Name: ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למד כיצד לבנות מערכת פרפוזיה רב-ערוצית בעלות נמוכה לתרבית תאים דינמית. שיטה זו מאפשרת מדידה של קצבי הפרשה וספיגה של מומסים בתאים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נערך בתמיכה תחת גרנט מס'. R01EB012521, R01EB028782 ו- T32 GM008339 מהמכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).</li>
<li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).</li>
<li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li>
<li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outlook+on+microfluidics%3A+the+promise+and+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li>
<li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).</li>
<li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li>
<li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow%2C+pigeon+and+Japanese+quail%2C+using+cell+perfusion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li>
<li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).</li>
<li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaltzman%2C+WM+%22Drug+Delivery%3A+Engineering+Principles+for+Drug+Therapy%22">Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy</a>. , Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFogler%2C+HS+%22Elements+of+Chemical+Reaction+Engineering.+4th+edn%22">Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn</a>. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).</li>
<li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConesa%2C+JA+%22Chemical+Reactor+Design%3A+Mathematical+Modeling+and+Applications%22">Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications</a>. , Wiley. (2019).</li>
<li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+%28bypassing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615(2019).</li>
<li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li>
<li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+%28RTD%29+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li>
<li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li>
<li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22HAL+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture%3A+residence+time+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li>
<li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

עבודה זו מתארת את ההרכבה והתפעול של מערכת תרביות תאים פרפוזיה עם מספר מקורות בינוניים שהוכחו באמצעות דוגמה ספציפית שבה נמדדה הדינמיקה של ביטוי גנים מונעי NF-κB בתגובה לדופק חולף של TNF-α. ה-RTDs של רכיבי מערכת הזלוף נמדדו והודגמו, וקונבולוציית האותות שימשה כדי לחזות הן את חשיפת התאים לפולס TNF-α והן את התפלגות TNF-α בשברי התווך של הקולחים שנאספו. התאים נחשפו לדופק והשברים נאספו במשך 40 שעות, ולאחר מכן נמדד ה-GLuc בשברים והתווה לצד האות החזוי TNF-α כדי לחשוף את הדינמיקה של גירוי-תגובה.
שיטת זלו...

