Name: הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים באמצעות MAP65 ו-PEG. פרוטוקול זה מאפשר חקר ארגון מיקרוטובולים ומספק מודל ללימוד תאי מיטוטי ומערכות ביולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת רוס בקיץ 2021, במיוחד ק. אליס לינדזי, על עזרתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NSF BIO-2134215 שתמך בס 'סאהו, נ' גודבי, ה.ב. לי וג'.ל. רוס. מענק מקרן KECK (ריי אנדרסון, USD, lead PI) תמך באופן חלקי בר' סניף וב-P. Chauhan

<ol><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins%3A+structuring+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li>
<li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li>
<li>Brugués, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+spindle+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li>
<li>Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li>
<li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li>
<li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmin%3A+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li>
<li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li>
<li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li>
<li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li>
<li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChaikin%2C+PM+%22Principles+of+Condensed+Matter+Physics%22">Principles of Condensed Matter Physics</a>. , Cambridge University Press. (1995).</li>
<li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).</li>
<li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions%3A+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li>
<li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li>
<li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li>
<li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth%2C+nucleation%2C+and+bundle+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).</li>
<li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li>
<li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+Ase1%2FPRC1%2FMAP65+family+in+central+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li>
<li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+for+Bundling+Microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li>
<li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li>
<li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li>
<li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li>
<li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li>
<li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li>
<li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).</li>
<li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+MAPs%2C+and+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li>
<li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022).</li>
<li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903(2021).</li>
<li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+and+testing+of+a+new%2C+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme%2C+katanin+p60%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li>
<li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li>
<li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li>
<li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li>
<li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+katanin%2C+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטות המתוארות כאן שימשו בכמה מאמרים ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים (איור 2)22,28. ניסויים אלה רלוונטיים מבחינה ביולוגית כדי לסייע בחשיפת העקרונות הארגוניים השולטים בצורה וביציבות של הציר המיטוטי או המיוטי ברוב סוגי התאים. בנוסף, מיקרוטובולים הם מזוגנים של גבישים נוזליים לדוגמה שיכולים לסייע בלמידה נוספת על האופן שבו גבישים נוזליים מגרגרים ומגדלים פאזות נמטיות משלבים איזוטרופיים.
להליך המתואר כאן יש מספר יתרונות לחקר ארגון עצמי של מיקרוטובולים. ראשית, הוא ניתן לשחזור רב, לאחר שבוצע במעבדה על ידי תלמידים רבים, כולל תלמידי תיכון, עם מעט ידע או הכשרה לפני תחילתו במעבדה. הטקטואידים הם דו-פרצופיים22, מה שמאפשר לצפות בהם באור מועבר בנוסף למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שהופך את השיטה הזו לנגישה למעבדות רבות ולהליך הניסויי הזה הניתן להתאמה למטרות חינוכיות, בנוסף למחקר מתקדם. לבסוף, תהליך זה פותח אפיקים להמשיך להבין ולחקור מערכות ביולוגיות בגישה רדוקציוניסטית מופשטת, ומאפשר להבין כיצד כל מצב, חלבון או תוסף נוסף יכול לשנות את הארגון העצמי של הטקטואידים, ואולי, בסופו של דבר, את הציר. מטרות לביומימיקריה טובה יותר כוללות פעילות, נזילות ומיון קוטביות נימה.
יכולים להיות מספר גורמים המשפיעים על הניסוי ומעניקים תוצאות בלתי צפויות. לדוגמה, אם הטקטואידים אינם נוצרים (איור 2) אך נצפים דפוסים דמויי מניפה, סביר להניח שה-MAP65 אינו קיים או אינו נקשר למיקרו-טובולים22,28. זה צריך להיות ברור גם בערוץ הפלואורסצנטי MAP65 מכיוון שה-GFP-MAP65 לא יהיה קשור למיקרוטובולים.
אם הטקטואידים לא נוצרים והרקע מופיע ככתמים על הזכוכית, זה יכול להיות בגלל ציפוי פני השטח. לאחר ביצועו, הסילאניזציה נמשכת חודש אחד בלבד על כיסויים. כאשר הוא מתפוגג, הטובולין יוכל להיקשר למשטח החשוף באופן לא ספציפי. כריכה זו תתרחש בדפוסים מוזרים.
אם הטקטואידים אינם נוצרים והטובולין נצפה באגרגטים של צורות וגדלים שונים, זה יכול להיות בגלל טובולין באיכות ירודה. טובולין יכול להיות צנטריפוגה כדי להסיר אגרגטים ראשוניים שיכולים להניע את הצבירה הזו מחוץ למסלול במקום פילמור מיקרוטובולים. אם המשטח נקשר לטובולין, הוא יכול גם לרוקן את הטובולין בתמיסה. ריכוזים נמוכים של טובולין, מתחת לריכוז הקריטי לפולימריזציה של מיקרוטובולים, עלולים לגרום לאגרגטים.
בניסויי FRAP, אם ערוץ MAP65 אינו מראה התאוששות כלשהי (איור 5), ייתכן שהלבנת הצילום צילמה את המיקרו-טובולים. Photodamage גורם להרס מקומי של החוטים. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה בערוץ המועבר. טקטואידים של מיקרוטובולים נראים בתעלה המועברת דרך אינדקס גבוה של אי התאמה של אי-התאמה לשבירה עם המים שמסביב. פוטו-דמה המושרה על-ידי אור יופיע כסימן צריבה או אובדן ניגודיות בהדמיית אור מועברת במיקום ההחזר על ההשקעה הנתונה להלבנת תמונות. אם זה קורה, יש להפחית את כוח הלייזר או האור כדי לעכב את הפוטו-דמה של החלבונים.
