם עורך טקסט כגון פנקס רשימות + או עורך הטקסט ב- JupyterLab. בקובץ EML שהועתק, ספק את ספריית הנתונים ואת שם הקובץ המתאימים לרצף התמונה שיש לנתח. תחת המקטע מטה-נתונים, ספק את גודל הפיקסל ואת קצב הפריימים.

תחת סעיף פרמטרי הניתוח, בחר את הפרמטרים לחישוב מטריצת ה- DDM, כגון מספר זמני ההשהיה השונים וזמן ההשהיה הארוך ביותר. ספק פרטים על ההתאמה של מטריצת DDM או על פונקציית פיזור הביניים במקטע הפרמטרים המתאימים, כגון שם המודל ופרמטר המודל, ניחוש ראשוני, גבול תחתון וגבול עליון. אתחל מופע של מחלקת ניתוח DDM על-ידי אספקת המטא-נתונים בפרמטרים של הניתוח על-ידי העברת שם הקובץ של קובץ EML עם נתיב הקובץ המלא לניתוח DDM.

לחלופין, העבר את המטא-נתונים והפרמטרים כמבנה נתונים של מילון Python. הפעל את הפונקציה כדי לחשב את מטריצת DDM. בדוק את הנתונים המוחזרים עם המשתנים והמטא-נתונים המשויכים, המאוחסנים כמערך נתונים בחבילת Xarray.

לאחר מכן, בדוק את החלקות והדמויות, שנשמרות כקובץ PDF ואת ספריית הנתונים. אחת מהחלקות הללו מציגה את שיטת ברירת המחדל לאופן הערכת הרקע. במידת הצורך, שנה את השיטה שבה הרקע מוערך באמצעות שיטת הרקע של הפרמטר בקובץ EML או כארגומנט מילת מפתח אופציונלי לפונקציה לחשב מטריצת DDM.

אתחל מופע של מחלקת ההתאמה של DDM על-ידי העברת שם הקובץ של קובץ EML המכיל את המטא-נתונים של התמונה ואת הפרמטרים המתאימים. רשום את הדגמים הזמינים על-ידי ביצוע המודלים להתאמת הדפסת הפונקציות. ציין את המודל שישמש בקובץ הפרמטר EML או באמצעות מודל התאמת הטעינה מחדש של הפונקציה לפי שם.

עבור כל פרמטר במודל שנבחר, הגדר את הניחושים והגבולות הראשוניים אם הם שונים מהערכים שצוינו בקובץ EML באמצעות הפונקציות הגדר ניחוש ראשוני של פרמטר והגדר גבולות פרמטרים. בצע את ההתאמה עם התאמת הפונקציה. צור מגרשים לבדיקת ההתאמות בתלות q של פרמטרי ההתאמה עם דוח התאמת הפונקציה.

בדוק את הפלט הכולל את האיור עם שניים על שני תתי-לוחות המציגים את מטריצת DDM או ISF בארבעה ערכי q יחד עם ההתאמה. השתמש בכיתה עיון DDM מתאים לסביבת מחברת Jupyter כדי להתוות את מטריצת DDM או ISF יחד עם ההתאמה הטובה ביותר בצורה אינטראקטיבית. לחיצה על נקודה בזמן הדעיכה לעומת תרשים מספר הגלים תציג את הנתונים וההתאמה.

בדוק את התוצאות של ההתאמה שנשמרה במערך נתונים של Xarray והשתמש בפונקציה שתי netCDF או מודול מלפפון חמוץ מובנה של Python כדי לשמור את מבנה הנתונים הזה בדיסק. ניתוח DDM בוצע על סדרת תמונות שדה בהיר של חרוזי 0.6 מיקרון ברשת וימנטין ותמונות מיקרוסקופ קונפוקליות מרשת מרוכבת אקטין-מיקרוטובול פעילה עם תוויות פלואורסצנטיות נבדלות מבחינה ספקטרלית. פונקציות פיזור ביניים הותוו כפונקציה של זמן השהיה במספרי גלים שונים ורשת עם ריכוז וימנטין של 19 מיקרומולר ו-34 מיקרומולר.

רמת זמן ההשהיה הארוכה של הפונקציה בערך הרבה מעל האפס מציינת אי-רציפות. זמן הדעיכה טאו המתואר כפונקציה של q עבור שתי רשתות עם ריכוזי וימנטין שונים מראה לתנועה תת-מפוזרת או מוגבלת. הפרמטרים הלא-ארגודיים c שהתוו כפונקציה של q בריבוע עבור הרשת עם 34 ו-49 מיקרומולרי וימנטין הראו כי היומן של c היה פרופורציונלי ל-q בריבוע כצפוי לתנועה מוגבלת.

תזוזה ממוצעת בריבוע לעומת חלקות זמן השהיה הראו שהערכים שנקבעו מ- DDM הסכימו היטב עם אלה שנמצאו באמצעות מעקב אחר חלקיקים בודדים. עבור הרשת המרוכזת יותר, רמת הערך מתקצרת בזמני השהיה ארוכים יותר. מטריצת DDM לעומת זמן השהיה עבור רשת מרוכבת פעילה של אקטין-מיקרוטובול הראתה כי למטריצת DDM עבור ערך q מסוים הייתה מישורית בזמני השהיה נמוכים, ולאחר מכן עלתה עוד יותר בזמני השהיה גדולים.

זמני הדעיכה האופייניים של טאו מההתאמות למטריצת DDM מראים שהקשר בין טאו ל-q מציין תנועה בליסטית. לאחר שפיתחנו את חבילת התוכנה PyDDM הזו, השתמשנו בה כדי לחקור את הדינמיקה האניזוטרופית ומשתנה הזמן של רשתות שלד ציטוסקלטון פעילות ומערכות אחרות.