ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס
6 ביולי 2022
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.
פרוטוקול זה מראה כיצד הרכבנו ואפיינו את השכבה לפי שכבה JBNm ברמה המולקולרית. JBNm עוטף את TGF-B1, ומונע את שחרורו ברקמה הסובבת, ובכך מקדם כונדרוגנזה מקומית. היווצרות ה- JBNm מתוקננת, ומאפשרת ליצור JBNms שונים עבור יישומים עתידיים.
מבנה השכבה הייחודי מאפשר עטיפת גורם גדילה, יצירת שחרור מקומי קבוע, המונע היפרטרופיה, ומקיים צמיחה. JBNm מספקת מיקרו-סביבה הומאוסטטית להתחדשות רקמת סחוס, בתוך מקום סגור, בשל יכולת ההזרקה שלה, אשר יכולה לשמש לתרחישים שונים, כמו שברים או חללים בצורה לא סדירה. כדי להתחיל, להוסיף שמונה מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר TGF-B1, תלוי במים ל 32 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר Matrilin-3 תלוי במים.
פיפטה כדי להבטיח ערבוב נכון של חלבונים אלה. הוסף 80 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר. ננו-צינוריות בסיס יאנוס, או JBNts תלויות במים, לתמיסת TGF-B1, Matrilin-3.
פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח מיזוג נכון. עבור קבוצת JBNt, הוסף חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר, JBNts ל-50 מיקרוליטר מים כדי ליצור תמיסה של 90.9 מיקרוגרם למיליליטר. עבור קבוצת Matrilin-3, הוסף 40 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר מטרילין-3 עד 15 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסה של 7.3 מיקרוגרם למיליליטר.
עבור קבוצת TGF-B1, הוסף 10 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר, של TGF-B1 ל-45 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסה של 1.8 מיקרוגרם למיליליטר. עבור קבוצת הננו-מטריקס של בסיס יאנוס או JBNm, הוסף 40 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר, מטרילין-3 עד 10 מיקרוליטרים של 10 מיקרוגרם למיליליטר TGF-B1. התסיסו כדי להבטיח ערבוב נכון.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts לתמיסה, שוב ושוב pipetting לערבב את הדגימה. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ספקטרום הקליטה של כל קבוצה. תייג את ה-TGF-B1 באמצעות ערכה לסימון חלבונים, בהתאם להוראות היצרן.
הוסף 20 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר, המסומנים TGF-B1, ל -25 מיקרוליטר מים, כדי ליצור תמיסת בדיקה של 8.9 מיקרוגרם למיליליטר. תייג את Matrilin-3 באמצעות ערכת תיוג נפרדת. הוסף 20 מיקרוליטרים של 80 מיקרוגרם למיליליטר המסומנים Matrilin-3 עד 25 מיקרוליטר מים, כדי ליצור פתרון בדיקה של 36 מיקרוגרם למיליליטר.
יש לערבב 20 מיקרוליטרים של 80 מיקרוגרם למיליליטר עם התווית Matrilin-3 עם 20 מיקרוליטרים של 20 מיקרוגרם למיליליטר המסומנים TGF-B1, וחמישה מיקרוליטרים של מים, והתוצאה היא TGF-B1, תרכובת Matrilin-3 המסומנת. פיפטה את התערובת מספר פעמים כדי לערבב. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts ל-40 מיקרוליטרים של מים, והתוצאה היא תמיסה של 111 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר JBNts לתמיסת TGF-B1, Matrilin-3 המסומנת, ופיפטה שוב ושוב כדי לערבב את התרכובת. מעבירים כל קבוצת דגימה לבאר של צלחת באר 384 שחורה. טען את הצלחת לקורא מיקרו-פלטות רב-מצבי, ובצע מדידות באורכי גל עירור של 488 ו-555 ננומטר בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.
בתנאים פיזיולוגיים, ספקטרום פוטנציאל הזטה של מטרילין-3 היה טעון שלילית בשל הנקודה האיזואלקטרית שלו. לאחר הוספת TGF-B1 למטרילין-3, פוטנציאל הזטה של תרכובת TGF-B1 Matrilin-3 גדל לערך כמעט נייטרלי. פוטנציאל הזטה של JBNm היה הגבוה ביותר מבין שלוש הקבוצות.