היו מספר אתגרים שנתקלו בהם בהליך ובגישה זו. בעיה אחת היא שמדדי האורך מבוצעים כעת ביד על ידי לחיצה על התמונה. שיטה זו, למרות שהיא פשוטה, עלולה לגרום לאי-ודאות גבוהה. מדידת הרוחב המשתמשת בחתך הרוחב ומתאימה לגאוס היא שיטה טובה יותר לכימות הגודל. ניתן להשתמש בשיטה דומה לאורך. בעיה שנייה היא שלפעמים, הטקטואידים, בגלל שהם כל כך ארוכים ודקים, יכולים להתכופף. זה הופך את כימות האורך לקשה יותר. ניתן לכמת את אורך קווי המתאר באמצעות קו מקוטע, אך יש אי-ודאות נוספת בכל פעם שמוסיפים מקטע.
מנקודת מבט מדעית, לגישה זו יש כמה אתגרים אחרים לשימוש בה כמודל לגבישים נוזליים או צירים. האתגר הראשון היה הצורה הארוכה והדקה של הטקטואידים שהמיקרוטובולים יוצרים (איור 3 ואיור 4). כפי שצוין בפרסומים קודמים22, טקטואידים מיקרוטובולים הם טקטואידים הומוגניים, לא דו קוטביים. משמעות הדבר היא שהמיקרוטובולים המרכיבים את הצורה אינם מכוונים מחדש כדי להצביע לעבר קצות המבנה. במקום זאת, כל המיקרוטובולים מקבילים לציר הארוך וה"קטבים" ממוקמים באינסוף. זה שונה מאוד מהטקטואידים שנצפו לגבישים נוזליים מולקולריים או אפילו לאקטין או דנ"א שיכולים לשמש גם כמזוזנים גבישיים נוזליים. במערכות אחרות אלה, הטקטואידים הם דו קוטביים, וכאשר מסתכלים עליהם בקטבים חצויים, הם מראים את הסימנים המובהקים של כיוון מחדש של המוטות.
אתגר מרכזי נוסף במערכת זו הוא שהמיקרוטובולים אינם משותקים בתוך הטקטואיד. זה ברור מניסויים וניתוחים של FRAP מכיוון שההתאוששות של המיקרוטובולים נמוכה מאוד. האופי המוצק שלהם הופך את הטקטואידים של המיקרוטובולים לפחות בעלי ערך כמו אנלוגים של גבישים נוזליים בקנה מידה גדול. הפאזה הנמטית של גביש נוזלי צריכה להיות בעלת תכונות נוזליות (נוזל) וקריסטליות (מאורגנות). למרות שהצורה נראית מתאימה לציר, חוסר התנועה הופך את המערכת לפחות מרגשת כציר מיטוטי מדגם. מצד שני, בעיה זו מספקת הזדמנויות לחקור כיצד ניתן לשנות את הניסויים כדי ליצור נזילות רבה יותר במערכת.
אתגרים מדעיים אלה מציעים הזדמנויות מרגשות שיאפשרו ידע חדש על המערכת. כדי להפוך את הטקטואידים המיקרו-טובולים לדו-קוטביים יותר, אפשר להשתמש במיקרו-טובולים קצרים יותר. עם זאת, יש אתגר נוסף, מכיוון שלמיקרוטובולים אין הרבה חלבוני מכסה מאופיינים היטב כדי לשלוט באורך כפי שעושה אקטין. השימוש בגרעין ובצמיחה דורש שימוש בריכוזים גבוהים מאוד של טובולין ו- GMPCPP כדי ליצור מיקרוטובולים קצרים. ריכוז טובולין גבוה גורם למספר גדול יותר של חוטים במערכת, מה שמקשה על הפרדת טקטואידים זה מזה. התוספת של כובעי מיקרוטובול חדשים, כגון DARPin33, עשויה לסייע במצב זה. את הבעיה השנייה של המיקרוטובולים להיות חסרי תנועה ניתן למתן על ידי תוספת של חלבונים מוטוריים, כגון kinesin-534, שהם טטרמרים של מנועים המשמשים מיטוזה. לחלופין, ניתן להשתמש בדמרים מלאכותיים של קינזין-1 דימרי15.
דרך נוספת להוסיף נזילות נוספת תהיה לאפשר למיקרוטובולים לבצע את חוסר היציבות הדינמית שלהם, את הגידול וההתכווצות של המיקרוטובולים. נכון לעכשיו, מיקרוטובולים שנזרעים עם חוטי GMPCPP יציבים ולאחר מכן עוברים חוסר יציבות דינמית הם הרבה יותר ארוכים מהרצוי כדי ליצור ציר או טקטואיד, מה שיגרום לארגונים ארוכים מאוד כמו מאווררים או חבילות. לכן, הוספת חוסר יציבות דינמית של מיקרוטובולים תצטרך להיעשות בזהירות כדי לשמור על הצורה הטקטואידית. תוספת של חלבונים ואנזימים נלווים שיכולים לשלוט באורך עשויה למתן בעיה זו. לדוגמה, סביר להניח שיהיה צורך בדה-פולימריזציה של קינזינים, כגון קינזין-1335, או ניתוק אנזימים, כמו קטנין36. ניסויים אלה מורכבים וקשים, אם כי הם יהיו בעלי תובנה רבה לא משנה מה התוצאות יחשפו. לא משנה לאיזה כיוון ילכו הניסויים העתידיים, הפלטפורמה שפותחה כאן ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים יכולה לחשוף מידע חדש על בסיס פיזיקלי של ארגון מיקרוטובולים.

חלוקת תאים באמצעות מיטוזה היא אחד התהליכים הביולוגיים החשובים ביותר לקיום חיים. חוטי המיקרוטובול, המורכבים מדימרים של טובולין, הם מרכיבים מבניים חיוניים של תהליך זה. המנגנון הארעי שנוצר במטפאזה כאשר הכרומוזומים מתיישרים במרכז התא נקרא הציר המיטוטי בשל צורתו, שהוא כמו ציר של נול המכוסה בחוטים (איור 1A). באורגניזמים רבים מבוסס היטב שמיקרוטובולים משמשים במטפאז כדי לדחוף ולמשוך כרומוזומים מרוכזים למרכז התא, ליישר אותם ולחבר אותם למיקרוטובולים שימשכו אותם זה מזה באנאפאזה (איור 1B,C). צורות הציר הן במיוזה (איור 1B) והן במיטוזה (איור 1C), שנוצרו ממיקרוטובולים חופפים רבים שאינם עטופים סביב הציר המרכזי כמו חוט אלא פועלים במקביל לממשק. יצירת מבנים מבוססי מיקרו-טובולים אלה דורשת חלבונים קשורים המקשרים קשרים זה לזה ואנזימים נלווים שיכולים לשמש כמנועים כדי לעזור לדחוף ולמשוך את הכרומוזומים1.
