Name: כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: למדו צביעת אימונופלואורסצניה בתלת מימד בכליות שלמות באמצעות פרוטוקול CUBIC. שיטה זו מאפשרת חדירת נוגדנים משופרת והדמיה ברורה של מבני הכליה לחקירת פתולוגיות כלייתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חלק מעבודה זו נערך בשיתוף פעולה עם פרופ' הירוקי ר. אואדה (אוניברסיטת טוקיו), פרופ' אטסואו א. סוסאקי (אוניברסיטת ג'ונטנדו), פרופ' טטסוהירו טאנאקה (אוניברסיטת טוהוקו), פרופ' מסאפומי פוקגאווה, ד"ר טקהיקו ואדה וד"ר הירוטאקה קומבה (אוניברסיטת טוקאי).

כל הניסויים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת טוקיו. כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. עכברי C57BL/6NJcl זכרים, בני 8 שבועות, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת בעלי חיים וקיבוע כליות
<ol><li>בצע קיבוע פרפוזיה לפי השלבים הבאים.<ol><li>הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (3%, 2.0 ליטר/דקה) ומתן תוך-צפקי של מדטומידין הידרוכלוריד (0.3 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול טרטרט (5 מ"ג/ק"ג) ומידזולם (4 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>יש ליטול את החיה עם 20 מ"ל של PBS (pH 7.4) ו-30 מ"ל של 4% PFA בחיץ פוספט (PB) דרך החדר השמאלי של הלב12.</li>
	</ol></li>
	<li>בצעו את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלף ודגימת הכליות9.<ol><li>טבלו את הכליה ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות, ואז שטפו אותה עם PBS במשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1). אזהרה: פורמלדהיד ופרפורמלדהיד הם חומרים מגרים רעילים. טפלו בריאגנטים במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דה-קולוריזציה ודליפידציה
<ol><li>הכן את CUBIC-L לדה-צביעה ולעדנה המורכבת מ-10 wt% של טריטון X-100 ו-10 wt% של N-buthyldiethanolamine (ראו טבלת חומרים), בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.</li>
	<li>בצע דה-צביעה והפחתה על-ידי CUBIC-L בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>טבלו את הכליה הקבועה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-L (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-L) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 2A). לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם רעידות עדינות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.</li>
		<li>רענן את CUBIC-L מדי יום במהלך תהליך זה. לאחר תהליך הדה-צביעה וההעדה, שטפו את הכליה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים (שלוש פעמים)9 (איור 1). השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה (איור 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>3. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה
<ol><li>מכינים את המאגרים המכתימים.<ol><li>הכינו את חיץ הצביעה לנוגדנים ראשוניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.5% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.</li>
		<li>הכינו את מאגר הצביעה לנוגדנים משניים על ידי ערבוב של 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% קזאין ב-PBS ו-0.05% נתרן אזיד9.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע צביעה עם נוגדנים ראשוניים.<ol><li>Immunostain הכליה הפגועה עם נוגדנים ראשוניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) במאגר המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 7 ימים. הערה: כמות חיץ הכתמים הדרושה לכליה אחת היא 500-600 μL (איור 2C).</li>
		<li>שטפו את הכליה ב-0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS (PBST) בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).</li>
	</ol></li>
	<li>בצע צביעה עם נוגדנים משניים.<ol><li>מכתים את הכליה בנוגדנים משניים (1:100 או 1:200, ראו טבלת חומרים) בחיץ המכתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות למשך 7 ימים. שטפו את הכליה עם PBST בטמפרטורת החדר למשך יוםאחד 9 (איור 1).</li>
		<li>לאחר קיבוע9, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB (תערובת של 37% פורמלדהיד ו-PB ביחס של 1:36) למשך 3 שעות, ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 6 שעות (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. התאמת מקדם שבירה (RI)
<ol><li>הכן CUBIC-R+.<ol><li>הכינו את CUBIC-R על ידי ערבוב של 45 wt% של 2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין ו-30 wt% של ניקוטין-אמיד (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>הכן את CUBIC-R+ להתאמת מקדם השבירה (RI) על ידי הוספת 0.5 v% של N-buthyldiethanolamine ל- CUBIC-R בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר 4,8,9.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את התאמת ה- RI.<ol><li>יש לטבול את הכליה ב-7 מ"ל של 50% (v/v) CUBIC-R+ (תערובת של 1:1 של מים ו-CUBIC-R+) בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר מכן, טבלו אותו ב-7 מ"ל של CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מ"ל עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך יומיים9 (איור 1). הערה: למרות שהכליה צפה ב-50% CUBIC-R+ בתחילת התאמת ה-RI, היא שוקעת והופכת לשקופה ב-CUBIC-R+ בסוף התהליך (איור 2D).</li>
	</ol></li>
</ol>5. רכישת תמונה ושחזורה
<ol><li>טבלו את הכליה התואמת ל-RI בתערובת של שמן סיליקון (RI = 1.555) ושמן מינרלי (RI = 1.467) (55:45) במהלך רכישת התמונה (RI = 1.51)5 (איור 3).</li>
	<li>קבל תמונות תלת-ממדיות של הכליה כולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטיבעל 9 יריעות אור שנבנה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים). אסוף את כל נתוני התמונה הגולמיים בתבנית TIFF של 16 סיביות. הצג באופן חזותי ולכוד את התמונות המעובדות בתלת-ממד באמצעות תוכנת ניתוח ההדמיה (Imaris, ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+three-dimensional+analysis+%28CUBIC-kidney%29+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול הנוכחי איפשר הדמיה תלת-ממדית של כליות שלמות של מבנים שונים כגון עצבים סימפתטיים, צינורות איסוף, עורקים, צינוריות פרוקסימליות וגלומרולי 9,10,11. שיטת צביעה זו הציעה תצפית מקרוסקופית והובילה לתגליות ביולוגיות חדשות, על ידי הדמיה של השינוי בעצבים הסימפתטיים הכלייתיים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה 9,10 וגלומרולאומגהליה בשלב הראשוני של מחלת כליות סוכרתית 11.<sup clas...