ספקטרום הקליטה הנראה לעין של UV אישר את היווצרות השכבה ההיררכית לפי מבנה פנימי של השכבה של ה- JBNm, הטבעות הארומטיות של שרשראות הצד של הליזין, וה- JBNts תרמו לפסגות הקליטה, ב 220 ו -280 ננומטר בהתאמה. TEM שימש לאפיון המורפולוגיה של JBNts ו- JBNm. לאחר שילוב עם חלבונים, צרורות עבים של JBNm נצפו יוצרים מבנה פיגומים.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה את נוכחות השכבה לפי מבנה שכבה, והדגימה את חתך הרוחב של JBNm. לאחר סימון הפלואורסצנט האדום Matrilin-3 עטף את צרורות JBNt, ויצר את השכבה החיצונית של JBNm, בעוד TGF-B1 הפלואורסצנטי הירוק יצר שכבה פנימית. העברת אנרגיית התהודה הפלואורסצנטית הציגה שיאי פליטה של 520 ננומטר עבור קבוצות TGF-B1 המסומנות, ו-570 ננומטר עבור קבוצות מטרילין-3.
נבדקה ההשפעה של JBNm על ההידבקות והתפשטות התאים של HMSC. ה-JBNm הראה ש-HMSCs מקובצים יחד עם עצמו, בעוד שפחות תאים דבקו ב-JBNts. יישור התאים וגודל התאים ב-JBNm הראו כי JBNts מילאו תפקיד בהידבקות התאים, בעוד שהחלבונים הגבירו את הזיקה של הידבקות תאים.
לאחר היום הראשון של תרבית התאים, קבוצות JBNm ו-TGF-B1 הראו שגשוג תאים משמעותי בהשוואה לקבוצות האחרות. כאשר משך מבנה התא הוגדל לשלושה וחמישה ימים, קבוצות JBNm ו-TGF-B1 הדגימו התפשטות תאים מוגברת עוד יותר. כאשר מתייגים באופן פלואורסצנטי את ה- JBNm, חשוב שה- TGF-B1 וה- Matrilin-3 יסומנו בנפרד ויתערבבו לפני הוספת ה- JBNts, כדי לאפשר היווצרות תקינה של השכבה לפי מבנה שכבה.
הערכה נוספת של הפיגומים יכולה לספק הבנה כיצד הם יעילים בטיפולים טיפוליים. ליתר דיוק, בדיקת התפשטות תפוקה גבוהה, יכולה לקבוע את המינון האופטימלי במבחנה, ומאוחר יותר in vivo. יצירת NanoMatriX חדשנית זו מאפשרת לחוקרים להשתמש בפיגום הזרקה המבוסס על ננו-חומר כדי לחדש את הסחוס.
גישה זו של חיקוי פולי מאפשרת אנדרוגנזה משופרת והתפשטות אתר נגדי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את ההרכבה והאפיון של פיגום מטריצה ננו-בסיסית מסוג Janus בשכבות (JBNm). ה-JBNm מקפסל TGF-β1, ובכך מקדם כונדרוגנזה מקומית ומספק מיקרו-סביבה הומאוסטטית ל재גנרציה של רקמת סחוס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביומטריאלים
- הנדסת רקמות
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- ננו-צינורות בעלי בסיס ינוס (JBNts) משמשים להרכבת פיגומים.
- TGF-β1 חיוני לקידום תפקודי תאים.
- מבנה ה-JBNm מאפשר שחרור מבוקר של גורמי גדילה.
- ניתנות ההזרקה של JBNm מאפשרת יישום בפגמים בעלי צורה לא סדירה.
מטרת המחקר
- ליצור פיגום התומך ברגנרציה של רקמת סחוס.
- לסטנדרטיזציה של יצירת JBNm עבור יישומים שונים.
- לאנקפסולציה של גורמי גדילה לשחרור ממושך ומניעת היפרטרופיה.
שיטות שהוכנסו לשימוש
- הוספה רציפה של TGF-β1 ו-Matrilin-3 ליצירת JBNm.
- אפיון של הפיגום ברמה המולקולרית.
- הערכת ביו-אקטיביות הקשורה להיצמדות תאים ולשגשוגם.