מחקרים על צירים מיוטיים הראו שהמיקרוטובולים קצרים, דינמיים וחופפים במערכים מקושרים 2,3,4,5,6 (איור 1Di). בשל הארגון הפיזי של המיקרוטובולים הקצרים האלה, הציר המיוטי דומה לטקטואיד גבישי נוזלי (איור 1E). ואכן, הודגם כי צירים מתלכדים ומתמזגים, כפי שניתן היה לצפות מטקטואידים של גבישים נוזליים5.
מחקרים רבים שראשיתם בשנות ה-60 של המאה ה-20 השתמשו בקיבוע, בקטעים סדרתיים ובמיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לקבוע כי ישנם שני סוגים של מיקרוטובולים בתוך הציר המיטוטי 7,8,9,10. הסוג הראשון נקרא מיקרוטובולים קינטוצ'ור, המחברים את מוט הציר לקינטוכור. הסוג השני נקרא מיקרו-טובולים אינטר-קוטביים או קוטביים, שגדלים מעבר לכרומוזומים וחופפים באזור האמצע (איור 1Dii)8,9,10. סוג שלישי נקרא מיקרוטובולים אסטרליים, שנמצאים מחוץ לציר ומחברים את הקטבים לקצה התא; ארגונים מיקרו-טובים אלה נמצאים מחוץ לתחום הדיון הנוכחי. לאחרונה נערכו מחקרים על האינטראקציה בין אוגמין6 לבין קומפלקס טבעות גמא-טובולין המשפיעים על מרכזי נוקלאציה של מיקרוטובולים, וכתוצאה מכך נוצר ציר מיטוטי עם מיקרוטובולים קצרים יותר כמו באיור 1D.
מאחר שמיקרו-טובולים ארוכים יותר מכפי שהם רחבים, עם יחס גובה-רוחב גבוה ונוקשות גבוהה, הם דומים לגרסאות מוגדלות של מולקולות גביש נוזלי. בפיזיקה של חומר רך, אטומים ומולקולות הוערכו באמצעות אינטראקציות מינימליות כדי להסיק את המנגנונים הפיזיקליים של מעברי פאזה, כולל נוקלאציה והמסת גבישים11. באופן דומה, מיקרוטובולים הם עצמים מזוקליים שהם גרסאות מוגדלות של מולקולות גבישיות נוזליות, מה שנותן תובנות על הפיזיקה של הדינמיקה של גבישים נוזליים, כולל נוקלאציה וצמיחה של הפאזות הנמטיות מאלו האיזוטרופיות. יתר על כן, כפי שפורט לעיל, הציר המיוטי מציג תכונות כמו אלה של טקטואיד גבישי נוזלי, מצב נמאטי שנובע וצומח מהמצב האיזוטרופי של מולקולות גבישיות נוזליות 3,4,5. עבור טקטואידים, נוקלאציה וצמיחה הם כמו של גבישים אחרים (כלומר, דורשים ריכוז גבוה יחסית של מזוגנים [המולקולות היוצרות גבישים נוזליים]). צורת ה"ציר" הייחודית של הטקטואיד מגיעה מהיישור המקומי של מזוגני הגביש הנוזלי שמתיישרים לפאזה הנמטית (איור 1E). הם אינם יכולים ליצור גביש מעוגל מכיוון שהמולקולות הן מאוד אסימטריות. בהתחשב באופיים של המיקרוטובולים, זה אולי לא מפתיע שמכונות הציר המיטוטיות העשויות מריכוז מקומי גבוה של מיקרוטובולים הן גם בעלות אותה צורה, בין אם הן נקראות טקטואיד או ציר. טקטואידים יכולים להיות דו-קוטביים, עם קטבים בקצוות המחודדים (איור 1Ei), או הומוגניים, עם קטבים ביעילות באינסוף (איור 1Eii).
בהתחשב בחשיבות של היווצרות צירים, נעשו מאמצים לקראת היווצרות צירים מאורגנת עצמית במבחנה על ידי הדגמת עיבוי מיקרוטובולים לתוך צרורות באמצעות מינים יוניים12,13, סוכני צפיפות היוצרים אינטראקציות דלדול14,15, וחלבוני קישור צולבים ספציפיים של מיקרוטובולים 13,16,17,18,19, 21. באופן מפתיע, למרות שסוכנים אלה כולם פועלים כדי להגדיל את הריכוז המקומי של מיקרוטובולים, לעתים קרובות הם גורמים לחבילות מיקרוטובולים ארוכים אך לא לטקטואידים. אחת הסיבות לכך שצרורות אלה ארוכים יכולה להיות שגם המיקרוטובולים המרכיבים אותם ארוכים. עבודות אחרונות באמצעות מיקרוטובולים קצרים יותר דיווחו גם על צרורות ארוכים יותר שאינם מחודדים בסוף15; במקרה זה, הצרורות מוחזקים יחד עם חלבונים מוטוריים הגורמים להרחבה של הצרורות, ובכך הופכים אותם לארוכים יותר. מיקרוטובולים קצרים עם קרוסלינקרים שאינם מורחבים נחוצים למכלולים מחודדים דמויי ציר, כפי שמתואר כאן.
