ביוריאקטור פרפוזיה מרובה זרמים משולב עם פיצול מוצא לתרבית תאים דינמית
20 ביולי 2022
מאמר זה מציג שיטה לבנייה והפעלה של מערכת תרבית תאים רב-ערוצית רב-ערוצית בעלות נמוכה למדידת הדינמיקה של הפרשה וקצבי ספיגה של מומסים בתהליכים תאיים. המערכת יכולה גם לחשוף תאים לפרופילי גירוי דינמיים.
שיטה זו מסייעת להבין כיצד שיעורי ההפרשה משתנים עם הזמן וכיצד תאים מגיבים לאותות מוצקים משתנים בזמן. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שעלותה הנמוכה, דורשת הכשרה מועטה וניתן להתאים את מערך מערכת השפע לניסויים חדשניים. התחילו במילוי מזרק אחד בתמיסת רקע וטענו אותו למשאבת המזרקים הראשונה.
מלאו מזרק נוסף בתמיסת מעקב וטענו אותו למשאבת המזרק השנייה. חבר את שני המזרקים לשתיים מתוך שלוש היציאות של תחנה לארבעה כיוונים באמצעות מחברי luer. סגור את ה-stopcock לתמיסת הרקע ושאב את תמיסת העקיבה לתוך ה-stopcock עד שהוא מטפטף החוצה מהיציאה הפתוחה.
עצור את המשאבה ואל תכוונן את המזרק עוד יותר. ודא שהמוט הנע של משאבות המזרקים נדחף כלפי מעלה כנגד בוכנות המזרק כך שהזרימה תתחיל מיד עם הפעלת המשאבה. סגור את ה-stopcock לתמיסת העקיבה ושאב את תמיסת הרקע לתוך ה-stopcock עד שכל תמיסת המעקב השיורית תשטוף מהיציאה הפתוחה.
עצור את המשאבה ואל תכוונן את המזרק עוד יותר. הגדר את רכיב מערכת הזרימה הרצוי לניתוח RTD. הכנס את הקצה למתקן קצה פיפטה ושאב תמיסת רקע דרך הרכיב עד שהוא מתמלא לחלוטין.
הגדר את המשאבה עבור תמיסת המעקב לקצב הזרימה הרצוי. סגור את ה-stopcock לתמיסת הרקע והתחל את הזרימה של תמיסת העקיבה. במקביל, הפעל את אספן השברים.
המשך את זרימת תמיסת העקיבה למשך פרק זמן קצר כדי להעריך קלט דחף של העקיבה. משך דופק של 10 דקות מומלץ עבור RTDs בקצב זרימה של מיליליטר אחד לשעה. עצרו את משאבת תמיסת העקיבה בסוף תקופת הדופק של תמיסת העקיבה.
סגור במהירות את ה- stopcock לפתרון המעקב והתחל את הזרימה של תמיסת הרקע באותו קצב זרימה. אפשרו לפתרון הרקע לזרום ולאסוף שברים עד שכל העקיבה תעבור דרך המערכת ולתוך השברים שנאספו. בתנאים סטריליים, מכניסים את הפקקים עם המחטים לתרביות הצלחת של הבאר עם המחטים נמשכות למעלה.
לאחר שהפקק נמצא במקומו, הורידו את המחטים לגובה הרצוי לצורך זלוף מכיוון שגובה מחט היציאה קובע את רמת הנוזל היציבה. מכסים את המחטים בכובעים זכריים ושומרים את כל לוח הבאר באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו את שתי המדיות שישמשו לזלוף, תוך תיוג המדיום שיחולק תחילה כאחת והשנייה כמדיום שתיים.
כדי שכל תרבית תפורע, מלאו מזרק אחד במזרק בינוני כדי להחזיק מעמד לאורך כל משך החלוקה שלו בתוספת נפח מספיק כדי למלא בתחילה את מערכת ההזלפה. מלאו מזרק שני בשתיים בינוניות שיחזיקו מעמד לאורך כל משך החלוקה שלו. חברו את שני המזרקים לשתיים מתוך שלוש היציאות של תחנה בעלת ארבעה כיוונים.
ייתכן שיהיה צורך באורך של צינורות לחיבור המזרקים לסטופקוקים. הכינו את הסטופקוקים על ידי סגירת הסטלוק לבינוני אחד וחלוקת בינוני שניים לתוך הסטלוק עד שהוא פשוט מתחיל לטפטף החוצה מהיציאה הפתוחה. לאחר מכן סגרו את ה-stopcock לבינוני שניים ופיצו את ה-medium one לתוך ה-stopcock עד שכל שאריות המדיום שתיים נשטפו אל מחוץ ליציאה הפתוחה.
חברו את הצינורות במעלה הזרם ליציאת ה-stopcock הפתוחה באמצעות מחבר נקבה ל-barb luer. הכנס מחבר זכר לבר לסיכה בקצה השני של הצינור. הוציאו את המזרק הבינוני מהמזרק עד שהצינור במעלה הזרם יתמלא במדיום והמשיכו בהכנת צינורות במורד הזרם כפי שהודגם קודם לכן.
