גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית
17 במרץ 2023
AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.
אנדוציטוזה של שלפוחית לתוך ציטופלזיה גורמת להיווצרות שלפוחיות תוך תאיות. חדירה של שלפוחית מפעילה מסלולי אות שונים. השבתת לייזר בסיוע כרומופור משמשת לחקר התוצאה של קרע שלפוחית תוך תאית.
בקרה מרחבית וזמנית של נזק תת-תאי לשלפוחיות תוך-תאיות יכולה להיות מושגת על ידי התאמת מצב העמידה ותאורת האור. כדי להתחיל, לשמור על תרבית תאי HeLa ב DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר שטיפת התאים עם PBS, טריפסיניזציה של התאים.
לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10% FBS. לדלל 300 ננוגרם של פלסמיד Gal3-GFP ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן להוסיף 0.6 מיקרוליטר P3000 מגיב.
ולערבב בעדינות, ולאחר מכן מערבלים את התמיסה. לדלל 0.45 מיקרוליטר של מגיב Lipofectamine 3000 ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בעדינות. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן מערבבים DNA מדולל וליפופקטמון 3000 מדולל ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב תערובת ה- DNA lipofectamine, 300, 000 תאי HeLa מרחפים ו -200 מיקרוליטר DMEM עם 10% FBS, זרעו את התאים באזור הזכוכית המרכזי של צלחת כפתור זכוכית 35 מ"מ. כדי לאפשר חיבור תאים, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות לפחות.
לדלל AlPcS2a ב- DMEM בתוספת 10% FBS כדי ליצור פתרון AlPcS2a מיקרומולרי אחד. חממו מראש את המדיום המכיל AlPcS2a באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והחליפו את מדיום התרבית בתווך המכיל AlPcS2a. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה.
למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר AlPcS2a חוץ-תאי לאחר החלפת המדיום במדיום טרי. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות כדי לאפשר לשאריות צבע לאורך המסלול האנדוציטי להצטבר לליזוזומים. כדי לתפעל תאים בודדים על ידי פגיעה בליזוזומים, הניחו את צלחת התרבית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי.
השתמש בלייזרים בגודל 488 ננומטר ו- 561 ננומטר לקבלת GFP ו- AlPcS2a מלהיבים, בהתאמה. הקף אזור מרובע בגודל חמישה על חמישה מיקרומטר של עניין על שלפוחיות המסומנות ב- AlPcS2a שנבחרו להינזק. ואז פולס להאיר את האזור של עניין עם לייזר 633 ננומטר של 0.21 מילי וואט, או 70 חזרות.
עקוב אחר היווצרות Gal3 puncta כאינדיקטור לחדירת קרום ליזוזומלי. צביעה ליזוזומלית עם AlPcS2a בתאי HeLa בוצעה באמצעות סמנים זמינים מסחרית, ונצבעו באופן חיובי בצבע פלואורסצנטי ירוק. ליזוזומים בתאי TagRFP-Galectin3 המבוטאים ב-HeLa היו מוכתמים ב-AlPcS2a.
לאחר מכן הארה ממוקדת עם אור אינפרא אדום קרוב, התוצאות מצביעות על כך שהפעלת לייזר בסיוע כרומופור מבוססת AlPcS2a הצליחה לשלוט בקרע ליזוזומלי מקומי באזור העניין, והשאירה את שאר הליזוזומים ללא פגע. שלב זה חשוב מכיוון שזמן הדגירה יקבע אנדוזומים עומדים או ליזוזומים. לדוגמה, אנשים יכולים לקבוע את הגודל של על ידי שחרור של צבע בלתי חדיר קרום.
כמו כן ניתן להשתמש בצבעים רגישים ל- pH כגון FITC dextran כדי להבדיל בין אנדוזומים וליזוזומים. טכניקה זו שימושית החל את ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום שלפוחית תוך תאית. ויש השפעות במורד הזרם במצבים שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שימוש באינאקטיבציה בלייזר בסיוע כרומופור (CALI) המתווכת על ידי AlPcS 2a משמש לחקירת הנזק המרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות בתאים חיים. טכניקה זו מאפשרת שליטה מדויקת בנזק התת-תאי, ומספקת תובנות לגבי ההשלכות של קרע בשלפוחיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- דימות תאים חיים
רקע
- אנדוציטוזה מובילה להיווצרות של שלפוחיות תוך-תאיות.