הכליה מורכבת מאוכלוסיות תאים שונות. למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית נותנת לנו מידע רב על המיקרו-סביבה של הכליות, יש צורך בהדמיה תלת-ממדית (3D) כדי להבין במדויק את ההצלבה הבין-תאית במהלך התקדמות מחלת הכליות. בעבר, היה צורך לבצע מספר עצום של חתכים סדרתיים ושחזור תמונה עבור הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם1. עם זאת, שיטה זו דרשה מאמץ רב מדי והיו לה בעיות מבחינת יכולת השכפול.
סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על מכשולזה 2,3. אטימות הרקמות נובעת בעיקר מפיזור וספיגת אור מכיוון שכל איבר מורכב מחומרים שונים, כולל מים, חלבון ושומנים. לפיכך, האסטרטגיה הבסיסית של ניקוי רקמות היא החלפת מים ושומנים ברקמות עם מקדם שבירה (RI) תואם ריאגנטים בעלי תכונות אופטיות זהות לאלה של חלבונים4. על מנת לצפות בדגימה שקופה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור שימושית5. לוחות אור מאירים את הדגימה השקופה מהצד, ואותות עירור נרכשים דרך העדשה האובייקטיבית הממוקמת במצב אנכי6. מיקרוסקופיה זו מקבלת מידע חתך רוחב במטאטא אחד, השונה מהמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית הקונפוקלית או הרב-פוטונית. לכן, הוא יכול לרכוש במהירות z-stack תמונות עם רמה נמוכה של photobleaching.
קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של דימות מוח/גוף ואנליזה חישובית (CUBIC) היא אחת משיטות ניקוי הרקמות המאפשרת הדמיה של איברים שלמים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור 2,7,8. מכתים אימונופלואורסצנטיים מעוקבים ושלמים ממוטבים במחקר הנוכחי כדי לדמיין מבנים תלת-ממדיים של כליות עכברים 9,10,11. באמצעות שיטת צביעה זו, השינוי בעצבים סימפתטיים כלייתיים הוא הדמיה לאחר פגיעה איסכמיה-reperfusion 9,10 ו glomerulomegaly בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית 11, כמו גם כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, ואיסוף צינורות בכליה שלמה9.