לאחרונה, פיתחנו טכניקה המאפשרת יצירת טקטואידים של מיקרוטובולים באמצעות ה-crosslinker האנטי-פאראלי, MAP65, בנוכחות מיקרו-טובולים יציבים22. המיקרוטובולים היו צריכים להיות קצרים, אך מעטים הרגולטורים הידועים באורך המיקרוטובולים שיכולים להכביד על מיקרוטובולים מפני חוסר יציבות דינמית או חישול מקצה לקצה. במקום זאת, GMPCPP שימש לגרעין וייצוב החוטים לאחר הגדילה. זה איפשר ליצור צפיפות גבוהה של מיקרוטובולים קצרים שיכולים להתארגן בעצמם לטקטואידים. טקטואידים אלה היו הומוגניים כאשר צפו בהם תחת דו-פרצופיות. בנוסף למיקרו-טובולים קצרים, נעשה שימוש ב-crosslinker אנטי-פאראלי ספציפי, MAP65, כדי ליצור את הטקטואידים (איור 2). MAP65 הוא חלבון הקשור למיקרוטובולים צמחיים במשפחת ה-PRC1/Ase1 של קרוסלינקרים מיטוטיים23. MAP65 קיים כדימר, עם זיקה חזקה להיקשר לעצמו כמו גם למיקרוטובולים24. שלא כמו הציר המיוטי והטקואידים שנצפו עם חוטי אקטין 25,26,27, שהם דו קוטביים ובעלי תכונות דמויות נוזל של גבישים נוזליים, טקטואידים מיקרוטובולים נצפו כמוצקים כמו 22,28.
כאן, מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים microtubule ואפיון צורת המכלולים ואת הניידות של המרכיבים באמצעות טכניקות מבוססות פלואורסצנציה.

<table><tbody><tr><td>2% דיכלורודימתילסילן</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>טיפול משטח סילאן הידרופובי. ניתן לעשות בו שימוש חוזר עד שלוש פעמים ולשמור בטמפרטורת החדר למשך שנה.</td></tr><tr><td>אפוקסי 5 דקות</td><td>בוב סמית תעשיות</td><td></td><td>לאיטום תאי ניסוי</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr> <tr><td>תאי BL21</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>תאי חיידקים מוכשרים המשמשים לביטוי MAP65</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>חלק ממערכת ניקוי החמצן. ציר של 300 מ"ג/מ"ל מיוצר ב-ddH2O ומאוחסן ב-10 &mu; l aliquots ב-20&deg; C עד שנה.</td></tr><tr><td>כיסויים (22 מ"מ x 22 מ"מ או 22 מ"מ x 30 מ"מ)פישר</td><td></td> <td>12544-AP</td><td>לתאי ניסוי</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>מולקולה קטנה המשמשת לשבירת קשרי דיסולפיד ולניקוי חמצן. מלאי 1M עשוי מאבקה (סיגמא) ב-ddH2O. התמיסה מוצעת ומאוחסנת ב-20 מעלות צלזיוס עד שנה. משתמשים באליקוטים 7-8 פעמים ואז מושלכים.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>מרכיב בסיס חיץ טובולין</td></tr><tr><td>Eppendorf צינורות 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>להחזקת תמיסות ניסיוניות</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 הוכחה</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>לניקוי ולמשיכת תמיסות דרך תאי ניסוי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם NA גבוה מטרות</td><td>ניקון</td><td>Ti-E, W2 קונפוקלי</td><td>לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>מקפיא -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>לאחסון ריאגנטים</td></tr><tr><td>מקפיא -80&deg; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>לאחסון חלבונים.</td></tr><tr><td>מיכלי זכוכית לסילניזציה</td><td>מיכאלס</td><td></td><td>להכנת תאי ניסוי - טיפול במשקפיים כיסוי</td></tr><tr><td>מגלשות זכוכית</td><td>פישר</td><td>12544-4</td><td>לתאי ניסוי</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7528-250G</td><td>חלק ממערכת ניקוי החמצן. ציר של 300 מ"ג/מ"ל מיוצר ב-ddH2O ומאוחסן ב-10 &mu; l aliquots ב-20&deg;C.</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא</td><td>G2133-250KU</td><td>חלק ממערכת ניקוי החמצן. זה מאוחסן ב-4&deg; C עד שנה.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>אנלוגי הניתן להידרוליזה איטית של GTP המשמש לפילמור וייצוב המיקרו-צינורות על ידי הפחתת חוסר היציבות הדינמית והריכוז הקריטי הספונטני עבור גרעין מיקרו-צינוריות כדי לקבל אורך עקבי. אנו רוכשים מלאי של 10 מ"מ מ-Jena Biosciences ומאחסנים אותו ב-20&deg; C עד שנה.</td></tr><tr><td>גוף חימום למיקרוסקופ</td> חממה <td></td><td>עליונה שלב Okolab</td><td>לניסויי הדמיה</td></tr><tr><td>Imidizole</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>משמש לסילוק חלבון MAP65 מחרוזי ניקל לטיהור MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>לניקוי ולמשיכת תמיסות דרך תאי ניסוי.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M ב-ddH2O, עשוי טרי למניעת החמצה לאורך זמן.</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>איירגז</td><td>NI 230LT22</td><td>להורדת הקפאה. זה יכול לשמש גם לאחסון (לא מומלץ)</td></tr> <tr><td>חלבון MAP65</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>A חלבון הקשור למיקרו-צינוריות (MAP) במשקל מולקולרי של 65 kD שהוא צולב מיקרו-צינוריות אנטי-מקבילות. טיהרנו גרסה לא מסומנת ומסומנת GFP של MAP65-1 מ-Arabidopsis thaliana. אנו מערבבים את ה-GFP-MAP65 עם ה-MAP65 הלא מסומן כך ש-10% מהחלבון מסומן. מלאי העבודה הוא 10.8 &mu; פתרון M. פתרון עבודה זה מאוחסן ב-4&deg; C ומחודש טרי כל שבוע. הפרוטוקול לטיהור ה-MAP65 וה-GFP-MAP65 ניתן בפרק השיטות הקודמות שלנו (26).