Name: פיתוח מודלים דרוזופילה מלנוגסטר להדמיה ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למדו שיטת דימוי OCT ושליטה אופטוגנטית בלב Drosophila melanogaster. טכניקה זו מאפשרת הדמיה לא פולשנית ודירוג לב אופטי לחקר מחלות לב וטיפול בהפרעות קצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאנדריי קומרוב, יוקסואן וואנג וג'ינטאו ג'ו על עזרתם בניתוח נתונים ומודים לחברי המעבדה של ג'ואו על הדיונים החשובים שלהם. העבודה במעבדתו של ד"ר ג'ואו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01-EB025209 ו-R01-HL156265, ופרס המחקר החדשני של קרן קלייקו.

עבור המחקר הנוכחי, eNpHR2.0 קו מהונדס w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR קו מהונדס w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, ודרייבר GAL4 ספציפי ללב המכיל מקטע ויסות גן יד w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (מלאי מנהלי התקנים זה יצוין כ-Hand-GAL4) שימשו. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 שימש כקו הכתבים של GFP. מלאי הדרוזופילה שהוזכרו התקבלו ממרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה (BDSC, ראו טבלת חומרים) ונשמרו בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס על מדיה סטנדרטית של קמח תירס. המודלים של דרוזופילה שפותחו במחקר זה זמינים על פי בקשה לעבודה משותפת.
1. צלבים גנטיים של דרוזופילה והכנת מדיה
<ol><li>שנה את מאזן הכרומוזומים השלישי TM3 Sb[1] ל- TM6 Sb Tb, ויצר w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). ראו איור משלים מס' 1 לתכנית המעברים. הניחו צלבים בבקבוקונים עם מדיה רגילה של קמח תירס. הערה: נוכחותו של סמן שחפת מאפשרת למשתמשים להבחין בין זחלים וגלמים המכילים טרנסגן אופסין ודרייבר GAL4 לבין בעלי חיים המכילים אופסין אך ללא נהג25.</li>
	<li>שמור את הצלבים הגנטיים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס, 70% לחות על מדיה המכילה רשתית טרנסית (ATR) שפותחה במיוחד (ראה טבלת חומרים) בחושך למשך 5 ימים לאיסוף זחלים ו-6 ימים לאיסוף גלמים.</li>
	<li>שלב חמש נקבות בתולות Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb ושניים עד שלושה זכרים ממניות UAS-opsin (eNpHR2.0, או ReaChR) לכל בקבוקון. ראו את דיאגרמת הצלב עבור eNpHR2.0 ו-ReaChR opsin באיור 2A ובאיור 2B, בהתאמה.</li>
	<li>למחרת, הכינו בקבוקוני מדיה המכילים ATR.<ol><li>הכן מזון מוגדר למחצה על פי ההוראות של BDSC26. במקום סוכרוז וגלוקוז, הוסיפו רק סוכרוז (5.14 גרם/100 מ"ל). מצננים ל~60°C תוך ערבוב קבוע.</li>
		<li>הכינו בקבוקוני זבובים צרים, והוסיפו 50 מיקרו-ליטר של תמיסת ATR-אתנול של 100 mM לכל בקבוקון.</li>
		<li>באמצעות פיפטה סרולוגית, יש להשליך מזון לזבובים כדי לצמצם את בקבוקוני הזבובים, 5 מ"ל לבקבוקון. וורטקס במהירות מקסימלית במשך 10 שניות.</li>
		<li>חברו את הבקבוקונים, ועטפו אותם בבד הכהה כדי להגן עליהם מפני אור. תנו לבקבוקונים להתייבש למשך 12 שעות לפחות (למשך הלילה).</li>
	</ol></li>
	<li>למחרת, העבירו את הזבובים בהתמדה מטילים ביצים משלב 1.3. לבקבוקונים עם מזון המכיל ATR (שלב 1.4.4.). הגן על המדפים באמצעות בקבוקונים מפני אור.</li>
	<li>לאחר 24-48 שעות (תלוי במספר הביצים המוטלות), יש להשליך את ההורים כדי למנוע אכלוס יתר של בקבוקונים.</li>
	<li>לאסוף צאצאים שאינם שחפת ולהשתמש בהם להדמיית לב. הערה: ההבדלים הפנוטיפיים בשלבי הזחל והפופל מודגמים באיור 2C. הסיכום וציר הזמן המשוער של שלבי הכנת הדגימה מוצגים באיור 3.</li>
</ol>2. שליטה אופטוגנטית של הלב Drosophila
<ol><li>בחרו זחל UAS-opsin/Hand-GAL4 /pupa מהבקבוקון (שלב 1.7.), הניחו טישו ונגבו בעדינות את המדיה ממשטח הגוף באמצעות מברשת צביעה.</li>
	<li>הכינו את שקופית המיקרוסקופ והניחו חתיכה קטנה של סרט דו-צדדי באמצע.</li>