<table><tbody><tr><td>14 מ"ל תחתית עגולה בהירות גבוהה PP מבחנה</td><td>פלקון</td><td>352059</td><td>ניקוי רקמות, צביעה, שטיפה</td></tr><tr><td>2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון/אנטיפירין</td><td>טוקיו תעשייה כימית</td><td>D1876</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>37%-תמיסת פורמלדהיד</td><td>נקלאי טסק</td><td>16223-55</td><td>לאחר קיבוע</td></tr><tr><td>4%-פרפורמלדהיד תמיסת חיץ פוספט</td><td>נקלאי טסק</td><td>09154-85</td><td>קיבוע כליות</td></tr><tr><td>קמח אלקסה 555 חמור מצומד נגד כבשים נוגדן IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21436</td><td>נוגדן משני (1:100)</td></tr><tr><td>קמח אלקסה 647 חמור מצומד נגד ארנב נוגדן IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>נוגדן משני (1:200)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד אקוופורין 2 (AQP2) Abcam</td><td></td><td>ab199975</td><td>נוגדן ראשוני (1:100)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד פודוצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372</td><td>נוגדן ראשוני (1:100)</td></tr> <tr><td>נוגדן אנטי נתרן גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2) נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab85626</td><td>נוגדן ראשוני (1:100)</td></tr> <tr><td>נוגדן אנטי טירוזין הידרוקסילאז (TH)</td><td>Abcam</td><td>ab113</td><td>נוגדן ראשוני (1:100)</td></tr> <tr><td>נוגדן אנטי &אלפא שריר חלק אקטין (&alpha;-SMA)</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>נוגדן ראשוני (1:200)</td></tr><tr><td>חוסם קזאין ב-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37528</td><td>מאגר מכתים</td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrate</td><td>Meiji</td><td>005526</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>C57BL/6NJcl</td><td>Nippon Bio-Supp.Center</td><td>N/A</td><td>זן עכבר</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>תוכנת ניתוח הדמיה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זום</td><td>מאקרו OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td>יחידת התצפית של המיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>Medetomidine Hydrochloride</td><td>Kyoritsu-Seiyaku</td><td>008656</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>מידזולם</td><td>SANDOZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27803229 שמן מינרלי</td> הרדמה <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>שמן טבילה</td></tr><tr><td>N-buthyldiethanolamine</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>B0725</td><td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Tokyo תעשייה כימית</td><td>N0078</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td>CUBIC-L, PBST</td></tr><tr><td>שמן סיליקון HIVAC-F4</td><td>Shin-Etsu</td><td>שמן טבילה</td>כימי <td>50449832</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Wako</td><td>195-11092</td><td>מאגר מכתים</td></tr></tbody></table>

כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם cubic

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

למרות שהפתולוגיה הקונבנציונלית סיפקה מידע רב על מיקרו-מבנה הכליות, היה קשה לדעת את המבנה המדויק של כלי דם, צינוריות פרוקסימליות, צינורות איסוף, גלומרולי ועצבים סימפתטיים בכליה בשל היעדר מידע תלת מימדי (3D). סליקה אופטית היא אסטרטגיה טובה להתגבר על המשוכה הגדולה הזו. ניתן לנתח תאים מרובים באיבר שלם ברזולוציה של תא בודד על ידי שילוב של ניקוי רקמות וטכניקת הדמיה תלת-ממדית. עם זאת, שיטות תיוג תאים להדמיית איברים שלמים עדיין אינן מפותחות. בפרט, צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. הפרוטוקול הנוכחי פיתח כתמי כליה של עכברים שלמים להדמיה תלת-ממדית בשיטת ניקוי הרקמות CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף ואנליזה חישובית). הפרוטוקול איפשר לדמיין ניתוק עצבים סימפתטי כלייתי לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה וגלומרולאומגהליה בשלב מוקדם של מחלת כליות סוכרתית מנקודת מבט מקיפה. לפיכך, טכניקה זו יכולה להוביל לתגליות חדשות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית.

באמצעות שיטת הכתמים הזו,הודגמו עצבים סימפתטיים [נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)] ועורקים [נוגדן אקטין נגד α שריר חלק (αSMA)] בכליה שלמה (איור 4A,B ווידאו 1). עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו גם לאחר פגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (IRI)9,10 (איור 4C). יתר על כן, הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול13 הושגה באמצעות פרוטוקול ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.

כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של מבנים תלת-ממדיים בכליה מלאה, מה שיכול להוביל לתגליות חדשניות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית. צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. פרוטוקול זה הדגים את הכתמים האיכותיים והשלמים של הכליות על ידי הנוגדנים.כדי להתחיל, בצע את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלוף ודגימת הכליות, על ידי טבילת הכליה ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. יש לתת שלוש כביסות באמצעות PBS למשך שעתיים כל אחת. בצע את תהליך הדה-צביעה וההעדכה על-ידי טבילת הכליה הקבועה בשבעה מילימטרים של 50% CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.לאחר שש שעות, לטבול את הכליה בשבעה מיליליטר של CUBIC-L בצינור 14 מילימטר עגול תחתון, עם רעידות עדינות ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים. רעננו את CUBIC-L מדי יום. לאחר השלמת הצביעה וההשחתה, השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה ושטפו את הכליה שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.Immunostain הכליה הפגועה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חיץ מכתים, עם ניעור עדין בשייקר אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. לאחר מכן, לשטוף את הכליה עם 0.5% Triton X-100 ב PBS, הידוע גם בשם PBST, בטמפרטורת החדר ליום אחד. לכתמי נוגדנים משניים יש לטפל בכליה עם נוגדנים משניים במאגר המכתים, בחושך, עם ניעור עדין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.לתקן את הכתמים עם שטיפת PBST בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר הקיבוע, יש לטבול את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB למשך שלוש שעות, ולשטוף אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שש שעות. בצע את התאמת מקדם השבירה על ידי טבילת הכליה בשבעה מיליליטר של 50% CUBIC-R+בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר עם טלטול למשך יום אחד, ולאחר מכן טיפול בשבעה מיליליטר של CUBIC-R+עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך יומיים.בעזרת שיטת מכתים חיסונית, עצבים סימפתטיים ועורקים בכליה שלמה הודגמו בהדמיית כליות תלת ממדית. יתר על כן, עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה. פרוטוקול זה גם הקל על הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול.תהליך כימות הנתונים עבור צביעה אימונופלואורסצנטית תלת מימדית מוצג כאן. בנוסף, איסוף צינורות, קטע S1 של צינוריות פרוקסימליות, ואת glomeruli היו דמיינו בהצלחה בכליה שלמה. גלומרולאומגהליה מדוכאת, הנובעת ממתן תרופות בשלבים המוקדמים של מחלת כליות סוכרתית, הודגמה גם בהדמיה תלת-ממדית.פרוטוקול זה יכול לסמן את המולקולה הספציפית בתוך כליה שלמה. לפיכך, חוקרים יכולים לנתח שינוי מבנה בכלי הדם או למצוא אירועים נדירים ברקמות הכליה.