תהליכים ביולוגיים חשובים רבים מתרחשים בתרביות תאים ורקמות על ציר הזמן של דקות עדשעות 1,2,3. בעוד שחלק מהתופעות הללו עשויות להיות נצפות ומתועדות באופן אוטומטי באמצעות מיקרוסקופיה בהילוך מהיר4, ביולומינסנציה1 או שיטות אחרות, ניסויים הכוללים איסוף דגימות-על של תרביות לצורך אנליזה כימית מבוצעים לעתים קרובות באופן ידני בתרביות תאים סטטיות. דגימה ידנית מגבילה את ההיתכנות של מחקרים מסוימים בשל אי הנוחות של נקודות זמן דגימה תכופות או לאחר שעות העבודה. חסרונות נוספים של שיטות תרבית סטטיות כוללים ניסויים הכוללים חשיפות מבוקרות וחולפות לגירויים כימיים. בתרביות סטטיות, יש להוסיף ולהסיר גירויים באופן ידני, ופרופילי הגירוי מוגבלים לשינויי צעדים לאורך זמן, בעוד ששינויים בינוניים גם מוסיפים ומסירים רכיבים בינוניים אחרים, שיכולים להשפיע על תאים באופן בלתי מבוקר5. מערכות נוזליות יכולות להתגבר על אתגרים אלה, אך מכשירים קיימים מציבים אתגרים אחרים. התקנים מיקרופלואידיים מגיעים עם העלויות הגבוהות של ציוד מיוחד והכשרה לייצור ושימוש, דורשים שיטות מיקרואנליטיות לעיבוד דגימות, ותאים קשים להתאושש מהמכשירים לאחר זלוף6. מעט מערכות מקרופלואידיות נוצרו עבור סוגי הניסויים המתוארים כאן 7,8,9,10, והן בנויות ממספר חלקים מותאמים אישית המיוצרים בתוך הבית ודורשים משאבות מרובות או אספני שברים. יתר על כן, המחברים אינם מודעים למערכות תרביות תאי פרפוזיה מקרופלואידיות הזמינות באופן מסחרי, למעט ביוריאקטורים של מיכלים מעורבבים לתרבית השעיה, אשר שימושיים לייצור ביולוגי, אם כי אינם מיועדים למידול וחקר פיזיולוגיה.
המחברים דיווחו בעבר על תכנון של מערכת ביוריאקטור פרפוזיה בעלות נמוכה המורכבת כמעט כולה מחלקים מסחרייםזמינים 11. גרסת הבסיס של המערכת מאפשרת לשמור תרביות מרובות בלוחית באר בחממת CO2 ולחדור באופן רציף עם מדיום ממשאבת מזרק, בעוד שזרמי המדיום השפכים מהתרביות מחולקים באופן אוטומטי לדגימות לאורך זמן באמצעות אספן שברים עם שינוי מותאם אישית. לפיכך, מערכת זו מאפשרת דגימה אוטומטית של תרבית בינונית סופר-נאטנטית וקלט מומס רציף לתרבויות לאורך זמן. המערכת היא מקרופלואידית ומודולרית וניתנת לשינוי בקלות כדי לענות על הצרכים של תכנוני ניסוי חדשניים.
המטרה הכוללת של השיטה המוצגת כאן היא לבנות, לאפיין ולהשתמש במערכת תרביות תאים פרפוזיה המאפשרת ניסויים שבהם נמדדים שיעורי ההפרשה או הקליטה של חומרים על ידי תאים לאורך זמן, ו/או תאים נחשפים לאותות מומסים מדויקים וחולפים. מאמר וידאו זה מסביר כיצד להרכיב את מערך הבסיס, המסוגל לחדור עד שש תרביות תאים בו זמנית באמצעות משאבת מזרק אחת ואספן שברים שונה. שתי גרסאות שימושיות במערכת הבסיס שעושות שימוש במשאבות ובחלקים נוספים כדי לאפשר ניסויים שחושפים את התאים לאותות ריכוז מומס חולפים, כולל פולסים קצרים ופרופילים דמויי פרמקוקינטיים12, מוצגים גם הם באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> איור 1: שלוש וריאציות על תכנון מערכת הזלוף. (באמצע) מערכת הזלוף עם סטופקוק למספר מקורות בינוניים. (למטה) מערכת הזלוף עם מיכל מעורבב כדי לחקות נפח מעורבב היטב של התפלגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