	<li>בעזרת מברשת או פינצטה עדינה, הניחו בעדינות את הזחל/גולם על משטח הסרט כשהצד הגבי כלפי מעלה וניצב לצד הארוך של המגלשה. הפעילו לחץ עדין כדי להצמיד את הזחל/גולם למשטח הסרט.</li>
	<li>הניחו את המגלשה על במת ההדמיה, זחל/גולם עם הפנים כלפי מטה.</li>
	<li>הפעל את מקור האור OCT באמצעות תוכנת בקרת לייזר (ראה טבלת חומרים). פתח את תוכנת הבקרה SD-OCT הכתובה בהתאמה אישית ולאחר מכן לחץ על חלון התצוגה המקדימה .</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הסריקה בתוכנת SD-OCT. הערה: המטרה היא ליישר את הדגימה להדמיה אופטימלית של הלב הפועם, כך שבחירה בטווח X ובטווח Y מכסה את אזור הלב. בשלב זה, הן מספר סריקות A והן סריקות B הם 400. הטווח בכיווני x ו-y הוא ~490 μm ו-~537 μm, ומראה את שני החתכים האורתוגונליים של הלב (xz ו-yz), בהתאמה.</li>
	<li>השתמש במיקרומניפולטורים כדי לשלוט בשלב הדגימה כדי להביא את לב הזבוב למיקוד. התאם את מיקום המוקד כדי למזער את השתקפות האור ממשטח הקוטיקולה של הזבוב. שקלו למרוח שמן מינרלי על משטח הזחל/הגלמים כדי למזער את ההשתקפות. הערה: שמן עלול להגביר את הסיכון לתנועת בעלי חיים על ידי פגיעה בתכונות דבק הסרט.</li>
	<li>ודא כי לב הזבוב יכול להיות מוצג במלואו בחלון התמונה ללא כל עיוותים, להיות חסום החוצה על ידי רקמות, וצללים לא זניחים והשתקפויות; אחרת, חזור לשלב 2.7.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הסריקה לרכישת תמונת OCT במצב M. הערה: מספר סריקות A מופחת בהשוואה לשלב 2.7. עבור קצב פריימים מהיר יותר כדי ללכוד את הדינמיקה הפועמת של לב הזבוב (כמה הרץ). מספר סריקות B מציין את מספר המסגרות החוזרות עבור הדמיה במצב M, אשר ניתן להתאים על סמך זמן ההקלטה וזיכרון המערכת הזמין. בניסוי זה, 128 סריקות A יכולות לאפשר מהירות של ~ 125 פריימים לשנייה, ו -4,000 סריקות B חוזרות מוקלטות, ומספקות הקלטה רציפה של ~ 32 שניות.</li>
	<li>קבל חמש קבוצות של נתוני בקרה ללא פולסים של גירוי אור אדום כדי לחשב את הדופק במנוחה (RHR).</li>
	<li>תכנן את פעימת האור עבור גירוי הקצב בתוכנת בקרת OCT המותאמת אישית. ב"הגדרות", הוסף את רצפי פולס האור המתוכננים כדי לשלוט בתדר הדופק, רוחב הדופק, משך הגירוי וזמן ההמתנה בהתאם לפרוטוקולי גירוי שונים. הערה: ה-RHR נמדד מניסוי הבקרה ללא תאורת אור ומשמש לחישוב התדירות שבה יש לפעום את האור לניסויים טכיפאקינג ובראדיפאקינג22.</li>
	<li>פתח את תוכנת בקר האור (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור פולסים של אור אדום. בחרו את מצב הדופק ב"בחירת מצב". לחץ פעמיים על הדמות עבור הגדרות "פרופיל דופק" ובחר מצב עוקב. שמור על עוצמת הכיבוי כ- 0, והגדר את אחוז עוצמת ה- ON בעת חישוב צפיפות ההספק בפועל. הערה: פולסים של נורות גירוי מופעלים על ידי אות מתוכנת הבקרה OCT בהתאם להגדרות בשלב 2.12.</li>
	<li>רכוש קטעי וידאו במצב M של הלב Drosophila הפועם עם גירוי קל על ידי לחיצה על לרכוש בתוכנת בקרת OCT. חזור על המדידות 5x.</li>
</ol>3. ניתוח תמונות
<ol><li>פתח את תוכנת סגמנטציית לב הזבוב שפותחה בהתאמה אישית.</li>
	<li>לחץ על בחר קובץ ולאחר מכן בחר את הקובץ לניתוח בממשק המשתמש הגרפי שמופיע.</li>
	<li>הזינו את הגבולות האנכיים והאופקיים של אזור הלב בפיקסלים בתיבות המלל העליונות. לחץ על שינוי גודל. באמצעות המחוון בתחתית, ודא שכל אזור הלב גלוי ושהוא ממלא את כל הקופסה עבור האוסף כולו. אם לא, חזור על תהליך זה והתאם את הגבולות.</li>
	<li>לחץ על חיזוי כדי לחזות את אזור הלב. התוכנית תעבור כעת על כל פרוסה באוסף ותבחר את אזור הלב, תוך כ-3 דקות.</li>
	<li>לחץ על עלילת משאבי אנוש לאחר השלמת החיזוי. פעולה זו תפתח חלון חדש המציג חלקה של אזור הלב לאורך זמן. ודא שאזורי הפסגה או העמק הנכונים נבחרו. בחר דופק ולאחר מכן HR כדי ליצור דמות סופית, ואת הפרמטרים הפונקציונליים יישמרו בקבצי .csv בו זמנית.</li>
</ol>