whole-kidney-three-dimensional-staining-with-cubic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים בדיקה לצביעה מלאה של כליות מורין באמצעות שיטת ניקוי רקמות הנקראת CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה של הדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי) וצביעה אימונופלואורסצנטית. הכליה עוברת ניקוי רקמות, שבו הכליה עוברת דה-ליפידים, דה-צבע, ומטופלת בתמיסת התאמת אינדקס שבירה כדי להפוך את הרקמה לשקופה לצורך הדמיה תלת ממדית אופטימלית. הרקמה מוכתמת בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית כדי לחשוף עצבים ועורקים סימפתטיים ברקמה תחת מיקרוסקופ בהיר.

טכניקת צביעת איברים שלמים להדמייה תלת מימדית של הכליה

רקמות מהונדסים בונה כליות לספק פתרון מצוקת איברים, השפעות מזיקות של דיאליזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מיקרו לנתח הכליות מאתר עבור בידוד של מקטעי מדולרי-cortico. מקטעים אלה מושתלים לתוך המבנים לגרדום ללא הסלולר, ויוצרים organoids כליות.

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

פרוטוקול להדמיה תלת-ממדית של מבני רקמה מיקרוסקופיים באמצעות שיטה מכתימת רנטגן ספציפית המיועדת לטומוגרפיה ממוחשבת של X-ray מוצגת.

3D הדמיה של דוגמאות רקמה רכה באמצעות רנטגן ספציפי שיטה מכתים וטומוגרפיה ממוחשבת Nanoscopic

עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.

אופטימיזציה של כליות אורגאיד ותרבות אורגנותית לvascularization, פיתוח מורחב והדמיה מיקרוסקופית משופרת

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע הדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים, ובכך מאפשרים הדמיה של המורפולוגיה, הרכב סוג התא והאינטראקציות ביניהם.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

שיטה זו מדגימה זרימת עבודה של הדפסה תלת-ממדית מבוססת voxel, המודפסת ישירות מתמונות רפואיות עם נאמנות מרחבית מדויקת ורזולוציה מרחבית/ניגודית. זה מאפשר שליטה מדויקת, מדורגת של הפצות חומר באמצעות חומרים מורכבים מורפולוגית, מדורגים בקורלציה רדיוטנציה ללא אובדן או שינוי של נתונים.

אנטומיה של הדפסת Voxel: עיצוב וייצור של מודלים מציאותיים של תכנון פרה-כירורגי באמצעות הדפסת מפת סיביות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.

שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים המפרטים הוראות ליישום תרביות תאים תלת-ממדיות באמצעות מטריצות קולגן וקולגן-אגרוז במערכת מיקרופיזיולוגית. פרוטוקולים אלה תומכים בתרבית משותפת של צינורית הכליה הפרוקסימלית וקרצינומה של תאי הכליה, המדמים תנאי in vivo ומאפשרים חקירה מתקדמת של אינטראקציות בין תאי סרטן הכליה.

תרבית משותפת מיקרופלואידית של אפיתל כליות בריא וגידול למודל התקדמות סרטן הכליה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאימונופלואורסצנציה מרובה המותאם לאפיון הארכיטקטורה התלת מימדית של גרורות צפק.

הדמיה תלת מימדית של רקמה נושאת גידול באמצעות הלבנה איטרטיבית מרחיבה את גישת המולטיפלקסיות

למדו צביעת אימונופלואורסצניה בתלת מימד בכליות שלמות באמצעות פרוטוקול CUBIC. שיטה זו מאפשרת חדירת נוגדנים משופרת והדמיה ברורה של מבני הכליה לחקירת פתולוגיות כלייתיות.

כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

גלה סרטונים נוספים