עקב פיזור ודיפוזיה בתוך הזרימה, אותות המומס מתעוותים או "נמרחים" כשהם נעים במערכת הזרימה. ניתן לכמת עיוות זה באמצעות שימוש בהתפלגויות זמן מגורים (RTDs)13. מאמר זה מסביר כיצד לבצע ניסויי מעקב על רכיבים של מערכת הזלוף (איור 2), ומספק סקריפטים של MATLAB ליצירת RTDs מנתונים שנמדדו. הסבר מפורט לניתוח זה ניתן למצוא במאמרם הקודם של המחברים11. סקריפטים נוספים של MATLAB מתאימים לפונקציות המתאימות ל-RTDs ומחלצים פרמטרים פיזיקליים, ומבצעים קונבולוציה של אותות אות באמצעות RTDs כדי לחזות כיצד קלט אות המומס על ידי המשתמש יפיץ ויעוות דרך מערכת הזלוף14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> איור 2: התפלגויות זמן מגורים. ה-RTDs של רכיבי מערכת הזרימה, כגון אורך זה של צינורות, נמדדים על ידי הזנת פולס של עוקבים למערכת ומדידת האופן שבו הוא "נמרח" עד שהוא יוצא לשברים שנאספו. נתון זה שונה מ-Erickson et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table><tbody><tr><td>18 מד 1 1/2- במחט בדיקה חד פעמית לשימוש עם מזרקים ומכונות חלוקה</td><td>Grainger</td><td>5FVK2</td><td></td></tr><tr><td>293T תאי</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T המשמשים בניסוי התוצאות המייצגות.</td></tr><tr><td>צלחות תחתונות שקופות 96 בארות, קורנינג</td><td>VWR</td><td>89091-010</td><td>צלחות למדידת ריכוזי צבע בניסויי RTD ו-GLuc בניסוי תוצאות מייצגות.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; מזרקים חד פעמיים עם קצות Luer-Lok, 5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac Fraction Collector&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>Fraction Collector שניתן להשתמש בו עבור זרם בודד, או לשנות באמצעות השיטה שלנו כדי לאפשר איסוף ממספר זרמים.</td></tr><tr><td>אקריליק שקוף עמיד בפני UV בעל חוזק גבוה 12 אינץ' x 12 אינץ' x 1/8 אינץ'</td> <td>McMaster-Carr</td><td>4615T93</td><td>גיליון זה נחתך באמצעות חותך לייזר על פי קובץ DXF בחומרים המשלימים כדי לייצר את המתקן הרב-ראשי שניתן לחבר לקולט השברים של BioFrac.</td></tr><tr><td>Coelenterazine מקורי</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td><td>מצע המשמש בבדיקת ביולומינסנציה של גאוס לוציפראז בתוצאות מייצגות.</td></tr><tr><td>צלחות מרובות בארות מרובות של Corning Costar TC, גודל 48&nbsp; בארות, צלחת פוליסטירן, בארות עם תחתית שטוחה</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3548</td><td>משמש לגידול ולחלחלת תאי 293T בתוצאות מייצגות.</td></tr><tr><td>קורנינג&nbsp; צלחות תרבית תאים שטוחות של Costar, גודל 12 בארות</td><td>Fisher Scientific</td><td>720081</td><td>ניתן לחבר ולהשתמש בהן כמיכל מעורבב לייצור פרופילים פרמקוקינטיים בזילוף. יכול להכיל גם תאים לזילוף.</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Epilog Zing 24 לייזר</td><td>חיתוך מערכות Epilog</td><td>Zing 24</td><td>חותך לייזר המשמש לייצור מתקן רב ראשי מגיליון אקרילי. ניתן להשתמש בחותכי לייזר אחרים.</td></tr><tr><td>מזרקים סטריליים של פישרברנד לשימוש חד פעמי, Luer-Lock, 20 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים סטריליים של פישרברנד לשימוש חד פעמי, Luer-Lock, 60 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-461</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה פרימיום של פישרברנד: 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה לאיסוף שברים.</td></tr><tr><td>פישרברנד&nbsp; צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים תחתונים עגולים עם קצה רגיל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>צינורות זכוכית לאיסוף שברים.