<ol><li>Nature Methods. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2010.</a> Nature Methods. 8, 1(2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Tsai, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+firing+in+dopaminergic+neurons+is+sufficient+for+behavioral+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning.</a> Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).</li>
<li>Wykes, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+potassium+channel+gene+therapy+in+a+rodent+model+of+focal+neocortical+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy.</a> Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).</li>
<li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+optogenetics%3A+a+decade+of+enlightenment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cardiac function.</a> Science. 330 (6006), 971-974 (2010).</li>
<li>Nussinovitch, U., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+for+in+vivo+cardiac+pacing+and+resynchronization+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).</li>
<li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+hybrid+bioelectronic+system+for+autogenous+restoration+of+sinus+rhythm+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation.</a> Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li>
<li>Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+identification+of+genes+causing+adult+human+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).</li>
<li>Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affecting+rhomboid-3+function+causes+a+dilated+heart+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila.</a> PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).</li>
<li>Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+heart+function+in+larval+Drosophila+melanogaster+for+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1596(2009).</li>
<li>Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+effects+on+Drosophila+larva+hearts%3A+Room+temperature%2C+acute+and+chronic+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+B%2C+Biochemical%2C+Systemic%2C+and+Environmental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress.</a> Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+Drosophila+heart+rate+at+different+temperatures+and+Ca2%2B+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations.</a> Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).</li>
<li>Malloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+assess+neuroendocrine+modulation+of+heart+rate+in+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).</li>
<li>Men, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+preparation+and+longitudinal+imaging+of+heart+function+in+vivo+using+optical+coherence+microscopy+%28OCM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM).</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).</li>
<li>Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+adult+Drosophila+melanogaster+heart+with+real-time+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography.</a> Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+expression+of+the+Alzheimer%27s+disease-associated+presenilin+gene+in+drosophila+heart+leads+to+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction.</a> Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+in+heart+leads+to+cardiac+dysfunction+as+detected+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).</li>
<li>Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+red-light+optogenetic+control+of+Drosophila+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function.</a> Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+pacing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster.</a> Science Advances. 1 (9), 1500639(2015).</li>
<li>Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chloride+flux+on+Drosophila+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The effects of chloride flux on Drosophila heart rate.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 73(2019).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+melanogaster%22">The Genome of Drosophila melanogaster</a>. , Elsevier. (1992).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html</a> (2022).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyNet+2.0%3A+Drosophila+heart+3D+%282D+%2B+time%29+segmentation+in+optical+coherence+microscopy+images+using+a+convolutional+long+short-term+memory+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network.</a> Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li>
<li>Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-synthetic%2C+general-purpose+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).</li>
<li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2019+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 139 (10), 56(2019).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).</li>
<li>Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+homology+between+Drosophila+melanogaster+and+vertebrate+cardiovascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).</li>
<li>Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assess+Drosophila+heart+development%2C+function+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%5BSupplement+to+Methods+in+Enzymology%5D%22%5BJournal%5D)">Methods to assess Drosophila heart development, function and aging.</a> Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">On the morphology of the Drosophila heart.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15(2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בהשוואה לדוחות הקודמים שלנו שבהם הביטוי של אופסינים הונע לא רק בלב אלא גם ברקמות השריר שמסביב, העבודה הנוכחית מדווחת באמצעות נהג ספציפי ללב, Hand-GAL4. תצורה גנטית חדשה זו של אופסין > היד המשמשת לוויסות לב אופטוגנטי מאשרת עוד יותר את התוצאות שדווחו בעבר ומבססת מודל מחקר לב וכלי דם דרוזופילה טוב יותר.
הכנת המדיה חיונית להצלחת הניסויים. חלבוני אופסין זקוקים לליגנד, רשתית כל-טרנסית (ATR), כדי לתפקד28. זבובים אינם מייצרים מספיק ATR, ולכן יש להשלים את ATR למדיית הזבובים. במחקר זה, המזון המיידי שדווח בעבר הוחלף במדיה מוגדרת למחצה29. המתכון החדש של מדיה המכילה ATR הוצג כדי להבטיח הפצה אחידה של ATR. ATR אינו מסיס במים; כאשר מלאי ATR מבוסס אתנול של 100 mM מתווסף למדיה מבוססת מים, הוא מתפזר על ידי מערבולת הבקבוקונים המכילים מדיה חמה מוגדרת למחצה. כמו כן, ריכוז ה-ATR שדווח קודם לכן הופחת מ-10 mM עבור eNpHR2.0 ו-3 mM עבור ReaChR22 לריכוז סופי של 1 mM עבור שניהם. ריכוז זה מספיק כדי להבטיח תפקוד תקין של eNpHR2.0 ו-ReaChR.
מרכיב חיוני בהצלחת הניסוי הוא עיבוד הנתונים המשופר עם FlyNet 2.027. המעבדה המשיכה לפתח תוכנה זו כדי לשפר הן את היעילות החישובית והן את הדיוק של אלגוריתם סגמנטציה אוטומטי של לב זבוב. מסכות החתך המיוצרות על ידי תוכנה זו משמשות לגזירת נתונים פיזיולוגיים של Drosophila כגון קיצור שברים ומהירות דופן הלב. גישה זו אפשרה ניתוח נתונים יעיל עם פיקוח אנושי מינימלי, מה שהופך את זה מהיר ואמין יותר לאפיין את תפקוד הלב עבור מערכי נתונים של הדמיית לב זבוב גדול.
אוטם שריר הלב נותר הגורם המוביל למוות, ואיסכמיה שריר הלב תורמת לשני שלישים מכלל המקרים של אי ספיקת לב, אשר מתגלה במהירות בין הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בארצות הברית30. פיתוח טיפולים ומכשור רפואי חדשים דורש היכרות מעמיקה עם המנגנונים של הפרעות לב ברמה הפיזיולוגית והביוכימית. מטרות אלה יכולות להיות מושגות בעזרת אורגניזמים מודל. D. melanogaster ביססה את עצמה כאחד הדגמים האמינים והיעילים ביותר 31,32,33,34,35. עבודה זו יצרה את המודלים המדומים של הפרעות לב דרוזופילה המושרים על ידי גישה אופטוגנטית לא פולשנית. הפיתוח של טכנולוגיות קצב לב אופטיות לא פולשניות מספק בסיס לפיתוח חלופה למכשירי קצב לב חשמליים מסורתיים. שימוש ב-OCT כדי לבחון את תפקוד הלב בזמן אמת מאפשר למחקרים לאפיין במדויק פיזיולוגיה רלוונטית של הלב במודלים של דרוזופילה למחקרים מתקדמים, כולל סינון מועמדים לתרופות. להדמיית OCT יש עומק חדירה של ~ 1 מ"מ, מה שעובד היטב עבור מחקרי לב Drosophila אך מגביל את השימוש בו כדי לאפיין את תפקוד הלב במודלים גדולים יותר של בעלי חיים. יתר על כן, תרגום ישיר של מחקר דרוזופילה למודלים של יונקים מהווה אתגר. יש לפתח כלים אופטוגנטיים חדשים כדי לשפר את רגישות האופסינים ולתרגם אותם למערכות מודל שונות, כולל דגי זברה, עכברים, חולדות ואורגנואידים של לב האדם, לצורך מחקר קרדיווסקולרי.