- תאימות מעברית (Permeabilization) של שלפוחיות מפעילה מסלולי איתות שונים.
- CALI היא שיטה לבדיקת ההשפעות של קרע של וזיקולות.
- בקרה מרחבית וזמנית מושגת באמצעות הקרנת אור.
מטרת המחקר
- לחקירת הדינמיקה של נזק לוויזקולות תוך-תאיות.
- להבנת מסלולי השיגנלינג המופעלים על ידי קרע של ויזקולות.
- לשכלול טכניקות לבדיקת אינטראקציות בתאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של תאי HeLa ב-DMEM עם 10% FBS.
- שטיפת התאים ב-PBS לפני הניסוי.
- טריפסינזציה של התאים לצורך אנליזה.
- יישום של CALI להשראת נזק מקומי.
תוצאות עיקריות
- הוכחשה שליטה יעילה על נזק לשקיקים.
- זוהו מסלולי איתות מרכזיים המופעלים לאחר קרע.
- תוקף השימוש ב-CALI במחקרי תאים חיים.
- סופקו תובנות לגבי המנגנונים של תפקוד השקיקים.
מסקנות
- CALI הוא כלי בעל ערך לחקר דינמיקה תוך-תאית.
- הממצאים משפרים את ההבנה של סיגנלינג הקשור לוויזקולות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להבסס את עצמם על שיטות אלו להשגת תובנות עמוקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שבירת שלפוחיות תוך-תאיות באמצעות השבתה בלייזר בעזרת כרומופור (CALI) מאפשרת השראה מדויקת, מרחבית וזמנית של קרע בשלפוחיות תוך-תאיות, ובכך מספקת מערכת מבוקרת לבחינת אירועי חדירות ממברנה. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף יעדים על ידי מתן אפשרות למניפולציה ובקרה סלקטיבית של שלמות אנדוזומית וליזוזומית בתאים חיים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי קישור קרע השלפוחיות לאותות שמעבר ולגיוס מולקולרי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של שלמות ממברנת השקיקים ותפקידה במסלולי איתות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של גיוס חלבונים קושרים גליקנים, כגון galectin-3, בעת התבקעות השקיקים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד ההשפעות של פרמיליזציה ממוקדת של אברונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה לפיתוח של בדיקות כמותיות מבוססות דימוי לניטור קרע של וסיקולות וגיוס מולקולרי.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקות באמצעות השראה מבוקרת ומקומית של חדירות ממברנה.
- מאפשרת הערכה הדירה של השפעות תרכובות על יציבות אנדוזומלית וליזוזומלית.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- עולה בקנה אחד עם מודלים רלוונטיים למחלות, שבהם לשלמות הוסיקולות יש השפעה על השליחון התאי והפתולוגיה.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתing אפשרות למחקרי השפעות במורד הזרם (downstream) של קרע של שלפוחיות.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות אספקת תובנות מכניסטיות לגבי תגובות תאיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
גישה פוטודינמית זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת מניפולציה המונחית-השערה וקריאה של אירועי קרע של שלפוחיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקידה של חדירות שלפוחיות (vesicle permeabilization) בתהליכי איתות וגיוס חלבונים.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק נקודות סיום מדידות, כגון היווצרות נקודות (puncta) של galectin-3 ושחרור צבע, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים מכניסטיים למודלים תאיים רלוונטיים למחלות שבהם מעורב קרע של שלפוחיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת לשימוש חוזר לחקר דינמיקת ממבנה במגוון סוגי תאים ותנאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי סיגנלינג הקשורים לוזיקולות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של השראה ומדידה של קרע בוזיקולות לצורך קבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הבהרת ההשלכות התפקודיות של חדירות ממברנה (permeabilization).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ומסלולים המושפעים משלמות הוזיקולות, תוך התאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי תאי חיים (live-cell imaging) ובמניפולציה פוטודינמית.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ותשתית להארה בלייזר.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדימוי והניתוח בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה לקווי תאים שונים ולסממני אברונים עם בקרות מתאימות.
- תלוי בכיול מדויק של פרמטרי הלייזר וריכוזי הצבע להבטחת שחזוריות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