</td></tr><tr><td>פישרברנד&nbsp; טיפים לפיפטה של SureOne Micropoint, התאמה אוניברסלית,</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>לא</td> מסוננת 2707410 <td>300 ul טיפים לפיפטה המתאימים ביותר למתקן ולצינורות מרובי הראשים כדי לשמש כטיפים לחלוקה.</td></tr><tr><td>גיבקו&nbsp; DPBS, אבקה, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td>תמיסת מלח פוספט חומצית.</td></tr><tr><td>Labline 4625 טיטר שייקר</td><td>מרשל סיינטיפיק</td><td>Labline 4625 טיטר שייקר שייקר</td><td>אורביטלי המשמש לשמירה על מיכלים מעורבבים.</td></tr><tr><td>התאמת מאסטרפלקס, פוליקרבונט, תא עצירה לארבעה כיוונים, מנעול לואר זכר, לא סטרילי; 10/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-04</td><td>משמש להצטרפות לזרמי כניסה מרובים לניסויי RTD וניסויי תרבית תאים.</td></tr><tr><td>Masterflex אביזרים, פוליקרבונט, ישר, נקבה Luer x כובע; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>UX-45501-28</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, פוליפרופילן, ישר, מתאמי Luer ל-Hosebarb, 1/16 אינץ'</td> <td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, פוליפרופילן, ישר, זכר Luer Lock למתאם Hosebarb, 1/16 אינץ' ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45518-00</td><td></td></tr><tr><td>מאסטרפלקס הולם, פוליפרופילן, ישר, זכר לואר נעילה למתאם תקע; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>EW-30800-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S צינורות משאבה מדויקים, סיליקון מרפא פלטינה, L/S 14; 25 רגל</td><td>Masterflex</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td>גרסה R2019b. ניתן להשתמש גם בגרסאות חדשות יותר. גרסאות ישנות יותר עשויות לפעול.</td></tr><tr><td>NE-1600 משאבת מזרק ניתנת לתכנות שישה ערוצים</td><td>מערכות משאבות עידן חדש</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>סט מתלים F1</td><td>Bio-Rad</td><td>7410010</td><td>מתלים להחזקת צינורות איסוף בקולט השברים.</td></tr><tr><td>חלבון TNF-alpha אנושי רקומביננטי (מבוטא HEK293),</td> CF <td>Bio-Techne</td><td>10291-TA-020</td><td>ציטוקין המשמש לגירוי תאי 293T בתוצאות מייצגות.</td></tr><tr><td>פקקים מוצקים של סנט גוביין, סיליקון ורסילי, גודל: 00, תחתון 10.5 מ"מ</td><td>סנט גוביין</td><td>DX263015-50</td><td>מתאים לצלחות של 48 בארות.</td></tr><tr><td>פקקים מוצקים של סנט גוביין, סיליקון ורסילי, גודל: 4 תחתונים 21 מ"מ</td><td>סנט גוביין</td><td>DX263027-10</td><td>מתאים לצלחות 12 בארות.</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, תמיסה מימית 10.0 N APHA; 1 L</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>S-395-1LT</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>SolidWorks</td><td>תוכנת CAD המשמשת ליצירת קובץ DXF של מתקן רב-ראשי.</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-צלחות Varioskan LUX multimode</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td>קורא צלחות.</td></tr><tr><td>מילוי בסיס מערכת צבע Wilton Color Performance, צבע</td> מאכל כחול <td>מייקלס</td><td>10404779</td><td>כחול המכיל FCF כחול מבריק, המשמש כעוקב בניסויי RTD. ספקטרום הספיגה מגיע לשיא של 628 ננומטר.</td></tr></tbody></table>

ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

תפקודים מסוימים של תאים ורקמות פועלים בסולם הזמן הדינמי של דקות עד שעות שנפתרות בצורה גרועה על ידי מערכות תרביות קונבנציונליות. עבודה זו פיתחה מערכת ביוריאקטורים של פרפוזיה בעלות נמוכה המאפשרת להחדיר את מדיום התרבית באופן רציף למודול תרבית תאים ולפצל אותו במודול במורד הזרם כדי למדוד דינמיקה בקנה מידה זה. המערכת בנויה כמעט כולה מחלקים זמינים מסחרית וניתן להקביל אותה כדי לערוך ניסויים עצמאיים בלוחות תרבית תאים קונבנציונליים מרובי בארות בו זמנית. מאמר וידאו זה מדגים כיצד להרכיב את מערך הבסיס, הדורש רק משאבת מזרק רב-ערוצית אחת ואספן שברים שונה כדי להחדיר עד שש תרבויות במקביל. כמו כן, מוצגות גרסאות שימושיות על העיצוב המודולרי המאפשרות דינמיקת גירוי מבוקרת, כגון פולסים מומסים או פרופילים דמויי פרמקוקינטיים. חשוב לציין, כאשר אותות מומסים נעים במערכת, הם מעוותים עקב פיזור מומס. יתר על כן, מתוארת שיטה למדידת התפלגויות זמן המגורים (RTDs) של רכיבי הגדרת הזלוף באמצעות עקיבה באמצעות MATLAB. RTDs שימושיים לחישוב האופן שבו אותות מומסים מעוותים על ידי הזרימה במערכת מרובת התאים. מערכת זו חזקה מאוד וניתנת לשחזור, כך שחוקרים בסיסיים יכולים לאמץ אותה בקלות ללא צורך במתקני ייצור מיוחדים.