בסוף שנת 2010, כתב העת Nature Methods בחר באופטוגנטיקה כשיטת השנההראשונה. שימוש בכלים גנטיים (אופסינים מהונדסים) המווסתים על ידי אור כדי לשלוט ברקמות ביולוגיות מעניינות בדיוק ובמהירות חסרי תקדים פתח שער הצפה ליישומים חדשים. עד כה, רוב ההישגים שייכים למדעי המוח. הטכנולוגיה הוצגה כשיטה חדשה לשליטה מדויקת בנוירונים בודדים2 והתקדמה לתגליות בתחום התפקודים הקוגניטיביים של אורגניזמים חיים3. מלכתחילה, מדעני מוח הדגימו את היכולת לווסת את התנהגות האורגניזם כולו. ביטוי והפעלת אור של ChR2 opsin בעכברים נוירונים דופמינרגיים גרמו להפעלה שלהם והספיקו כדי להניע התניה התנהגותית4. עיכוב אופטוגנטי של תת-קבוצה של נוירונים המכילים הלורהודופסין NpHR2.0 שהועבר למוקד האפילפטי של מוח המכרסמים הביא להנחתה של התקפים אלקטרואנצפלוגרפיים5.
יישומים אופטוגנטיים בקרדיולוגיה מתפתחים בקצב קבוע6. ChR2 התבטא בהצלחה בתרבית תאים קרדיומיוציטים ובעכברים; קצב הלב נערך על ידי הבזקי אור כחול (שבוצעו באמצעות סיב מושתל בבעלי חיים חיים)7. בדגי זברה, ChR2 בא לידי ביטוי ושימש לזיהוי אזור הלב שעושה את הקצב; הפעלת NpHR גרמה לדום לב8. לקצב הלב האופטוגנטי יש פוטנציאל ייחודי לפיתוח טיפולי קצב וסינכרון מחדש חדשים9. לאחרונה דווח גם על ניסיונות להקים מערכת אוטוגנית להפסקת הפרעות קצב10.
מחקר מקיף ופיתוח טיפולים טיפוליים חדשים מחייבים יישום של מערכות מודל שונות, מתרבית תאים ועד יונקים. לב של בעל חוליות הוא איבר מורכב מאוד. קרדיומיוציטים (CM) מהווים שליש מכלל תאי הלב; תאים אחרים כוללים נוירונים, תאי שריר חלק וסקולריים ותאים שאינם מעוררים (כלומר, תאי אנדותל, פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון). חקר תרבית תאי CM מגביל את תרגום התוצאות המתקבלות ליישומים רפואיים אנושיים. המניפולציות הגנטיות של אורגניזמי מודל יונקים מוגבלות וגוזלות זמן רב. למודלים קטנים יותר של חסרי חוליות יש יתרונות רבים; מערכת הלב וכלי הדם שלהם נושאת את כל האלמנטים ההיסטולוגיים החיוניים. Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) היא מערכת מודל גנטית פשוטה ורבת עוצמה לחקור את תפקידם של גנים הקשורים למחלות אנושיות, כולל מחלות לב11,12,13. כבעלי חיים קצרי מועד, זבובי פירות מהווים הזדמנות מצוינת לדמות שינויים בתפקוד הלב התלויים בגיל או במחלות שניתן לעקוב אחריהם במהלך החיים14,15,16,17. צינור הלב של זבוב הפירות ממוקם בצד הגבי של גופו בטווח של 200 מיקרומטר מפני השטח של הקוטיקולה, מה שמאפשר לאור הנראה לעין כמעט אינפרה-אדום להגיע לצינור הלב. תכונה אנטומית זו מאפשרת קצב אופטי לא פולשני של הלב Drosophila באמצעות כלים אופטוגנטיים קיימים.
כדי לנטר את הלב Drosophila, פותחה מערכת הדמיה מותאמת אישית של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי (SD-OCT) עם מודול עירור LED משולב של אור אדום18. שינויים מורפולוגיים וקצביים בלב זבוב פירות פשוט יחסית ניתנים לניתוח בקלות באמצעות טכנולוגיית הדמיה ביו-רפואית לא פולשנית זו 12,19,20,21. עם ביצועי חתך אופטי משופרים ורזולוציה מרחבית בקנה מידה מיקרוני, OCT שימש בהצלחה כדי לחקור את המבנה ולנטר את תפקוד הלב Drosophila בשלבים התפתחותיים שונים, כולל הזחל השלישי כוכב ו pupa18 מוקדם. מערכת זו מאפשרת גם ניטור וגירוי בו זמנית של מצב הלב של הדרוזופילה בבעל החיים השלם. תצוגה סכמטית של מערכת OCT מוצגת באיור 1. מערכת SD-OCT משתמשת בדיודה סופרלומינסנטית (SLD) כמקור האור (אורך גל מרכזי: 850 ננומטר ± 10 ננומטר, FWHM: 165 ננומטר, ראו טבלת חומרים). באמצעות עדשה אובייקטיבית של 10x, מערכת ההדמיה OCT יכולה להשיג רזולוציה צירית של ~4.4 מיקרומטר באוויר ו~3.3 מיקרומטר ברקמה ורזולוציה רוחבית של ~2.8 מיקרומטר, מספיק כדי לפתור פרטים עדינים של מבני לב הזבוב18,22. אותות הפרעה של אור מוחזר מזרוע הייחוס ומזרוע הדגימה מזוהים באמצעות ספקטרומטר עם מצלמת סריקת קו של 2048 פיקסלים (קצב קו מרבי: 80 קילוהרץ, ראה טבלת חומרים). רגישות המערכת הנמדדת היא ~ 95.1 dB. כל סריקת OCT במצב B יוצרת תמונת חתך במישור התמונה xz. תמונות חוזרות במצב B נרכשות באותו מיקום כדי ליצור תמונות במצב M הלוכדות את הלב הפועם במשך יותר מ- ~30 שניות 18,22,23. קצב הפריימים להדמיה במצב M הוא ~ 125 פריימים לשנייה, מספיק כדי ללכוד את הדינמיקה הפועמת של לב זבוב הפירות.
לצורך ויסות אופטוגנטי של תפקוד הלב Drosophila , מודול תאורה עם מקור אור LED 617 ננומטר משולב עם זרוע הדגימה של מערכת SD-OCT. אור הגירוי מתמקד בנקודה בקוטר ~2.2 מ"מ על משטח הדגימה, באותו מיקום כמו נקודת המיקוד של ההדמיה. תוכנה שנכתבה בהתאמה אישית משמשת לשליטה במצב התאורה (עוצמת האור, רוחב הפולס ומחזור העבודה), התאמת תדר גירוי פולס האור וסנכרון תאורת מודול ה-LED ורכישת הדמיית OCT במצב M22.
פרסומים אחרונים תיארו את המערכת המהונדסת Drosophila המורכבת מ-ChR2, ReaChR ו-eNpHR2.0 אופסינים המווסתים באופן מרחבי-טמפורלי באמצעות המערכת הגנטית UAS/GAL4. התוצאות שהתקבלו הדגימו את היכולת ליזום דום לב וברדיקרדיה הנגרמת על ידי הפעלת אור אדום של eNpHR2.0 וקצב לב בתדר גבוה יותר הנגרם על ידי הפעלת אור כחול של ChR2. ניסויי קצב דומים בוצעו עם ערוץ אחר, ReaChR, הניתן להשראה על ידי תאורת אור אדום22,23,24. ביטוי האופסין בכל הניסויים המתוארים הונע על ידי 24B-GAL4, שבו ביטוי אופסין נצפה במגוון רחב של רקמות, כולל קרדיומיוציטים ותאי שריר מסביב. במחקר הנוכחי, 24B-GAL4 הוחלף על ידי נהג Hand-GAL4 כדי להשיג ביטוי אופסינים eNpHR2.0 ו-ReaChR ספציפיים ללב.
בסך הכל, תוצאות הניסוי שהוצגו מדגימות דום לב ברדיקרדיה וטכיקרדיה הניתנים לשחזור ומחלות לב של ברדיקרדיה וטכיקרדיה. פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב ליצירת מודלים של Drosophila מהונדסים וביצוע הדמיית OCT בו זמנית וניסויי קצב אופטוגנטיים בבעלי חיים מסופק.

