Name: גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: חקור שימוש ב-CALI מבוסס AlPcS2a לחקר נזק מרחבי-זמני לשלפוחיות תוך-תאיות בתאי HeLa חיים. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בנזק תת-תאי וחושפת מסלולי איתות הנגרמים מקרע שלפוחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ל-Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS על התמיכה במחקר. מתקן הליבה ממומן על ידי Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). המחברים מודים למתקן הליבה של ציוד משותף של המכון למדעים ביו-רפואיים (IBMS), אקדמיה סיניקה (AS) על הסיוע ברכישת התמונה.

1. הכנת מלאי AlPcS2a
<ol><li>יש להמיס 10 מ"ג של AlPcS2a ב-400 מיקרוליטר של 0.1 M NaOH. כדי לשפר את מסיסות, מחממים את התמיסה ב-50°C ומערבולת.</li>
	<li>ערבבו את התמיסה עם 4 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). לאחר מכן, סנן את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את המשקעים הבלתי מסיסים.</li>
	<li>למדוד את ריכוז התמיסה באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. מקדם ההכחדה של AlPcS2a ב 672 ננומטר הוא 4 x 104 cm-1 M-1. דלל את פתרון AlPcS2a עם PBS כדי ליצור פתרון של 1 mM. הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 °C.</li>
</ol>2. טרנספקציה
הערה: Gal3-GFP מיושם כאינדיקטור להדמיית תאים חיים של קרע ליזוזומלי.
<ol><li>שמור על תרבית תאי HeLa ב- DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). לאחר שטיפת התאים עם PBS, טריפסיניזציה של התאים, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10% FBS. הערה: השיטה ישימה עבור רוב קווי התאים המחוברים, כולל קווי תאים HeLa ו- A549. באופן עקרוני, למרות שלא נבדקו תאי תרחיף, ניתן היה לבצע איתם בדיקות CALI.</li>
	<li>לדלל 300 ng של פלסמיד Gal3-GFP ב 25 μL של תווך סרום מופחת, ולאחר מכן להוסיף 0.6 μL של מגיב P3000. מערבבים בעדינות. לדלל 0.45 μL של מגיב Lipofectamine 3000 ב 25 μL של מדיום סרום מופחת. מערבבים בעדינות.</li>
	<li>דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים DNA מדולל וליפופקטמון 3000 מדולל, ולאחר מכן דוגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבבים את תערובת ה- DNA-Lipofectamine, 3 x 105 תאי HeLa מרחפים ו- 200 μL של DMEM + 10% FBS, ולאחר מכן זרעו את התאים באזור הזכוכית המרכזי של צלחת כפתור זכוכית 35 מ"מ.</li>
</ol>3. צביעת AlPcS2a
<ol><li>כדי לאפשר חיבור תאים, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור המסופק עם 5%CO2 למשך 4 שעות לפחות.</li>
	<li>לדלל AlPcS 2a ב DMEM בתוספת 10% FBS כדי ליצור 1 מיקרומטר AlPcS2a פתרון. חממו מראש את המדיום המכיל AlPcS2a באמבט מים של 37°C. החלף את מדיום התרבית במדיום המכיל AlPcS2a.</li>
	<li>לדגור את התאים ב 37 ° C באינקובטור מסופק עם 5% CO2 בלילה (16-18 שעות).</li>
	<li>למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר AlPcS2a חוץ-תאי. החלף את המדיום בתווך טרי, ולאחר מכן דגר ב 37 ° C במשך 4 שעות כדי לאפשר צבע שיורי לאורך המסלול האנדוציטי להצטבר לליזוזומים. הערה: כדי להכתים אנדוזומים, לדגור על תאים ב-1 מיקרומטר AlPcS2a ב-DMEM המכיל 10% FBS למשך 15 דקות ב-37°C. לאחר מכן, לשטוף תאים פעמיים עם PBS לדגור אותם בתווך מחומם מראש לפני הדמיה .</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg"> איור 1. איור סכמטי המייצג את נזקי IV סלקטיביים עם AlPcS2a. האיור מציג את הסכמות של נזק IV סלקטיבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg"> איור 2. צביעה ליזוזומלית עם AlPcS2a. ליזוזומים המסומנים במהלך הלילה עם 1 מיקרומטר AlPcS2a בתאי HeLa מוכתמים באופן חיובי בצבע פלואורסצנטי ירוק של 50 ננומטר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. הדמיה מדגמית ותאורת אור
הערה: ניתן לבצע נזק IV בתוך אזור תת-תאי של תא בודד או של כל התאים המסומניםב-AlPcS 2a בצלחת תרבית. תאורה בתפזורת של כל צלחת התרבית מאפשרת מחקר כמותי של נזק זה, כולל מחקרים ביוכימיים.
<ol><li>תמרן תאים בודדים על ידי פגיעה בליזוזומים בתוך תא יחיד, כמתואר להלן.<ol><li>מניחים את צלחת התרבית על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש בלייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר עבור GFP ו- AlPcS2a מלהיבים, בהתאמה.</li>
		<li>הקף בעיגול 5 x 5 מיקרומטר2 אזור עניין (ROI) על שלפוחיות המסומנות AlPcS2a שנבחרו להינזק.</li>
		<li>פולס מאיר את החזר ההשקעה עם לייזר 633 ננומטר של 0.21 mW למשך 70 חזרות. עקוב אחר היווצרות Gal3 puncta כאינדיקטור לחדירת קרום ליזוזומלי.</li>
	</ol></li>
	<li>נזק לכל התאים המסומנים בצלחת תרבית כמתואר להלן.<ol><li>הניחו את מנת התרבות על פלטפורמה. האר את המנה עם 660 ננומטר של אור LED משולב (אור אינפרא אדום קרוב הוא בסיס אידיאלי על ספקטרום העירור של AlPcS2a).</li>
		<li>הניחו את צלחת התרבית על המיקרוסקופ ועקבו אחר האינדיקטורים לחדירת הממברנה כאמור בשלב 4.1.3.</li>
	</ol></li>
	<li>להעריך פגיעה של IVs באמצעות האינדיקטורים הבאים.<ol><li>התוכן של אנדוזום או ליזוזום הם גליקוזילציה גבוהה ביותר, אשר נחשפים cytosol עם קרע IV. תייגו אותם במהירות באמצעות גלקטינים קושרי גליקן ציטוסולי, כולל גלקטין-1, גלקטין-3, גלקטין-8 וגלקטין-916,20.</li>
		<li>גודל הפצע יכול להיקבע על ידי שחרור של צבע אטום לקרום כמתואר ב21.</li>
		<li>ההבדל בין אנדוזומים וליזוזומים הוא ערך החומציות הלומינלי שלהם. קרע ליזוזומלי מפריע ל-pH הלומינלי, אותו ניתן למדוד באמצעות צבע רגיש ל-pH, כגון FITC-dextran3.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg"> איור 3. CALI בתיווךAlPcS 2a גורם לגיוס מקומי של TagRFP-galectin-3 (Gal3) לליזוזומים באזור התאורה. ליזוזומים בתאי HeLa מבוטא TagRFP-galectin-3 הוכתמו במהלך הלילה עם 1 מיקרומטר AlPcS2a, ולאחר מכן הארה ממוקדת עם אור אינפרא אדום קרוב (633 ננומטר) בתוך הריבוע הצהוב. אות AlPcS2a בתוך הריבוע הצהוב הוא photobleached, מלווה היווצרות של TagRFP-galectin-3 puncta. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Cossart, P., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of viruses and bacteria.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).</li>