מערכת הזלוף עם מספר מקורות בינוניים מסעיף 5 של הפרוטוקול שימשה למדידת דינמיקת הביטוי של גן מדווח המונעת על ידי גורם הגרעין kappa-light-משפר-שרשרת של גורם שעתוק של תאי B פעילים (NF-κB) בתאי כליה עוברית אנושית 293 (HEK293) בתגובה לפולס של 1.5 שעות של גורם נמק גידול אלפא (TNF-α). תאי HEK293 הומרו ביציבות באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים עם מבנה גן המכיל את Gaussia luciferase (GLuc), שהונע על ידי מקדם בשם NFKB המכיל את אלמנט התגובה NF-κB כדי ליצור תאי NFKB-GLuc HEK293, אשר מוינו באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואור...

מאמר זה מציג שיטה לבנייה והפעלה של מערכת תרבית תאים רב-ערוצית רב-ערוצית בעלות נמוכה למדידת הדינמיקה של הפרשה וקצבי ספיגה של מומסים בתהליכים תאיים. המערכת יכולה גם לחשוף תאים לפרופילי גירוי דינמיים.

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

שיטה זו מסייעת להבין כיצד שיעורי ההפרשה משתנים עם הזמן וכיצד תאים מגיבים לאותות מוצקים משתנים בזמן. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שעלותה הנמוכה, דורשת הכשרה מועטה וניתן להתאים את מערך מערכת השפע לניסויים חדשניים. התחילו במילוי מזרק אחד בתמיסת רקע וטענו אותו למשאבת המזרקים הראשונה.מלאו מזרק נוסף בתמיסת מעקב וטענו אותו למשאבת המזרק השנייה. חבר את שני המזרקים לשתיים מתוך שלוש היציאות של תחנה לארבעה כיוונים באמצעות מחברי luer. סגור את ה-stopcock לתמיסת הרקע ושאב את תמיסת העקיבה לתוך ה-stopcock עד שהוא מטפטף החוצה מהיציאה הפתוחה.עצור את המשאבה ואל תכוונן את המזרק עוד יותר. ודא שהמוט הנע של משאבות המזרקים נדחף כלפי מעלה כנגד בוכנות המזרק כך שהזרימה תתחיל מיד עם הפעלת המשאבה. סגור את ה-stopcock לתמיסת העקיבה ושאב את תמיסת הרקע לתוך ה-stopcock עד שכל תמיסת המעקב השיורית תשטוף מהיציאה הפתוחה.עצור את המשאבה ואל תכוונן את המזרק עוד יותר. הגדר את רכיב מערכת הזרימה הרצוי לניתוח RTD. הכנס את הקצה למתקן קצה פיפטה ושאב תמיסת רקע דרך הרכיב עד שהוא מתמלא לחלוטין.הגדר את המשאבה עבור תמיסת המעקב לקצב הזרימה הרצוי. סגור את ה-stopcock לתמיסת הרקע והתחל את הזרימה של תמיסת העקיבה. במקביל, הפעל את אספן השברים.המשך את זרימת תמיסת העקיבה למשך פרק זמן קצר כדי להעריך קלט דחף של העקיבה. משך דופק של 10 דקות מומלץ עבור RTDs בקצב זרימה של מיליליטר אחד לשעה. עצרו את משאבת תמיסת העקיבה בסוף תקופת הדופק של תמיסת העקיבה.סגור במהירות את ה- stopcock לפתרון המעקב והתחל את הזרימה של תמיסת הרקע באותו קצב זרימה. אפשרו לפתרון הרקע לזרום ולאסוף שברים עד שכל העקיבה תעבור דרך המערכת ולתוך השברים שנאספו. בתנאים סטריליים, מכניסים את הפקקים עם המחטים לתרביות הצלחת של הבאר עם המחטים נמשכות למעלה.לאחר שהפקק נמצא במקומו, הורידו את המחטים לגובה הרצוי לצורך זלוף מכיוון שגובה מחט היציאה קובע את רמת הנוזל היציבה. מכסים את המחטים בכובעים זכריים ושומרים את כל לוח הבאר באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו את שתי המדיות שישמשו לזלוף, תוך תיוג המדיום שיחולק תחילה כאחת והשנייה כמדיום שתיים.כדי שכל תרבית תפורע, מלאו מזרק אחד במזרק בינוני כדי להחזיק מעמד לאורך כל משך החלוקה שלו בתוספת נפח מספיק כדי למלא בתחילה את מערכת ההזלפה. מלאו מזרק שני בשתיים בינוניות שיחזיקו מעמד לאורך כל משך החלוקה שלו. חברו את שני המזרקים לשתיים מתוך שלוש היציאות של תחנה בעלת ארבעה כיוונים.ייתכן שיהיה צורך באורך של צינורות לחיבור המזרקים לסטופקוקים. הכינו את הסטופקוקים על ידי סגירת הסטלוק לבינוני אחד וחלוקת בינוני שניים לתוך הסטלוק עד שהוא פשוט מתחיל לטפטף החוצה מהיציאה הפתוחה. לאחר מכן סגרו את ה-stopcock לבינוני שניים ופיצו את ה-medium one לתוך ה-stopcock עד שכל שאריות המדיום שתיים נשטפו אל מחוץ ליציאה הפתוחה.חברו את הצינורות במעלה הזרם ליציאת ה-stopcock הפתוחה באמצעות מחבר נקבה ל-barb luer. הכנס מחבר זכר לבר לסיכה בקצה השני של הצינור. הוציאו את המזרק הבינוני מהמזרק עד שהצינור במעלה הזרם יתמלא במדיום והמשיכו בהכנת צינורות במורד הזרם כפי שהודגם קודם לכן.