<table><tbody><tr><td>All-trans retinal</td><td>Cayman Chemicals</td><td>18449</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>02-10-2025</td><td></td></tr><tr><td>מודול בקרת מקור אור BioLED,</td><td>מערכות Migtex</td> 4 ערוצים <td>BLS-SA04-US</td><td>חלק ממודול הגירוי האופטוגנטי</td></tr><tr><td>מודול מקור אור בפס רחב</td><td>Superlum</td><td>cBLMD-T-850-HP</td><td>חלק ממערכת ההדמיה SD-OCT</td></tr><tr><td>Cobra-S ספקטרומטרים של 800 OCT</td><td>&nbsp; Wasatch Photonics</td><td>CS800-840/180-80-OC2K-U3</td><td>חלק ממערכת ההדמיה SD-OCT</td></tr><tr><td>מגבי משימות עדינים</td><td>Kimberly-Clark Professtional</td><td>34155</td><td>רקמות</td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי תרבית דרוזופילה</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-131</td><td></td></tr><tr><td>FlyNet 2.0 Software</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>תוכנה מותאמת אישית לפילוח לב זבוב וניתוח תפקודי לב שפותחה במעבדת ג'ואו</td></tr><tr><td>מקורות קולימטור LED בעוצמה גבוהה</td><td>Migtex Systems</td><td>BLS-LCS-0617-03-22</td><td>חלק ממודול הגירוי האופטוגנטי</td></tr><tr><td>שמרים יבשים לא פעילים</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>AmScope</td><td>BS-72P</td><td></td></tr><tr><td>תקעים צרים לתרבית דרוזופילה</td><td>Genesee מדעי</td><td>59-200</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים צרים לתרבית דרוזופילה</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי קבוע</td> תקעי <td>סקוטש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לבקבוקי דרוזופילה</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-194</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>Sigma</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT תוכנת בקרה</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>תוכנה מותאמת אישית לרכישת תמונות ובקרת קוצב שפותחה במעבדת ג'ואו</td></tr><tr><td>הדמיה SD-OCT ומערכת קוצב אופטוגנטית</td><td>Z-Lab</td><td></td><td>Imaging ומערכת קוצב אופטוגנטית שפותחה במעבדת ג'ואו (~$50k BOM)</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>קרולינה</td><td>89-2871</td><td></td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר (BDSC)</td><td>stock # 41752</td><td>eNpHR2.0 קו טרנסגני</td></tr><tr><td>w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר (BDSC)</td><td>stock # 53748</td><td>ReaChR קו טרנסגני</td></tr><tr><td>w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>stock # 48396</td><td>דרייבר GAL4 ספציפי ללב המכיל שבר רגולטורי של גן יד</td></tr><tr><td>y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3</td><td>בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר (BDSC)</td> <td>מלאי #6658</td><td>GFP קו</td></tr><tr><td>כתב תמצית שמרים</td><td>מעבדה מדעית bioKEMIX</td><td>978-907-4243</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח מודלים דרוזופילה מלנוגסטר להדמיה ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב

Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function

השימוש ב-Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) כאורגניזם מודל הבטיח התקדמות משמעותית בתחומים רבים של מדע הביולוגיה, החל מארגון תאים וחקירות גנומיות וכלה במחקרים התנהגותיים. בשל הידע המדעי המצטבר, בשנים האחרונות הובאה דרוזופילה לתחום מידול מחלות אנושיות, כולל הפרעות לב. העבודה המוצגת מתארת את המערכת הניסיונית לניטור ומניפולציה של תפקוד הלב בהקשר של אורגניזם חי שלם באמצעות אור אדום (617 ננומטר) וללא הליכים פולשניים. שליטה על הלב הושגה באמצעות כלים אופטוגנטיים. אופטוגנטיקה משלבת את הביטוי של אופסינים מהונדסים רגישים לאור ואת ההפעלה האופטית שלהם כדי לווסת את הרקמה הביולוגית המעניינת. בעבודה זו, נעשה שימוש בהדמיית טומוגרפיה אופטית משולבת מותאמת אישית (OCT) ובמערכת גירוי אופטוגנטית כדי להמחיש ולווסת את הלב המתפקד D. melanogaster בשלבי ההתפתחות של זחל הכוכב השלישי ובשלבים ההתפתחותיים המוקדמים של הפופאל. המערכת הגנטית הכפולה של UAS/GAL4 שימשה לביטוי הלורהודופסין (eNpHR2.0) ותעלה בהזזה אדומה (ReaChR), במיוחד בלב הזבוב. פרטים על הכנת D. melanogaster להדמיית OCT חיה וקצב אופטוגנטי מסופקים. תוכנת אינטגרציה שפותחה במעבדה עיבדה את נתוני ההדמיה כדי ליצור מצגות חזותיות ומאפיינים כמותיים של תפקוד הלב של דרוזופילה . התוצאות מדגימות את ההיתכנות של ייזום דום לב וברדיקרדיה הנגרמים על ידי הפעלת eNpHR2.0 וביצוע קצב לב עם הפעלת ReaChR.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של Drosophila melanogaster המבטא eNpHR2.0 או ReaChR opsins בלב עבור הדמיית OCT וקצב לב אופטוגנטי. מדווחות הוראות מפורטות להדמיית Drosophila OCT ואפנון פעימות לב, כולל סימולציה של דום לב בר-שחזור, ברדיקרדיה וטכיקרדיה בבעלי חיים חיים בשלבי התפתחות שונים.