הכנס מחבר זכר לבר לתוך קצה אחד של הצינורות במורד הזרם והכובש אותו בכובע לואר נקבי. בזהירות להביא את כל צינורות מוכנים, מזרקים ואת צלחת הבאר לחממה כי ישמש עבור perfusion. מקם את משאבת המזרק ואת אספן השברים במיקומים הרצויים ליד האינקובטור.
מניחים את משאבת המזרק על גבי האינקובטור או בסמוך לו ומניחים את אספן השברים ליד האינקובטור ליד הנמל. טענו את המזרקים לתוך המשאבה. חברו יחד את הקצוות המכוסים של כל הצינורות במעלה ובמורד הזרם ודחפו אותם מהחלק החיצוני של האינקובטור פנימה דרך היציאה.
הכנס את הקצוות הפתוחים של הצינורות במורד הזרם לתוך קצות הפיפטה של מתקן ריבוי הראשים של אספן השברים. בתוך האינקובטור, משכו כמה שיותר רפיון של הצינורות במעלה הזרם לתוך האינקובטור כדי למקסם את אורך הצינורות שדרכם המדיום הזורם יכול לקבל חום ופחמן דו חמצני. עבור כל באר מחוברת, שחררו במהירות את המחטים ואת הצינורות במעלה הזרם ובמורד הזרם עבור באר זו, ולאחר מכן חברו אותן יחד עם מחברי הפיתוי שלהם.
לאחר שכל החלקים מחוברים, הפעילו לזמן קצר את משאבת המזרק במהירות גבוהה יחסית כדי להבטיח שכל הנחלים זורמים כראוי. בשלב זה, אם רוצים להתחיל את הניסוי עם הצינורות במורד הזרם המלאים בתווך, המשיכו להפעיל את המשאבה עד שכולם יתמלאו, אחרת, עצרו את המשאבה. הגדר את קצב זרימת משאבת המזרק עבור בינוני אחד ואת תדירות איסוף השברים והתחל את שתי המכונות בו זמנית כדי להתחיל את הניסוי.
כאשר יש צורך להחליף את המקור הבינוני, יש להפסיק במהירות את משאבת המזרק עבור אחד בינוני. סובבו את ה-stopcock סגור לבינוני והתחילו את משאבת המזרק לשניים בינוניים. אם תרצה בהמשך, החלף את המקור בחזרה לבינוני באופן דומה.
אסוף שברים למשך הניסוי הרצוי. ריכוזי העקיבה בשברים משני ניסויי RTD נמדדו והוזנו ל-RTD מתוך סקריפט MATLAB של נתונים כדי לייצר את שני ה-RTDs. צינורות בודדים ופיסות צינורות מרובות בסדרה מתאימים היטב על ידי מודל פיזור צירי יחיד והוספת לוחית 48 באר מחוררת בקו גרמה לסטייה זניחה המאפשרת הן לצינור המטר האחד RTD והן ל-RTD של המערכת כולה להתאים לפונקציות פיזור ציריות.
דוגמה להתאמת מודל לקויה הודגמה באמצעות מודל הפיזור הצירי שהותאם לנתוני RTD של שפופרת מטר אחד והותווה לצד הנתונים. ניחושי הפרמטרים הראשוניים שונו כדי לייצר התאמה טובה למודל שבו טאו היה שווה בערך לנפח מערכת הזלוף חלקי קצב הזרימה הנפחי שלו. פולס של 90 דקות של TNF-alpha הוגדר כאות הכניסה למערכת והתפתל עם צינור ה-RTD של מטר אחד כדי לקבוע את אות TNF-alpha בכניסה לצלחת הבאר.
אות הקלט היה גם מפותל עם RTD של המערכת כולה כדי לקבוע את אות TNF-אלפא ביציאה של המערכת בשברים שנאספו. תאי HEK 293 הונדסו להפריש GLuc המונעים על ידי מקדם המכיל את אלמנט התגובה NF-kappaB. הניסוי גילה עלייה משמעותית בביטוי וירידה איטית בביטוי GLuc המונעת על ידי NF-kappaB בעקבות חשיפה ל-TNF-אלפא.
וריאציות של המערכת מתוארות במאמר הנלווה, כולל התקנה פשוטה יותר לניסויים שאינם דורשים הזנת אותות וחשיפת תאים לפרופילי מומס חיבור פארמה-הו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבנייה ולהפעלה של מערכת תרביות תאים בפרפוזיה רב-ערוצית בעלות נמוכה, למדידת הדינמיקה של קצבי הפרשה ובליעה של מומסים בתהליכים תאיים. המערכת יכולה להחשיף תאים גם לפרופילי גירוי דינמיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- דינמיקת הפרשה
- קצבי ספיגה
רקע
- הבנת קצבי ההפרשה חיונית לחקר תהליכים תאיים.
- גירויים דינמיים עשויים להשפיע על תגובות תאיות.