</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>מרכיב חיץ טובולין</td></tr><tr><td>NTA-חרוזי ניקל</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>חרוזים הנדרשים לטיהור 6xHis מתויג חלבוני MAP65</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm מערכת לייזר שיכולה למקד את הלייזר בכל צורה רצויה של אזור עניין</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>מאגר בסיס פילמור טובולין ניטרלי לתמיסה העשויה מצינורות K של 80 מ"מ, pH 6.8, 1 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ EGTA, מאוחסן בטמפרטורה של 4&deg; C עד שנה.</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי קבוע</td><td>3M - סקוטש</td><td>34-8724-5691-7</td><td>לתאי ניסוי</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר</td><td>FB0875713</td><td>לצינורות תא לח</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>מרכיב בסיס חיץ טובולין</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>בלוק-קופולימר עם שני בלוקים של תחמוצת פוליאתילן הידרופילית (PEO) בקצוות ובלוק מרכזי הידרופובי של ציפוי משטח הידרופובי של תחמוצת פוליפנילן (PPO) שאנו משתמשים בו כדי למנוע קשירת חלבון למשטח. Pluronic-F127 נרכש כאבקה (סיגמא) ומומס לתמיסה של 5% (w/v) ב-ddH2O בן לילה. לאחר המסה, ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שנה.</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול</td><td>אפימטריקס בע"מ</td><td>19966 500 גרם</td><td>חומר צפיפות המשמש ליצירת כוחות דלדול כדי להעלות את הטקטואידים לפני השטח ולסייע בארגון מיקרו-צינוריות. אנו יוצרים פתרון של 5% (w/v) של 100 kDa PEG ב-PEM80. הפתרון מאוחסן ב-4&deg; C עד שנה ומונח על הנדנדה לפני השימוש. הוא צמיג, לכן אנו ממליצים להשתמש בפיפטה עם תזוזה חיובית כדי לעבוד איתו.</td></tr><tr><td>פיפטה תזוזה חיובית</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>לפיפטינג נוזלים צמיגים</td></tr><tr><td>מתלים לכיסויים</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72240</td><td>להכנת תאי ניסוי - טיפול בכוסות כיסוי</td></tr><tr><td>מקרר 4&deg; C</td><td>פישרברנד</td><td></td><td>לאחסון ריאגנטים</td></tr><tr><td>טובולין עם תווית</td><td>שלד ציטולוגי</td><td>TL590M</td><td>ליופיליזציה עם תווית רודמין ממוח חזיר נרכש (שלד ציטו) ומאוחסן ב -80&deg; C עד ללחות ב-PEM80 ושימוש עד שנה.</td></tr><tr><td>חלבון טובולין</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>טובולין ליופיל 99% טהור ללא תווית ממוח חזיר נרכש (Cytoskeleton) ומאוחסן ב-80&deg; C עד ללחות ב-PEM80 ושימוש עד שנה.</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>דגם 342</td><td>להכנת תאי ניסוי - טיפול במשקפי כיסוי</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>תוסף לרישום נתוני סדרות זמן להסרת סחיפה</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>תוסף לרישום נתוני סדרות זמן להסרת סחיפה</td></tr></tbody></table>

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

השלד הציטוסקלטון אחראי על הארגון הפנימי העיקרי ועל הארגון מחדש בתוך התא, כל זאת ללא מנהל שינהל את השינויים. זה במיוחד המקרה במהלך מיטוזה או meiosis, שבו microtubules ליצור את הציר במהלך חלוקת התא. הציר הוא המנגנון המשמש להפרדת חומר גנטי במהלך חלוקת התאים. לקראת יצירת צירים המאורגנים בעצמם במבחנה, פיתחנו לאחרונה טכניקה לשילוב מחדש של מיקרו-טובולים למכלולים דמויי ציר עם קבוצה מינימלית של חלבונים הקשורים למיקרוטובולים וסוכני צפיפות. באופן ספציפי, נעשה שימוש ב- MAP65, שהוא קרוסלינקר מיקרוטובול אנטי-פאראלי מצמחים, הומולוג של Ase1 משמרים ו- PRC1 מאורגניזמים יונקים. לינקר צולב זה מארגן בעצמו מיקרו-טובולים לתוך מכלולים ארוכים, דקים, דמויי צירים, המאורגנים בעצמם. מכלולים אלה דומים גם לטקטואידים של גבישים נוזליים, ומיקרוטובולים יכולים לשמש כמזוגנים מזוקליים. כאן מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים מיקרוטובולים אלה, כמו גם לאפיון צורת המכלולים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניידות המרכיבים באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הפוטו-הלבנה.

עם מספר קטן בלבד של רכיבים, דימרים של טובולין וקישורים צולבים של מיקרוטובולים, טקטואידים של מיקרוטובולים יכולים להיווצר (איור 2A). אף על פי שפרוטוקול זה מתאר דגירה לגרעין ולגידול מיקרוטובולים באינקובטור, ניתן לצפות בגרעין ובצמיחה ישירות מתחת למיקרוסקופ (שהם שלמים תוך 30 דקות) (איור 2B). ריכוז טובולין נשמר קבוע ב-13.6 מיקרומטר וקשירת MAP65-MT ב-10%.
איור 4 מייצג נתונים מוצלחים. הטקטואידים צריכים להיות גלויים הן עם לייזר של 561 ננומטר בתעלת טובולין והן עם 488 ננומטר בתעלת MAP65, החופפים באופן מושלם זה לזה (איור 4A). אחת התעלומות של המערכת הייתה שנראה שרוחב הטקטואידים אינו משתנה תחת מגוון שינויים ניסיוניים, כולל שינוי אורכי המיקרוטובולים, ריכוז MAP65 וחומרי הצפיפות (איור 4B)22,28. האורך משתנה הרבה יותר ותלוי הן באורכי המיקרוטובולים והן בריכוז MAP65 (איור 4B)22,28.