Using Drosophila melanogaster (fruit fly) as a model organism has ensured significant progress in many areas of biological science, from cellular ...

הפרוטוקול מציג מודלים של דרוזופילה שבהם ניתן לאפיין את תפקוד הלב ולשלוט בו באמצעות אור. זה מאפשר לחוקרים לחקור מחלות לב אנושיות בדרוזופילה באמצעות בעלי חיים שלמים. שיטה זו יכולה להשיג באופן אמין הדמיית OCT לא פולשנית ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב Drosophila.יש לו יעילות ואיכות גבוהות. קצב אופטוגנטי יכול להיות חלופה לקצב חשמלי כטיפול לטיפול בהפרעות קצב. ניתן להרחיב את הדמיית ה-OCT והקצב האופטוגנטי למערכות מודל אחרות כמו אורגנואידים של הלב, דגי זברה וגרון ולב.כדי להתחיל, שלב חמש ידיים GAL4 מעל TM6 נקבה בתולה בעלת צינורות כפולים ושניים עד שלושה זבובים זכרים מ- UAS Ops ו- Stocks לכל בקבוקון. למחרת, הכינו מזון מוגדר למחצה על פי הוראות מרכז המניות דרוזופילה בבלומינגטון על ידי הוספת 5.14 גרם לכל 100 מיליליטר סוכרוז למיכל על צלחת חמה. ואז מגניב אותו ל 60 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד.לאחר מכן, הכינו בקבוקוני זבוב צרים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של תמיסת אתנול רשתית של 100 מילימולר לכל בקבוקון. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להיפטר מחמישה מיליליטר של מזון זבובים לכל זבוב צר. לאחר מערבולת במהירות מקסימלית למשך 10 שניות, חברו את הבקבוקונים הללו ועטפו אותם בבד הכהה כדי להגן עליהם מפני אור.למחרת, העבירו את הזבובים בהתמדה ומטילים ביצים לבקבוקונים עם אתנול רשתית כל-טרנס המכיל מזון. הגן על המדפים באמצעות בקבוקונים מפני אור. לאחר 24 עד 48 שעות, בהתאם למספר הביצים המוטלות, יש להשליך את ההורים כדי למנוע ריבוי יתר של בקבוקונים.לאחר מכן, לאסוף צאצאים שאינם טובי להדמיית לב. בחרו זחל GAL4 או גולם של כטב"מים מהבקבוקון, הניחו אותו על טישו ונגבו בעדינות את המדיה ממשטח הגוף באמצעות מברשת צביעה. הכינו את שקופית המיקרוסקופ עם חתיכה קטנה של סרט דו-צדדי באמצע.לאחר מכן, הניחו בעדינות את הזחל או הגולם על משטח הטייפ כשהצד הגבי למעלה ובניצב לצד הארוך של המגלשה באמצעות מברשת או פינצטה עדינה. הפעילו לחץ עדין כדי להצמיד את הזחל או הגולם לפני השטח של הסרט. כעת, הגדר את השקופית על שלב ההדמיה כאשר הזחל או הגולם פונים כלפי מטה והפעל את טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית או מקור אור OCT על ידי תוכנת בקרת לייזר.פתח את תוכנת בקרת OCT של התחום הספקטרלי הכתוב בהתאמה אישית. לאחר מכן, לחץ על חלון התצוגה המקדימה. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי הסריקה בתוכנת OCT של התחום הספקטרלי.השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי לשלוט בשלב הדגימה כדי להביא את לב הזבוב למיקוד. התאם את מיקום המוקד כדי למזער את השתקפות האור ממשטח הקוטיקולה של הזבוב. כמו כן, שקול למרוח שמן מינרלי על פני הזחל או הגלמים כדי למזער את ההשתקפות.לאחר מכן, הגדר את פרמטרי הסריקה עבור רכישת תמונה OCT במצב M וקבל חמש קבוצות של נתוני בקרה ללא פולסים של גירוי אור אדום כדי לחשב דופק במנוחה. תכנן את פעימת האור עבור גירוי הקצב בתוכנת בקרת OCT המותאמת אישית. לשם כך, לחץ על כרטיסיות ההגדרות והוסף את רצפי פולס האור המתוכננים כדי לשלוט בתדר הדופק, רוחב הדופק, משך הגירוי וזמן ההמתנה על פי פרוטוקולי גירוי שונים.לאחר מכן פתח את תוכנת בקר האור כדי ליצור פולסים של אור אדום. בחרו את מצב הדופק בבחירת המצב. לחצו פעמיים על הדמות עבור הגדרות פרופיל הדופק, ובחרו במצב עוקב.שמור את העוצמה כבויה על אפס והגדר את אחוז העוצמה בעת חישוב צפיפות ההספק בפועל. רכוש קטעי וידאו במצב M של הלב Drosophila הפועם עם גירוי קל על ידי לחיצה על לרכוש בתוכנת בקרת OCT. תעדו הבזקים של אור אדום במורד לב הזבוב במהלך רכישת ההדמיה.שים לב שנדרשות הגדרות קצב שונות כדי לשלוט בתפקוד לב הזבוב באמצעות דגמי זבוב של צ'אנרהודופסין ו-NPHR עם הזזה לאדום. פתח את תוכנת פילוח לב הזבוב שפותחה בהתאמה אישית ולחץ על קובץ נבחר. לאחר מכן בחר את הקובץ לניתוח בממשק המשתמש הגרפי.הזינו את הגבולות האנכיים והאופקיים של אזור הלב בפיקסלים בתיבות המלל העליונות. לחץ על שינוי גודל. באמצעות המחוון בתחתית, ודא שכל אזור הלב גלוי ושהוא ממלא את כל הקופסה עבור האוסף כולו.לאחר לחיצה על לשונית החיזוי, התוכנית תעבור על כל פרוסה באוסף ותבחר את אזור הלב תוך כשלוש דקות. לאחר השלמת החיזוי, לחץ על עלילת משאבי אנוש כדי להציג תרשים של אזור הלב לאורך זמן בחלון חדש. בחר את אזורי הפסגה או העמק הנכונים, בחר את הדופק ולאחר מכן כרטיסיות HR כדי ליצור נתון סופי.הפרמטרים הפונקציונליים יישמרו בו זמנית בקבצי ה- CSV. ספציפיות הרקמה של דרייבר GAL4 ביד אומתה על ידי הדמיה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק. תמונות OCT טיפוסיות של חתך גוף זחל ופופאל מוצגות כאן.כדי לחקות מצבי לב שונים, תוכננו ארבעה סוגים של פולסים קלים. פעימה בודדת שנמשכה 10 שניות לאחר חמש שניות של זמן המתנה, יצרה דום לב בר-שחזור. עבור קצב הלב בתדרים נמוכים יותר מקצב הלב במנוחה, נעשה שימוש בשני רצפי פולסים קלים עם תדרי קצב השווים למחצית מקצב הלב במנוחה, ורבע מהדופק במנוחה שנמשך שמונה שניות עם זמן המתנה של שש שניות בין לבין.דפוס הגירוי להגברת קצב הלב עקב הפעלת channelrhodopsin בהסטה אדומה כלל שלושה רצפים של פולסים קלים. תדירות התכווצות הלב המופחתת בעקבות אותות האור גרמה לקצב לב איטי יותר המחקה זחלים וגלמים. סדרה של שלוש רכבות פולסים קלות בתדרי גירוי שונים הופעלה על זחלים וגלמים הראו בבירור קצב לב מוגבר בעקבות פולסים קלים.בחירת ההכנה של צאצא נכון, הרכבה של הדגימה, והליך הדמיה הם חיוניים. אנו מקווים להעביר את טכנולוגיית הקצב האופטוגנטי למודלים גדולים יותר של בעלי חיים, לחקור מחלות לב של יונקים ולחקור גישות טיפוליות חדשות לטיפול בהפרעות קצב.