- מערכות בעלות עלות נמוכה יכולות לסייע ליישומים רחבים יותר של מחקר.
- נדרשת הכשרה מינימלית לצורך ההקמה והתפעול.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת פרפוזיה (perfusion) חסכונית עבור תרבית תאים.
- מדידת הדינמיקה של הפרשה ובליעה של מומסים.
- מתן אפשרות לחשיפת תאים לפרופילי גירוי משתנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ההכנה כוללת מילוי מזרקים בתמיסות רקע ותמיסות סמן.
- השימוש נעשה במשאבות מזרקים ובברז תילת (stopcock) ארבע-דרכי לבקרת נוזלים.
- תמיסת הסמן מועברת באמצעות משאבה כדי לצפות בדינמיקת ההפרשה.
- ניתן להתאמה לתנאים ניסיוניים שונים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מודדת ביעילות שינויים בקצבי ההפרשה לאורך זמן.
- תאים מגיבים לאותים מוצקים המשתנים עם הזמן.
- מדגימה את הרב-גוניות של מערכת הפרפוזיה.
- הקמה בעלות נמוכה מעודדת שימוש נרחב יותר במחקר.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת תובנות לגבי דינמיקה תאית.
- זהו כלי בעל ערך עבור חוקרים בביולוגיה של התא.
- היכולת של המערכת להסתגל תומכת במגוון עיצובים ניסיוניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות תרביות תאים דינמיות המאפשרות הפרדה של קינטיקת הפרשה ותגובה בטווח של דקות עד שעות הן קריטיות לתיקוף חזוי של מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. ביו-ריאקטור פרפוזיה רב-זרמי זה, בעל הפרדה מובנית ביציאה, מאפשר מדידה כמותית בעלת רזולוציה זמנית של תגובות תאיות לפרופילי מומסים מבוקרים, ובכך תומך ברציפות תרגומית ובפיתוח מערכי בדיקה חסונים. עיצובו המודולרי ובעל העלות הנמוכה מקל על ביצוע ניסויים במקביל ועל הדירות, דבר המשפיע ישירות על תיעדוף תיקי פיתוח ועל קבלת החלטות בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תגובות תאיות דינמיות לפרופילי מומסים הדמיים לפרמקוקינטיקה.
- תומך בהפחתת סיכונים מתוכננת (de-risking) על ידי כימות קינטיקה של הפרשה ואיתות בזמן אמת.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות בקרה מדויקת של דינמיקת הגירוי.
- משפר את רמת הוודאות החזויית על ידי פתרון ההיבטים הזמניים של הפעלת המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקתקות וניתנות לשחזור לסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מנstandardize את תנאי הבדיקה באמצעות פרפוזיה ופרקציונציה מבוקרות לקבלת פלטים כמותיים.
- מאפשר ניסויים מקביליים בפורמטים של מספר בארות, ובכך מגביר את התפוקה ואת יכולת ההרחבה.
- תומך בהערכה אמינה של השפעות תרכובות תחת תנאי חשיפה דינמיים.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- מתאימה פרופילי גירוי in vitro לפרמקוקינטיקה in vivo עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- שומרת על רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות לכידה של פלטי תאיים בעלות רזולוציה זמןית.
- מפחיתה סיכון תרגומי על ידי מידול תרחישי חשיפה רלוונטיים פיזיולוגית.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי ויסות זמני של מסלולי הפרשה ואיתות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מערכת זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי, על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי ודינמי של תגובות תאים לקלטים מבוקרים של מומסים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מדידה בזמן אמת של הפרשה וקינטיקה של תגובה.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור ומתאימות לתהליכי עבודה של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- אנליטיקה: מספק דגימות מופרדות לפי שברים ופתורות בזמן עבור אנליזה כמותית שלבימה והשוואה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: מדמה פרופילים דמויי פרמקוקינטיקה כדי להתאים ממצאים in vitro לתרחישי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב מודולרי מאפשר אימוץ והתאמה רחבים על פני סוגי תאים וצרכים ניסיוניים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מנרמל תהוכי תרביות דינמיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות go/no-go טובות יותר ויעילות הון על ידי אספקת נתונים חסונים ורזולוציית זמן.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון ובקידום תוכניות גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בתרביות תאים והיכרות עם מערכות פרפוזיה.
- דורש מכשירים סטנדרטיים למעבדה: משאבות מזריקים, אספני פרקציות ופלטות רב-בארים.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מועשירה על ידי שימוש ברכיבים זמינים מסחרית.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים ופרוטוקולי גירוי בשינויים מינימליים.
- מגבלות מעשיות כוללות השפעות של פיזור מומסים, שניתן לכמת באמצעות ניתוח התפלגות זמן שהייה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:26
Measure Component RTDs and Perform Signal Convolution
2:51
Set up the Perfusion System with a Stopcock for Multiple Medium Sources
7:26
Results: Assembly and Operation of a Perfusion Cell Culture System with Multiple Medium Sources
9:32
Conclusion