<li>Daussy, C. F., Wodrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRepair+me+if+you+can%26%2334%3B%3A+membrane+damage%2C+response%2C+and+control+from+the+viral+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">34;Repair me if you can&#34;: membrane damage, response, and control from the viral perspective.</a> Cells. 9 (9), 2042(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Sharma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer+and+for+infections%3A+what+is+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference.</a> Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).</li>
<li>Kübler, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>De Rosa, F. S., Bentley, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+skin+cancers%3A+sensitizers%2C+clinical+studies+and+future+directives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives.</a> Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Lavie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photodynamic+pathway+to+apoptosis+and+necrosis+induced+by+dimethyl+tetrahydroxyhelianthrone+and+hypericin+in+leukaemic+cells%3A+possible+relevance+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy.</a> British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).</li>
<li>Jay, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+destruction+of+protein+function+by+chromophore-assisted+laser+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).</li>
<li>Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated%2C+site-specific+inactivation+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).</li>
<li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li>
<li>Hsieh, C. W., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+mitophagy+with+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggering mitophagy with photosensitizers.</a> Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+Parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Molinari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuoles+induced+by+Helicobacter+pylori+toxin+contain+both+late+endosomal+and+lysosomal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).</li>
<li>Prince, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+a+lysosomal+pathway+regulating+neutrophil+apoptosis+by+a+major+bacterial+toxin%2C+pyocyanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin.</a> Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).</li>
<li>Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+photosensitizers+for+use+in+photochemical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection.</a> Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).</li>
<li>Berg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+internalization%3A+a+novel+technology+for+delivery+of+macromolecules+into+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol.</a> Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).</li>
<li>Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photodegradation+of+porphyrins+in+cells+can+be+used+to+estimate+the+lifetime+of+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen.</a> Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).</li>
<li>Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+8+targets+damaged+vesicles+for+autophagy+to+defend+cells+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion.</a> Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).</li>
<li>Repnik, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-leucyl-L-leucine+methyl+ester+does+not+release+cysteine+cathepsins+to+the+cytosol+but+inactivates+them+in+transiently+permeabilized+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes.</a> Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).</li>
<li>Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mannose+6-phosphate+receptor+and+the+biogenesis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes.</a> Cell. 52 (3), 329-341 (1988).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+Coordinates+a+cellular+system+for+lysosomal+repair+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal.</a> Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).</li>
<li>Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+lysophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor lysophagy.</a> Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).</li>
<li>Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+vitro+photochemical+internalization+protocol+for+3D+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures.</a> Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).</li>
<li>Daugelaviciene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+photodynamic+treatment+induces+primary+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%2C+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183(2021).</li>
<li>Hong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+galectins+control+cellular+responses+commensurate+with+cell+surface+carbohydrate+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition.</a> Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

