כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC
18 ביולי 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת ניקוי רקמות והכתמה אימונופלואורסצנטית שלמה להדמיית כליות תלת-ממדית (3D). טכניקה זו יכולה להציע פרספקטיבות מקרוסקופיות בפתולוגיה של הכליות, מה שמוביל לתגליות ביולוגיות חדשות.
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של מבנים תלת-ממדיים בכליה מלאה, מה שיכול להוביל לתגליות חדשניות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית. צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. פרוטוקול זה הדגים את הכתמים האיכותיים והשלמים של הכליות על ידי הנוגדנים.
כדי להתחיל, בצע את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלוף ודגימת הכליות, על ידי טבילת הכליה ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. יש לתת שלוש כביסות באמצעות PBS למשך שעתיים כל אחת. בצע את תהליך הדה-צביעה וההעדכה על-ידי טבילת הכליה הקבועה בשבעה מילימטרים של 50% CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.
לאחר שש שעות, לטבול את הכליה בשבעה מיליליטר של CUBIC-L בצינור 14 מילימטר עגול תחתון, עם רעידות עדינות ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים. רעננו את CUBIC-L מדי יום. לאחר השלמת הצביעה וההשחתה, השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה ושטפו את הכליה שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
Immunostain הכליה הפגועה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חיץ מכתים, עם ניעור עדין בשייקר אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. לאחר מכן, לשטוף את הכליה עם 0.5% Triton X-100 ב PBS, הידוע גם בשם PBST, בטמפרטורת החדר ליום אחד. לכתמי נוגדנים משניים יש לטפל בכליה עם נוגדנים משניים במאגר המכתים, בחושך, עם ניעור עדין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.
לתקן את הכתמים עם שטיפת PBST בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר הקיבוע, יש לטבול את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB למשך שלוש שעות, ולשטוף אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שש שעות. בצע את התאמת מקדם השבירה על ידי טבילת הכליה בשבעה מיליליטר של 50% CUBIC-R+בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר עם טלטול למשך יום אחד, ולאחר מכן טיפול בשבעה מיליליטר של CUBIC-R+עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך יומיים.
בעזרת שיטת מכתים חיסונית, עצבים סימפתטיים ועורקים בכליה שלמה הודגמו בהדמיית כליות תלת ממדית. יתר על כן, עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה. פרוטוקול זה גם הקל על הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול.
תהליך כימות הנתונים עבור צביעה אימונופלואורסצנטית תלת מימדית מוצג כאן. בנוסף, איסוף צינורות, קטע S1 של צינוריות פרוקסימליות, ואת glomeruli היו דמיינו בהצלחה בכליה שלמה. גלומרולאומגהליה מדוכאת, הנובעת ממתן תרופות בשלבים המוקדמים של מחלת כליות סוכרתית, הודגמה גם בהדמיה תלת-ממדית.
פרוטוקול זה יכול לסמן את המולקולה הספציפית בתוך כליה שלמה. לפיכך, חוקרים יכולים לנתח שינוי מבנה בכלי הדם או למצוא אירועים נדירים ברקמות הכליה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של מבנים תלת-ממדיים בכליה שלמה, ובכך מספק נקודת מבט מאקרוסקופית שעשויה להוביל לתגליות חדשניות במחקר הכליות. השיטה כוללת הבהרה של רקמות (tissue clearing) וצביעה אימונופלואורסצנטית של דגימות שלמות (whole-mount) לשיפור איכות הדימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- פתולוגיה
רקע
- צביעה של איברים שלמים (Whole-mount) היא מאתגרת בשל קשיי חדירה של נוגדנים.
- צביעה באיכות גבוהה היא קריטית להדמיה תלת-ממדית מדויקת.
- פרוטוקול זה נותן מענה לבעיות נפוצות בהדמיה של כליות.
- נקודות מבט מאקרוסקופיות עשויות להוביל לתובנות ביולוגיות חדשות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לדימות תלת-ממדי של הכליה.