בעת ביצוע FRAP, נצפה כי האות MAP65 מתאושש, אך אות המיקרוטובול אינו מתאושש (איור 5). ההתאוששות ב-FRAP נובעת מהניידות והתנועה של העצמים המסומנים והמצולמנים. במקרה של MAP65, המולקולות המוכהות מתנתקות ומתרחקות מהמיקרוטובול, והמולקולות החדשות עוברות לאזור (איור 5). קשירת MAP65 נמצאת בשיווי משקל, כך שקצב הקשירה וההתנתקות שווה (נמדד במולקולות לשנייה). עבור המיקרוטובולים, לא נצפתה התאוששות המרמזת על כך שהמיקרוטובולים אינם מסוגלים לעזוב את הטקטואיד (איור 5A, Bi, C). יתר על כן, לא נראתה התפשטות של האזור הכהה, מה שמרמז על כך שהמיקרוטובולים הם חסרי תנועה מקומית ולא נוזלים בתוך הצורה הטקטואידית.
<img alt="יישור כרומוזומים מטפאזי; מבנה ציר וארגון מיקרו-צינורות; תרשים מיקרוסקופיה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מודלים שונים של היווצרות צירים. ציר מיטוטי הוא מכונה העשויה ממיקרוטובולים ומהחלבונים והאנזימים הקשורים אליהם, אשר מיישרת ומפרידה את הכרומוזומים לשני תאי הבת החדשים במהלך חלוקת התאים. (A) תמונה של העתק ציר טיפה מימי הביניים המוקדמים עם חוט דק מהולנד. נתון זה שונה מתמונת ויקימדיה על ידי פיטר ואן דר סלויס30. (B) שחזור תלת-ממדי של מיקרו-טובולים בשלבים שונים של מיוזה מסוג בר II. מיקרוטובולים מוצגים בירוק, וכרומוזומים מוצגים באפור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. נתון זה שונה מ-Lantzsch et al.31. (C) תמונת מיקרוסקופיה של המיקרוטובולים בציר מיטוטי של תא Sf9 מתפצל. מוטות הציר והמיקרוטובולים של הציר מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. נתון זה שונה מ-Advani et al.32. (D) מודלים שונים של האופן שבו מיקרוטובולים של צירים מיטוטיים ומיוטיים מאורגנים. (i) המיקרוטובולים (הירוקים) שנצפו בעבר עבור צירים מיוטיים שנוצרו מתמציות ביצים של קסנופוס, הוסקו כקצרים ודינמיים לאורך כל הציר. זה דומה לארגון טקטואידי דו קוטבי בתוך גביש נוזלי. (ii) המודל הקנוני לארגון מיקרוטובולים בתוך ציר מיטוטי כולל שני סוגים של מיקרוטובולים: מיקרוטובולים אינטרפולריים או קוטביים (ירוק כהה) המתחברים לאזור האמצע סביב הכרומוזומים ומיקרוטובולים קינטוצ'ור (ירוק בהיר) אשר מקובצים ונמתחים מהקוטב לקינטוכור כדי לדחוף ולמשוך את הכרומוזומים. בכל התמונות, הכרומוזומים מוצגים בכחול שקוף, וקטבים ציריים מיוצגים בירוק כהה. (E) סכמות של מזוגנים (קווים ירוקים) בטקטואיד גבישי נוזלי עבור (i) טקטואידים דו קוטביים ו-(ii) טקטואידים הומוגניים. לטקטואידים דו קוטביים יש שני קטבים בקצה הטקטואיד, והמזוגנים מכוונים מחדש כדי להצביע על הקטבים האלה. לטקטואידים הומוגניים יש קטבים באינסוף, והמזוגנים אינם משנים כיוון לאורך הטקטואיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="שיטת היווצרות טקטואידים סכמטית וסדרות זמן; מיקרו-צינורות, קישור צולב MAP65, מיקרוסקופיה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: עיבוי מיקרו-טובולים. (A) מיקרו-טובולים יכולים להיות ארוזים ומוצלבים על-ידי מגוון שיטות, כולל מינים יוניים, כוחות דלדול הנגרמים על-ידי סוכני צפיפות, וקישורים צולבים ספציפיים של מיקרוטובולים, כגון MAP65. (i) דימרים של טובולין וחלבוני MAP65 מעורבבים כדי לגרום ולגדל מיקרוטובולים. (ii) מיקרו-טובולים מתפרקים וצומחים מהטובולין, ו-MAP65 נקשר מיד למיקרוטובולים, למונומר MAP65 נוסף, או לשניהם וגורם לאגד. (3) מיקרוטובולים בצרורות המקושרים צולבים מגרגרים וגדלים. (iv) התצורה הסופית היא טקטואיד מיקרוטובול הדומה לציר. (B) סדרת זמן של טקטואידים מיקרוטובולים מתנודדים וגדלים במשך 105 דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. האיור הותאם מתוך Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="תרשים תא זרימה עם כיסוי סילאני, לניתוח כיוון זרימת דגימה במיקרוסקופיה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: מכלול תא זרימה. תא הזרימה נעשה באמצעות מגלשת זכוכית, זכוכית כיסוי סילאנית וסרט הדבקה דו-צדדי קבוע. האזור המסומן הצהוב הוא נתיב הזרימה שבו הדגימה זורמת ונצפית. נפח תא הזרימה הוא ~ 20 μL. אפוקסי שימש לאטום את קצות התא כדי למנוע מהדגימה להתאדות במהלך הדמיה ארוכת טווח במשך מספר שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="ניתוח טקטואידים: ערוצי מיקרו-צינוריות ו-MAP65, תמונות ממוזגות, כימות אורך-רוחב, גרף." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: תמונות טקטואידיות וניתוח אורך ורוחב. (A) נתונים לדוגמה של טקטואידים שנוצרו כמתואר ומצולמים באמצעות קונפוקל דיסק מסתובב המציג (i) הדמיית תעלות מיקרוטובול הדמיה של טובולין המסומן ברודמין באמצעות לייזר של 561 ננומטר, (ii) הדמיית ערוץ GFP-MAP65 של ה-GFP באמצעות לייזר של 488 ננומטר, ו-(iii) תמונת שכבה ממוזגת מערוץ המיקרוטובול (magenta) וערוץ GFP-MAP65 (ציאן). אזורי חפיפה מוצגים כלבנים ומדגימים שהמיקרוטובולים וה-MAP65 מתמזגים בדיוק. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר עבור כל התמונות ב- (A). (B) כימות של אורך ורוחב טקטואידים. (i) תמונה של טקטואיד שיש לנתח ללא תוויות. סרגל קנה מידה = 5 μm. (ii) אותה תמונה כמו ב- (i), שבה מסומנות מדידות האורך (קו אחיד עם מכסי קו) והרוחב (קו מקווקו). סרגל קנה מידה = 5 μm. (iii) הרוחב נמדד על ידי לקיחת פרופיל העוצמה על פני הטקטואיד בביסקטור הניצב (קו מקווקו) המסומן ב- (ii). פרופיל העוצמה התאים לתפקוד גאוס כדי לחשוף את המשרעת והרוחב של הטקטואיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="ניתוח FRAP: מיקרו-צינוריות, סדרות זמן MAP65, תרשימי עוצמה. דינמיקת התאוששות פלואורסצנטית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: נתונים וניתוחים מייצגים של FRAP. (A) נתוני סדרת זמן מיקרוסקופיה של (i) טקטואיד מיקרוטובולים ו-(ii) GFP-MAP65, ו-(iii) תמונת שכבה של שני הערוצים עם מיקרוטובולים במג'נטה וב-GFP-MAP65 בציאן שהולבנו בזמן 63 שניות ונצפו במשך 5 דקות נוספות. ) תעלת מיקרוטובול באזור הלבנה (מעגלי מג'נטה) והרקע (עיגולים אפורים כהים) ו-(ii) ערוץ GFP-MAP65 באזור המולבן (ריבועי ציאן) והרקע (ריבועים אפורים כהים). (C) הנתונים תוקנו עבור רעשי הרקע והורחבו מחדש עבור ערוץ המיקרוטובולים (מעגלי מג'נטה) וערוץ GFP-MAP65 (ריבועי ציאן). המיקרוטובולים אינם מתאוששים, אך ה-GFP-MAP65 כן יכול להתאים (קו אפור כהה) לדעיכה מעריכית עולה כדי למצוא את המשרעת ואת ציר הזמן של ההתאוששות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

מאמר זה מציג פרוטוקול להיווצרות מכלולים של מיקרוטובולים בצורת טקטואידים תוך שימוש ב-MAP65, קרוסלינקר מיקרוטובולים על בסיס צמחי, ו-PEG כסוכן צפיפות.

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

פרוטוקול זה מאפשר ארגון עצמי ספונטני של טקטואידים של מיקרוטובולים באמצעות מחבר צולב אנטי-מקבילי, MAP65. מערכת זו יכולה לעזור לנו להבין את ארגון המיקרוטובולים ואת המערכות הביולוגיות כמו צירים מיטוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במערכת מינימליסטית שיכולה ליצור מחדש צורות דמויות ציר עבור מיקרו-טובולים הניתנים לשחזור ונגישים למעבדות רבות.שיטה זו אינה ישימה רק למערכות תאיות, אלא יכולה לשמש גם כמודל למחקרי גבישים נוזליים בקנה מידה מזו. כדי להכין טובולין, תחילה מוציאים אליקווט של טובולין ללא תווית המכיל מיליגרם אחד של טובולין ליופילי מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ושומרים אותו על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של PEM-80 קר.כדי להמיס את כל lyophilate, לשמור את הצינור על הקרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו צינורית של טובולין עם תווית רודמין המכילה 20 מיקרוגרם של אבקת טובולין ליופילית מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס והשאירו אותה על קרח. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של PEM-80 קר ולשמור את הצינור על קרח במשך 10 דקות כדי להמיס את כל lyophilate.לאחר שהטובולינים הלופיליים התמוססו, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת טובולין ללא תווית לתמיסת טובולין בעלת ארבעת המיקרוליטרים המסומנים ברודמין. לאחר מכן, ערבבו את הפתרונות על ידי צנרת שש עד שבע פעמים לאט מאוד. כדי לאחסן את 100 המיקרוליטרים הנותרים של תמיסת טובולין ללא תווית, תחילה, הכנס את הצינור לחנקן נוזלי כדי להקפיא את התמיסה, ולאחר מכן שמור את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.לאחר מכן, הפיצו את תערובת הצינורות לשבעה צינורות חדשים על ידי הוספת 15 מיקרוליטרים בכל אחד מהם. הקפיאו את הצינורות בחנקן נוזלי כפי שהוכח בעבר ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי להרכיב תאי זרימה לביצוע ניסויים, ראשית, נקו מגלשת זכוכית עם מים מזוקקים כפולים ויבשו אותה עם מגבון מעבדה נטול מוך.לאחר מכן, נקו תחילה את המגלשה עם אתנול ואחריו מים מזוקקים כפולים. כדי ליצור נתיב זרימה, חותכים פיסת נייר דבק דו-צדדית באורך 40 עד 50 מילימטרים. לאחר מכן, פצלו אותו בין לבין כדי ליצור שתי רצועות נייר דבק דקות יותר והניחו את שתי הרצועות על המגלשה במרחק של חמישה עד שמונה מילימטרים זו מזו.לאחר מכן, הניחו את החלקות הכיסוי המסולקות על גבי נתיב הזרימה. לאחר מכן, אטמו את המגלשה והכיסוי החליקו את רצועות הטייפ הדו-צדדיות על ידי לחיצה עדינה על אזור הקלטת בגב העט. אם החותם עשוי היטב, הקלטת צריכה להפוך משקיפות לשקוף.