הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

שיטה זו יכולה ליצור במהירות תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניתוח של התפלגות מרחבית וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים תוך מתן אפשרות לניתוח מהיר של דגימות מרובות. התאים נמדדים באמצעות מערכת ציטומטריה מתקדמת של זרימת הדמיה, המשלבת מהירות, רגישות ותמונות מפורטות של תאים בודדים עם מידע מרחבי המניב נתונים ייחודיים שלא ניתן לספק על ידי אופטומטריה של זרימות או מיקרוסקופיה. עצה חשובה אחת היא לספק מספיק תאים כדי לקבוע את הגדרות המכשיר ואנחנו משעים את התאים בצפיפות הגבוהה עבור המדידות.

מלבד זאת רכישת נתונים היא פשוטה ודומה לציטומטריית זרימה קונבנציונלית. ראשית ליצור את קווי התא DLBCL כפי שמתואר בכתב היד. לאחר מכן הוסיפו תמיסת EdU של 10 מילימולאר ביחס של 1 ל-1000 לתוך תרבית התאים DLBCL ודגרו את הצלחת באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לאחר ערבוב הצלחת על ידי נדנדה עדינה.

הוציאו את הצלחת לאחר הדגירה והוסיפו תמיסת כלורוקווין 100 מילימולר לריכוז סופי של 75 מיקרומולר. מערבבים על ידי נדנדה עדינה ודוגרים במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 20 מילימולר C12 FDG לריכוז סופי של 20 מיקרומולר.

לאחר ערבוב עדין, דגרו את הצלחת למשך שעה כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, הוסף 100 מילימולר 2-פנילתיל-בטא-d-thiogalactoside פתרון אחד עד 50 כדי לעצור את כתמי בטא-גל FSA. ומסובבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב.

מעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מיליליטר ומסתובבים פי 100 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שהסופרנטנט מושלך, שטפו את התאים בארבעה מיליליטר של PBS וצנטריפוגה ב-100 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השהה מחדש את כדורי התא ב-500 מיקרוליטרים בתמיסת קיבוע של 4% פרפורמלדהיד.

לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב-250 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט ושטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של PBS פעמיים וצנטריפוגה ב-100 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה, יש להשליך את הסופר-נטנט ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר חלחול של סאפונין.

עכשיו להעביר את ההשעיה לצינור חדש 1.5 מיליליטר לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. גלולו את התאים ב-250 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית ולדגור בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, בחושך.

צנטריפוגה של הצינורות ב 250 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נטנט ולשטוף עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת שטיפת סאפונין. לאחר שטיפת התאים פעמיים, יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשעות מחדש את כדורי התאים ב-500 מיקרוליטרים של קוקטייל זיהוי EdU.

דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך וצנטריפוגה ב-250 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופר-נטנט ולשטוף עם מיליליטר אחד של תמיסת שטיפת סאפונין. חזרו על הכביסה פעמיים, השליכו את הסופר-נטנט והשעו מחדש את כדורי התא ב-20 עד 50 מיקרוליטרים של PBS.

לפני הפעלת המכשיר, רוקן את בקבוק נוזל הפסולת ובדוק את רמות SpeedBeads, מעקר, מנקה, debubbler ו נדן מספיק נוזלים. לאחר הפעלת המכשיר ותוכנת ההדמיה, לחץ על כפתור ההפעלה כדי לאתחל fluidics וכיול המערכת. הגדר את ההגדלה ל- 40 פעמים והגדר את מהירות הזרימה לנמוכה.

לאחר הפעלת הלייזרים, הפעל לייזר של 405 ננומטר כדי למדוד את EdU Pacific Blue, 488 ננומטר כדי למדוד C12-FDG ו-642 ננומטר כדי למדוד את Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. הגדר ערוץ שש לערוץ הפיזור, ערוץ 1 וערוץ תשע לשדה הבהיר. לאחר מכן התחל עם הדגימה שצפויה להיות בעלת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים והפוך בעדינות את צינור הדגימה כדי לערבב.

לאחר פתיחת מכסה הצינור, הכנס את צינור הדגימה לרציף. לחץ על טען כדי להתחיל ולפתוח עלילת פיזור. לאחר מכן, בחר את אזור תכונות, קו תחתון MO1 ויחס גובה-רוחב מדגישים MO1 עבור צירי X ו- Y בהתאמה.

הגדר שער מעל יחס גובה-רוחב של 0.5 כדי לא לכלול כפילים וצברי תאים מתחת ובצד ימין ואת אוכלוסיית SpeedBead בצד שמאל. כעת, פתחו את 'התוויית היסטוגרמה' ובחרו בריבוע הממוצע של שורש מעבר הצבע של מסיכה 1 ובערוץ 1 עבור ציר X. בחר את אוכלוסיית הסינגלט והגדר את השער לבחירה עבור תאים ממוקדים.

פתחו התוויית היסטוגרמה ובחרו עוצמות פיקסלים מרביות גולמיות לערוץ שתיים, שבע ו-11 בציר X. לאחר מכן התאם את עוצמות הלייזר של 488 ננומטר, 405 ננומטר ו- 642 ננומטר לייזרים לערוץ שתיים, שבע ו -11 בהתאמה, כך שלכל פלואורוכרום יש ערך פיקסלים מקסימלי גולמי בין 100 ל -4, 000 כדי למנוע פיזור יתר. בחר את האוכלוסייה הממוקדת להקלטה ולחץ על רכוש כדי למדוד את דגימות DLBCL עם הגדרות עקביות.

בעת שינוי דגימות למדידה, לחץ על חזור כדי לשחזר את צינור הדגימה. לחצו על 'טען' כדי למחוק את הדגימה. לאחר מדידת כל הדגימות, כבה את השדה הבהיר ופיזר לייזר.

מדוד דגימות בקרת צבע בודדות כדי ליצור מטריצת פיצוי. לחץ על כיבוי כדי לסגור את מערכת ההדמיה. נתח את הנתונים בתוכנת ניתוח התמונות.

השתמש בכלי Spot Wizard של תוכנת ניתוח התמונות כדי לספור ולכמת באופן אוטומטי מוקדי גמא H2AX גרעיניים ותמונות של תאים חיים. בחר שתי אוכלוסיות תאים, אחת עם ספירת נקודות גבוהה ואחת עם ספירת נקודות נמוכה כדי לאמן את אשף הספוט לניתוח אוטומטי נוסף של ספירת נקודות. שיטת הציטומטריה של זרימה בתמונות של תאים בודדים הראתה עלייה ב-C12-FDG חיובי, נגטיב EdU, גמא H2AX חיובי, אוכלוסייה סנסקית ו-KARPAS422.

תאי WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6. הניתוח מבוסס ההדמיה הציג מספרים גבוהים משמעותית של מוקדי גמא H2AX ו-KARPAS422, WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6. תוצאות דומות היו מיוצגות על ידי נתוני תדירות וכימות.

הוספת סאפונין לתרחיף התא היא חיונית, אחרת הנוגדנים אינם יכולים להגיע לאנטיגנים הפנימיים של התא ודטרגנטים קשים מובילים לאובדן אות C12-FTG הדמיה ציטומטריה אופטימלית לניתוח שינויים בלוקליזציה של סמנים כמו טרנסלוקציה של גורם שעתוק לגרעין בתגובה לגירויים מסוימים. ניתוח כזה יכול להיות מושגת גם עם הפרוטוקול שלנו. שיטה זו מאפשרת הדמיה של סמנים פלואורסצנטיים מרובים ברמה של תא יחיד המסייעת לזהות את הנוכחות, העוצמה והלוקליזציה של האותות הבודדים.