- שיפור הוויזואליזציה של מבני הכליה.
- סיוע בתגליות חדשניות בפתולוגיה של הכליה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע בטבילה ב-4% paraformaldehyde ב-4°C למשך 16 שעות.
- שטיפה עם PBS במשך שעתיים בכל פעם, שלוש פעמים.
- הסרת צבע (Decolorization) והסרת שומנים (delipidation) באמצעות 50% CUBIC-L.
- ניעור עדין בטמפרטורת החדר במהלך תהליך הסרת השומנים.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של צביעה באיכות גבוהה של כליות בשיטת whole-mount.
- השגת חדירה משופרת של נוגדנים.
- אספקת ויזואליזציה תלת-ממדית ברורה של מבני הכליות.
- מתן נקודות מבט מאקרוסקופיות להבנה טובה יותר של פתולוגיית הכליות.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר בהצלחה את טכניקות הדימות של הכליות.
- הוא פותח נתיבים לגילויים חדשים במחקר הכליות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו להשגת תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
צביעה תלת-ממדית של הכליה כולה באמצעות CUBIC מאפשרת ויזואליזציה מקיפה של מיקרו-מבנים כלייתיים, ובכך מתגברת על המגבלות של הפתולוגיה הקונבנציונלית. יכולת זו תומכת במיפוי ברזולוציה גבוהה של כלי דם, פרוטובולים, גלומרולוסים ועצבים סימפתטיים, ומספקת תובנות קריטיות לגילוי מוקדם ולהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר של מחלות כליות. השיטה משפרת את הביטחון החזוי בנקודות תפנית מרכזיות בקידום פורטפוליו פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של המבנה הכליתי ושל רשתות תאיות ברזולוציה של תא בודד.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי ויזואליזציה של שינויים מבניים לאחר פגיעה או התערבות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מיפוי מקיף של עצבים סימפתטיים וגלומרולים.
- משפר את הביטחון החזוי לצורך תיעדוף מטרות למחלות כליה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות ביולוגיות תלת-ממדיות (3D) עוברי-תיקוף עבור תהליכי דימיון וכמותיות המשך.
- מסטנדרט את צביעת איברים שלמים לקבלת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור בין מחקרים.
- מאפשר דימיון בר-הרחבה של אירועים נדירים ושינויים מבניים ברקמת הכליה.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על המיקרו-אנטומיה של הכליה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם פלטי תמונות בתלת-ממד עם סממנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה, כגון glomerulomegaly.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ויזואליזציה של השפעות ההתערבות.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכונים המבוססת על ניתוח רקמות מקיף.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה עבור תוכניות מחקר כלייתיות תרגומיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול צביעה תלת-ממדית של כליה שלמה זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומך בבדיקת היפותזות, תיקוף מטרות והתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים במחקר כליות.
- ביולוגיה מגלית: מסייעת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מיפוי מבנים כלייתיים ותגובות לפגיעה.
- סריקה: מספקת פלטי דימוי בתלת-ממד הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, לצורך השוואה כמותית של תנאי ניסוי.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה וכימות של שינויים מבניים, התומכים בניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאי דימוי למודלים של מחלות ולזיהוי מוקדם של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור דימוי של איבר שלם במחקרי רקמות כלייתיים ורקמות קשורות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות בכליות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור של דימות בתלת-מימד.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לניתוח רקמה מקיף.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעוד מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות למחלות כליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשקיפות רקמות (tissue clearing), בצביעה אימונוהיסטוכימית ובניתוח דימות תלת-ממדי.
- דורש גישה למכשור דימות מתקדם ולכלי ניתוח חישוביים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות איברים שונות או לפאנלים של נוגדנים.
- חדירות הנוגדנים ומשך הצביעה מהווים מגבלות מעשיות לדימות של איבר שלם.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