AlPcS2a נקשר לקרום הפלזמה, ואז מופנם על ידי אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בליזוזומים. לפיכך ניתן למקם AlPcS2a בתאים התת-תאיים על ידי התאמת משך הדגירה. מגבלה של מתודולוגיה זו היא שרק תת-אוכלוסייה של עירויים יכולה להיות מסומנת על ידי AlPcS2a באמצעות אנדוציטוזה מכיוון שישנם מקורות ממברניים רבים אחרים של עירויים, כגון ER ומכשיר Golgi. בנוסף, התיוג הסלקטיבי של AlPcS2a לאנדוזומים מוקדמים או מאוחרים יהיה מאתגר, עם זאת, ניתן להשתמש בסמנים פלואורסצנטיים כדי להבדיל בין אנדוזומים שנוצרו ...

אנדוזומים, סוג של שלפוחית תוך תאית (IV), נוצרים על ידי אנדוציטוזה ולאחר מכן מתבגרים לליזוזומים. מסלולי אות תוך תאיים שונים מעורבים בהיווצרות עירויים; בנוסף, גירויים פנימיים וחיצוניים שונים יכולים לפגוע בעירוי (למשל, פתוגנים יכולים לברוח מהקרום התחום במהלך ההדבקה ולהיכנס לציטופלסמה1). זה בדרך כלל מלווה קרע של שלפוחיות endocytotic2. לכן, ניתן להשתמש בטכניקות למיקוד ופגיעה בעירוי במחקרים קשורים3.
טיפול פוטודינמי (PDT) הוא טיפול תלוי אור להילחם במחלות על ידי הריגת גידולים או פתוגנים4. ב-PDT, תאים ממוקדים מסומנים בכרומופורים לא רעילים, הנקראים פוטונסיטייזרים, שיכולים להיות מופעלים מקומית על ידי תאורת אור 5,6. פוטו-סנסיטייזרים סופגים אנרגיה מהאור והופכים למצב סינגלט מעורר, מה שמוביל למצב השלישייה הנרגשת מאריכת החיים. פוטוסנסיטיזרים של מצב השלישייה יכולים לעבור העברת אלקטרונים או אנרגיה וליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוכחות חמצן, ויכולים להרוס מרחבית תאים מסומנים באזור ההארה7. התוצאה משתנה בהתאם לעוצמת האור8. על ידי שליטה בריכוז הפוטונסיטייזרים ובעוצמת תאורת האור, ביומולקולות ממוקדות יכולות להיות מושבתות באופן סלקטיבי ללא ליזה של תאים, המכונה השבתת אור בסיוע כרומופור (CALI)9. עם הפיתוח המשמעותי של פוטונסיטייזרים שיכולים לתייג באופן סלקטיבי מטרות תת-תאיות שונות, CALI הפך לכלי רב ערך לשליטה בנטרול בתיווך אור של ביומולקולות עבור ביומולקולות קטנות כגון נוקלאוטידים וחלבונים, כמו גם אברונים כגון מיטוכונדריה ואנדו-ליזוזומים 3,10,11,12,13.
בהשוואה ל- CALI, שיטות כימיות או פיזיקליות משמשות גם לפגיעה בקרום, כגון רעלן חיידקי 14,15 וטיפול Leu-Leu-OMe16 לנזק ליזוזומלי. עם זאת, שיטות אלה מציגות פגיעה בכמות גדולה של עירויים בתוך תאים. פוטונסיטייזרים חזקים (כלומר, Al(III) phthalocyanine chloride disulfonic acid (AlPcS2a)) משמשים ב- CALI; AlPcS2a, המכוון את הליזוזומים באמצעות אנדוציטוזה, משמש לקרע אנדוזומים או ליזוזומים באזור מבוקר17. AlPcS2a הוא כרומופור מבוסס פתלוציאנין אטום לקרום התא הנקשר לשומנים בקרום הפלזמה ומופנם באמצעות אנדוציטוזה ובסופו של דבר מצטבר בתוך הליזוזום דרך המסלול האנדוציטי18. הוא בולע אור בתוך אזור ספקטרלי קרוב לאינפרא אדום ומייצר חמצן סינגלט, ROS עיקרי שנוצר על ידי AlPcS2a18 מעורר. דעיכת חמצן סינגלט מגבילה במהירות את הדיפוזיה שלו ואת מרחק התגובה שלו בתוך אזור זעיר בתאים (בערך 10-20 ננומטר)19. על ידי התאמת משך הדגירה ותאורת האור של AlPcS2a, מותרת בקרה מרחבית-זמנית על נזקי העירויים באזור תת-תאי. קאל"י הופכת אפוא לכלי רב עוצמה לבחינת ההשלכות של נזק לעירוי, והיווצרותם וויסותם של עירויים.