כדי להסיר את הסרט הנוסף על הקצוות, חותכים את הסרט עם סכין גילוח, ומשאירים רק מילימטר אחד מהכניסה לתא הזרימה. לאחר מכן, תייג את התא בפרמטרים ניסיוניים מתאימים לביצוע הניסויים הטקטואידים, ראשית, להפשיר את כל הריאגנטים הדרושים על קרח ולאחסן אותם על הקרח במהלך העבודה. לאחר מכן, ציפו את תא הזרימה ב-20 מיקרוליטרים של חומר פעילי שטח של קופולימר קופולימר בלוקים לא יוניים 5% המומסים ב-PEM-80 עם טיפות קטנות בשני קצות התא כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בפנים.לאחר מכן, השאירו את תא הזרימה בתא לח העשוי מצלחת פטרי עם מגבון מעבדה רטוב ונטול מוך למשך חמש עד שבע דקות לפחות. לאחר מכן, מערבבים PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, גלוקוז, פוליאתילן גליקול, תערובת טובולין שנעשתה קודם לכן, ו- MAP65 עם GFP MAP65 להדמיה בצינור סטרילי על ידי צנרת חמש עד שש פעמים, תוך שמירה על הצינור על קרח. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של תמיסה מעורבת מראש של אוקסידאז גלוקוז וקטלאז לצינור של תערובת טובולין-MAP ומערבבים שוב על ידי צנרת שבע עד שמונה פעמים.חלקו את הנפח הכולל של התמיסה לשני חלקים שישמשו בתאים נפרדים. בינתיים, יש להסיר את הנוזל שנוסף מוקדם יותר לתא הזרימה על ידי פעולת נימים באמצעות מגבון מעבדה נטול מוך בקצה השני של התא, יחד עם הוספת תערובת טובולין-MAP לתא הזרימה. לאחר שהדגימה נמצאת במלואה בתוך התא, אטמו את שני קצות התא באמצעות אפוקסי של חמש דקות ושמרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות כדי לגרום ולגדל טקטואידים של מיקרוטובולים.להדמיית הטקטואידים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, השתמש במטרות עם מפתח צמצם מספרי של 1.2 או יותר בהגדלה של פי 60 ומעלה כדי לאסוף מספיק אור בפלואורסצנציה. הקלט את התמונות באמצעות מוליך למחצה של תחמוצת מתכת חינם או מצלמת התקן מצומדת לטעינה. כדי לשמור על הדגימה, שמור אותה בתא סביבתי שנקבע על 37 מעלות צלזיוס.לחלופין, ניתן להשתמש בתנורי שלבים אחרים, כולל מחממי שלב אוויר חם וקולרים מבוקרי טמפרטורה אובייקטיביים עם מים חמים במחזור, למטרה זו. מכיוון שמקורות עירור מתאימים חיוניים לפלואורסצנציה הנכונה עבור רודמין טובולין, השתמש בלייזר של 561 ננומטר עם לפחות מילי-וואט אחד של כוח בדגימה לתמונות באיכות טובה. עם זאת, עבור GFP MAP65, שנה את מקור העירור ללייזר של 488 ננומטר.אם אתה משתמש במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשדה רחב, השתמש בקוביית מסנן רודמין עם עירור של 540 12.5 ננומטר, דיכרואי של 545 ננומטר 12.5 ננומטר ניתוק, ופליטה של 575 ננומטרים מעבר ארוך. עבור GFP MAP, השתמש בקוביית מסנן GFP עם עירור של 480 15 ננומטרים, דיכרואיק של 505 ננומטרים 15 ננומטר מנותקים, ופליטה של 515 ננומטרים ארוכים. לאחר שווידאתם שעוצמת התאורה וזמני החשיפה הם כאלה שקנה המידה של העוצמה של המצלמה אינו רווי, צלמו לפחות 10 תמונות של אזורים שונים כדי לצלם מעל 100 טקטואידים הן בערוצים האדומים והן בערוצים הירוקים, ושמרו אותם כתמונת TIFF של 16 סיביות לניתוח.באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לדמיין ישירות תחת המיקרוסקופ טקטואידים שהיווצרותם הושלמה תוך 30 דקות. הטקטואידים נראים הן עם לייזר של 561 ננומטר בתעלת טובולין והן עם לייזר של 488 ננומטר בתעלת MAP65. התמונות גם חופפות באופן מושלם זו לזו.בשיטה זו ניתן היה למדוד גם את אורכם ורוחבם של הטקטואידים. נמצא כי פרופיל העוצמה של טקטואיד משתנה בהתאם לרוחבו. יתר על כן, האופי חסר התנועה של הטקטואידים המיקרוטובולים הודגם על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויי הלבנת תמונות או FRAP, שלא הראו כל התאוששות של פלואורסצנציה לאחר הלבנת הפוטו.מצד שני, ניסויי FRAP חשפו אופי נייד של MAP65, שעבורו ניתן היה לצפות בהתאוששות הדרגתית ובפלואורסצנציה לאחר הלבנת תמונות. התאוששות פלואורסצנטית זו על ידי MAP65 יכולה להתאים לדעיכה מעריכית גוברת כדי למצוא את המשרעת ואת סולם הזמן של ההתאוששות. חלק הניסוי הטקטואידי אמור להסתיים תוך 10 עד 12 דקות, מכיוון שהטובולין יכול להתקלקל על קרח במהירות, מה שעלול להזיק לנוקלאציה של טקטואידים.עבודה עתידית עם חלבונים שונים המקשרים בין מיקרוטובולים וחלבונים מוטוריים צולבים, אנזימים שיכולים להזיז מיקרוטובולים, תמשיך לחשוף מידע חדש על הארגון העצמי של הציר המיטוטי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מוצגות כאן שיטות להכנת נמטיקה פעילה ממיקרוטובולים ומנועי קינסין, כולל הכנה ובנייה של חלבונים ושימוש בבארות לכליאה נמטית פעילה.

יצירה, הגבלה והתבוננות בנמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

למדו הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים באמצעות MAP65 ו-PEG. פרוטוקול זה מאפשר חקר ארגון מיקרוטובולים ומספק מודל ללימוד תאי מיטוטי ומערכות ביולוגיות שונות.

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

גלה סרטונים נוספים