הכנס מחבר זכר לבר לתוך קצה אחד של הצינורות במורד הזרם והכובש אותו בכובע לואר נקבי. בזהירות להביא את כל צינורות מוכנים, מזרקים ואת צלחת הבאר לחממה כי ישמש עבור perfusion. מקם את משאבת המזרק ואת אספן השברים במיקומים הרצויים ליד האינקובטור.מניחים את משאבת המזרק על גבי האינקובטור או בסמוך לו ומניחים את אספן השברים ליד האינקובטור ליד הנמל. טענו את המזרקים לתוך המשאבה. חברו יחד את הקצוות המכוסים של כל הצינורות במעלה ובמורד הזרם ודחפו אותם מהחלק החיצוני של האינקובטור פנימה דרך היציאה.הכנס את הקצוות הפתוחים של הצינורות במורד הזרם לתוך קצות הפיפטה של מתקן ריבוי הראשים של אספן השברים. בתוך האינקובטור, משכו כמה שיותר רפיון של הצינורות במעלה הזרם לתוך האינקובטור כדי למקסם את אורך הצינורות שדרכם המדיום הזורם יכול לקבל חום ופחמן דו חמצני. עבור כל באר מחוברת, שחררו במהירות את המחטים ואת הצינורות במעלה הזרם ובמורד הזרם עבור באר זו, ולאחר מכן חברו אותן יחד עם מחברי הפיתוי שלהם.לאחר שכל החלקים מחוברים, הפעילו לזמן קצר את משאבת המזרק במהירות גבוהה יחסית כדי להבטיח שכל הנחלים זורמים כראוי. בשלב זה, אם רוצים להתחיל את הניסוי עם הצינורות במורד הזרם המלאים בתווך, המשיכו להפעיל את המשאבה עד שכולם יתמלאו, אחרת, עצרו את המשאבה. הגדר את קצב זרימת משאבת המזרק עבור בינוני אחד ואת תדירות איסוף השברים והתחל את שתי המכונות בו זמנית כדי להתחיל את הניסוי.כאשר יש צורך להחליף את המקור הבינוני, יש להפסיק במהירות את משאבת המזרק עבור אחד בינוני. סובבו את ה-stopcock סגור לבינוני והתחילו את משאבת המזרק לשניים בינוניים. אם תרצה בהמשך, החלף את המקור בחזרה לבינוני באופן דומה.אסוף שברים למשך הניסוי הרצוי. ריכוזי העקיבה בשברים משני ניסויי RTD נמדדו והוזנו ל-RTD מתוך סקריפט MATLAB של נתונים כדי לייצר את שני ה-RTDs. צינורות בודדים ופיסות צינורות מרובות בסדרה מתאימים היטב על ידי מודל פיזור צירי יחיד והוספת לוחית 48 באר מחוררת בקו גרמה לסטייה זניחה המאפשרת הן לצינור המטר האחד RTD והן ל-RTD של המערכת כולה להתאים לפונקציות פיזור ציריות.דוגמה להתאמת מודל לקויה הודגמה באמצעות מודל הפיזור הצירי שהותאם לנתוני RTD של שפופרת מטר אחד והותווה לצד הנתונים. ניחושי הפרמטרים הראשוניים שונו כדי לייצר התאמה טובה למודל שבו טאו היה שווה בערך לנפח מערכת הזלוף חלקי קצב הזרימה הנפחי שלו. פולס של 90 דקות של TNF-alpha הוגדר כאות הכניסה למערכת והתפתל עם צינור ה-RTD של מטר אחד כדי לקבוע את אות TNF-alpha בכניסה לצלחת הבאר.אות הקלט היה גם מפותל עם RTD של המערכת כולה כדי לקבוע את אות TNF-אלפא ביציאה של המערכת בשברים שנאספו. תאי HEK 293 הונדסו להפריש GLuc המונעים על ידי מקדם המכיל את אלמנט התגובה NF-kappaB. הניסוי גילה עלייה משמעותית בביטוי וירידה איטית בביטוי GLuc המונעת על ידי NF-kappaB בעקבות חשיפה ל-TNF-אלפא.וריאציות של המערכת מתוארות במאמר הנלווה, כולל התקנה פשוטה יותר לניסויים שאינם דורשים הזנת אותות וחשיפת תאים לפרופילי מומס חיבור פארמה-הו.

multi-stream-perfusion-bioreactor-integrated-with-outlet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית תאים ראשוניים, מודלים של רקמות וביופסיות ניקוב בשבב מיקרופלואידי מרובה איברים למשך עד 28 ימים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, אגרגטים בכבד וביופסיות עור שולבו בהצלחה במחזור מדיה משותף.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.

רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית

פרוטוקול זה מציג את ההתקנה והתפעול של ביוריאקטור מודפס תלת-ממדי שפותח לאחרונה עבור תרבית ex vivo של כלי דם בזילוח. המערכת תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי משתמשים אחרים, מעשית, במחיר סביר וניתנת להתאמה ליישומים ניסיוניים שונים, כגון ביולוגיה בסיסית ומחקרים פרמקולוגיים.

אקס ויוו תרבית זילוח של כלי דם גדולים בביוריאקטור מודפס בתלת-ממד

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

למד כיצד לבנות מערכת פרפוזיה רב-ערוצית בעלות נמוכה לתרבית תאים דינמית. שיטה זו מאפשרת מדידה של קצבי הפרשה וספיגה של מומסים בתאים בזמן אמת.

ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית

גלה סרטונים נוספים