במחקר זה, פרוטוקול ספציפי של CALI המשתמש ב- AlPcS2a כפוטוסנסיטיזר מטופל. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על סוגים שונים של עירויים, כולל אנדוזומים וליזוזומים, ומשמש לבחינת תגובות המעקב לאחר קרע בממברנה. תאי HeLa המבטאים גלקטין מצומד-3 פלואורופור16,20 המתגלים לאחר קרע ליזוזום משמשים להדגמת פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td><חזק>מגיב </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Al(III) פתלוציאנין כלוריד חומצה דיסולפונית (AlPcS2a)Frontier</td> <td>Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית</td><td>ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>תרבית DMEM</td><td></td><td></td><td>בינונית בתוספת 10% FBS ו-100 U/mL פניצילין G ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP פלסמיד</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 ערכת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker ירוק DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td>צבע פלורסנט ירוק</td></tr><tr><td>Multiwall צלחת</td><td>perkinelmer</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4</td></tr><tr><td><חזק>קו תאים</חזק> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa Cell Line</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>השיטות ישימות לרוב קווי התאים המחוברים. יש לקבוע את התנאים באופן פרטני.</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן</td><td>Merck</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>תאורת LED קולימטית&nbsp; (660 ננומטר)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 ו-DC2100</td><td>Near-infared light הוא בסיס אידיאלי על ספקטרום העירור של AlPcS2a.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>נדרשת מערכת דגירה להדמיה ארוכת טווח.</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אדום LED אור</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

שלפוחיות תוך תאיות (IVs) נוצרות באמצעות אנדוציטוזה של שלפוחיות לתוך ציטופלסמה. היווצרות IV מעורבת בהפעלת מסלולי אות שונים באמצעות חדירה של ממברנות IV והיווצרות אנדוזומים וליזוזומים. שיטה בשם השבתת לייזר בסיוע כרומופור (CALI) מיושמת כדי לחקור את היווצרות העירויים ואת החומרים בבקרת ויסות IV. CALI היא מתודולוגיה פוטודינמית מבוססת הדמיה לחקר מסלול האיתות המושרה על ידי חדירת ממברנה. השיטה מאפשרת מניפולציה מרחבית-זמנית של האברון שנבחר להיות חדירה בתא. שיטת CALI יושמה כדי לצפות ולנטר מולקולות ספציפיות באמצעות חדירה של אנדוזומים וליזוזומים. הקרע בקרום העירוי ידוע כמגייס באופן סלקטיבי חלבונים קושרי גליקן, כגון גלקטין-3. כאן, הפרוטוקול מתאר את השראת הקרע IV על ידי AlPcS2a ואת השימוש בגלקטין-3 כסמן לסימון ליזוזומים לקויים, אשר שימושי בחקר ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום IV ואת ההשפעות במורד הזרם במצבים שונים.