- הערכת יכולת ההזרקה של הפיגום עבור יישומים מעשיים.
תוצאות עיקריות
- ה-JBNm הפגין ביואקטיביות מצוינת וקידם תפקודי תא.
- הושגה שחרור מקומי של TGF-β1, אשר שיפר את התהליך הכונדרוגני.
- הפיגום שמר על סביבה הומאוסטטית לצורך רגנרציה של רקמות.
- תהליך יצירה סטנדרטי מאפשר יישומים רב-גוניים בהנדסת רקמות.
מסקנות
- פיגום ה-JBNm בשיטת שכבה-על-שכבה יעיל לרגנרציה של סחוס.
- כליאה של גורמי גדילה מועילה לתיקון רקמה מקומי.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון תרחישים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הננו-מטריצה הבסיסית של ינוס (JBNm) הבנויה בשכבות מאפשרת מיקום מדויק של גורמי גדילה ובקרה מתמשכת של המיקרו-סביבה, ובכך נותנת מענה לאתגר מרכזי ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת רקמות. פלטפורמה זו תומכת בביטחון חיזוי בסריקת חומרים ביו-מטריאליים בשלבים מוקדמים ומפחיתה סיכונים בקידום טרנסלציונלי על ידי מזעור השפעות לא רצויות והיפרטרופיה. ההרכבה הסטנדרטית והיכולת להזרקה ממצבות אותה כ spaceship רב-פעמית עבור מודלים פרה-קליניים מגוונים לתיקון סחוס.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של קונדרוגנזה המתווכת על ידי גורמי גדילה בסביבות מיקרו מבוקרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות TGF-β1 בתוך פיגומים מוגבלים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של אינטראקציות בין חומרי ביו-מטריאל לחלבונים לצורך רגנרציה של רקמות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פיגום סטנדרטי וניתן לשחזור עבור בדיקות כמותיות של היצמדות ותגדילות של תאים.
- מאפשר הערכה בקיבולת גבוהה (high-throughput) של הרכב הפיגום ואנקפסולציה של גורמי גדילה.
- מספק תוצאות עקביות וכמותיות לצורך הערכה השוואית של מועמדים לחומרים ביומטיריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי תמיכה ברגנרציה מקומית של סחוס in vitro ו-in vivo.
- שומר על רצף טרנסלציוני באמצעות פורמטים של פיגומים הניתנים להזרקה ולהתאמה עבור פגמים לא סדירים.
- מפחית את הסיכון להיפרטרופיה ולהשפעות לא רצויות, ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים.
אינטגרציית צינור עיבוד וזרימת עבודה
פלטפורמת JBNm משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת בדיקת היפותזות, פיתוח בדיקות (assays) ומחקר תרגומי בתהליכי עבודה לתיקון סחוס.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהערכה מבוססת השערות של השפעות גורמי גדילה בסביבות מיקרו-הנדסיות.
- סריקה: מספקת מדדים כמותיים הניתנים לשחזור עבור היצמדות ותחלובת של תאים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידות UV-Vis, פלואורסצנציה ופוטנציאל זטא לאפיון של פיגומים.
- מחקר תרגומי: מקל על המשכיות מסריקה in vitro למודלים של התחדשות סחוס in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: הרכבה סטנדרטית מאפשרת התאמה לתוכניות שונות של הנדסת רקמות וחומרים ביולוגיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ברגנרציה של רקמות המתווכת על ידי פיגום ובתיקוף של המטרה.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים להרחבה לייצור וניתוח רב-חיזוריים של פיגומים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי מזעור השפעות של גורמי גדילה שאינם פוגעים במטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לחומרי ביו-מטריאל עבור תהליכי פיתוח ברפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת חומרי ביו-מטריאל, סימון חלבונים וטכניקות לאפיון פיגומים (scaffolds).
- נדרשת גישה לתשתיות של ספקטרופוטומטריה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו-TEM.
- נדרש תיקנון בין-צוותי להכנה וניתוח עקביים של הפיגומים.
- ניתן להתאימה למערכות מודל שונות, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה עבור יעדי רקמה ספציפיים.
- מגבלות מעשיות כוללות בקרה מדויקת על יחסי הרכיבים ויעילות הסימון.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