developing-drosophila-melanogaster-models-for-imaging-optogenetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל...

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

טכניקה נדרש לדמיין את הלב הפועם של הזחל...

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

אנו מציגים דרכים שונות כדי לפקח על תפקוד הלב של...

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא...

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה בשלבי התפתחות שונים וביצוע הדמיה אופטית אורכית של פעימות הלב של דרוזופילה באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית מותאמת אישית (OCM). ניתן לאפיין את השינויים המורפולוגיים והדינמיים הלבביים באופן כמותי על ידי ניתוח הפרמטרים המבניים והתפקודיים של הלב מתמונות OCM.

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

עבודה זו מדווחת על שיטה לשליטה בקצב הלב של לבבות מורין שלמים של עכברי channelrhodopsin-2 מהונדסים (ChR2) באמצעות פוטוסטימולציה מקומית עם מערך מיקרו-LED ומיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל קרום הלב.

ניהול מתקדם של קצב הלב על ידי יישום פוטו-גירוי אופטוגנטי מרובה אתרים בלבבות מורין

פרוטוקול חתך הלב וההדמיה הקרינה של דרוזופילה מפשט את חקר מבנה הלב והפתולוגיות. גישה זו כוללת חתך, צביעה והדמיה פשוטים, תוך עקיפת המומחיות הטכנית הדרושה לנתיחה מסורתית. זה משפר את הנגישות, מה שהופך את הדרוזופילה למודל שמיש יותר למחקר הקשור ללב בקרב הקהילה המדעית הרחבה יותר.

שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

למדו שיטת דימוי OCT ושליטה אופטוגנטית בלב Drosophila melanogaster. טכניקה זו מאפשרת הדמיה לא פולשנית ודירוג לב אופטי לחקר מחלות לב וטיפול בהפרעות קצב.

פיתוח מודלים דרוזופילה מלנוגסטר להדמיה ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב

גלה סרטונים נוספים