איור סכמטי המייצג את הנזק שנגרם על-ידי AlPcS2a של IV, כולל אנדוזום וליזוזום, הוצג (איור 1).
ניתן להשתמש בסמנים זמינים מסחרית כדי לקבוע את תנאי הצביעה של AlPcS2a . לדוגמה, AlPcS2a puncta וצבע פלואורסצנטי ירוק22 לוקליזציה (איור 2).
ניתן ליישם גלקטין-3 עם תווית פלואורופורית כאינדיקטור לניטור נזק לעירוי (איור 3). יתר על כן, נ...

AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

אנדוציטוזה של שלפוחית לתוך ציטופלזיה גורמת להיווצרות שלפוחיות תוך תאיות. חדירה של שלפוחית מפעילה מסלולי אות שונים. השבתת לייזר בסיוע כרומופור משמשת לחקר התוצאה של קרע שלפוחית תוך תאית.בקרה מרחבית וזמנית של נזק תת-תאי לשלפוחיות תוך-תאיות יכולה להיות מושגת על ידי התאמת מצב העמידה ותאורת האור. כדי להתחיל, לשמור על תרבית תאי HeLa ב DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר שטיפת התאים עם PBS, טריפסיניזציה של התאים.לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10% FBS. לדלל 300 ננוגרם של פלסמיד Gal3-GFP ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן להוסיף 0.6 מיקרוליטר P3000 מגיב.ולערבב בעדינות, ולאחר מכן מערבלים את התמיסה. לדלל 0.45 מיקרוליטר של מגיב Lipofectamine 3000 ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בעדינות. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן מערבבים DNA מדולל וליפופקטמון 3000 מדולל ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב תערובת ה- DNA lipofectamine, 300, 000 תאי HeLa מרחפים ו -200 מיקרוליטר DMEM עם 10% FBS, זרעו את התאים באזור הזכוכית המרכזי של צלחת כפתור זכוכית 35 מ"מ. כדי לאפשר חיבור תאים, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות לפחות.לדלל AlPcS2a ב- DMEM בתוספת 10% FBS כדי ליצור פתרון AlPcS2a מיקרומולרי אחד. חממו מראש את המדיום המכיל AlPcS2a באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והחליפו את מדיום התרבית בתווך המכיל AlPcS2a. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה.למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר AlPcS2a חוץ-תאי לאחר החלפת המדיום במדיום טרי. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות כדי לאפשר לשאריות צבע לאורך המסלול האנדוציטי להצטבר לליזוזומים. כדי לתפעל תאים בודדים על ידי פגיעה בליזוזומים, הניחו את צלחת התרבית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי.השתמש בלייזרים בגודל 488 ננומטר ו- 561 ננומטר לקבלת GFP ו- AlPcS2a מלהיבים, בהתאמה. הקף אזור מרובע בגודל חמישה על חמישה מיקרומטר של עניין על שלפוחיות המסומנות ב- AlPcS2a שנבחרו להינזק. ואז פולס להאיר את האזור של עניין עם לייזר 633 ננומטר של 0.21 מילי וואט, או 70 חזרות.עקוב אחר היווצרות Gal3 puncta כאינדיקטור לחדירת קרום ליזוזומלי. צביעה ליזוזומלית עם AlPcS2a בתאי HeLa בוצעה באמצעות סמנים זמינים מסחרית, ונצבעו באופן חיובי בצבע פלואורסצנטי ירוק. ליזוזומים בתאי TagRFP-Galectin3 המבוטאים ב-HeLa היו מוכתמים ב-AlPcS2a.לאחר מכן הארה ממוקדת עם אור אינפרא אדום קרוב, התוצאות מצביעות על כך שהפעלת לייזר בסיוע כרומופור מבוססת AlPcS2a הצליחה לשלוט בקרע ליזוזומלי מקומי באזור העניין, והשאירה את שאר הליזוזומים ללא פגע. שלב זה חשוב מכיוון שזמן הדגירה יקבע אנדוזומים עומדים או ליזוזומים. לדוגמה, אנשים יכולים לקבוע את הגודל של על ידי שחרור של צבע בלתי חדיר קרום.כמו כן ניתן להשתמש בצבעים רגישים ל- pH כגון FITC dextran כדי להבדיל בין אנדוזומים וליזוזומים. טכניקה זו שימושית החל את ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום שלפוחית תוך תאית. ויש השפעות במורד הזרם במצבים שונים.

a-photodynamic-approach-to-study-function-intracellular-vesicle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

חקור שימוש ב-CALI מבוסס AlPcS2a לחקר נזק מרחבי-זמני לשלפוחיות תוך-תאיות בתאי HeLa חיים. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בנזק תת-תאי וחושפת מסלולי איתות הנגרמים מקרע שלפוחית.

גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

גלה סרטונים נוספים