לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

פרוטוקול זה מזהה במדויק תכונות קיפול כרומוזומים על פני סקאלות אורך מרובות עם אות רקע נמוך. לדוגמה, ניתן לנתח אינטראקציות משפרות מקדם בהקשר של תאי כרומוזומים. השימוש באנדונוקלזות הגבלה עוקף אופטימיזציה של רמת העיכול של חומר הקלט.

אין צורך בבחירה על ידי בידוד ג'ל כדי ללכוד מוצרי קשירה. הבעיה הנפוצה ביותר היא אובדן תאים לאחר קיבוע DSG ולכידת מספיק דנ"א כדי לייצר ספריות באיכות גבוהה. כדי להתחיל, שאפו את המדיום עם פיפטה פסטר המוצמד למלכודת ואקום מצלחת 150 המילימטר המכילה 5 על 10 לתאים השישיים.

לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS. כדי להצליב את התאים, לשפוך 23.125 מיליליטר של תמיסת 1% פורמלדהיד לתוך צלחת 15 ס"מ. דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מנדנדים בעדינות את הצלחת ביד כל שתי דקות.

לאחר מכן, מוסיפים 1.25 מיליליטר של גליצין טוחן 2.5 ומערבבים בעדינות את הצלחת כדי להרוות את תגובת ההצלבה, לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. המשיכו את הדגירה על הקרח במשך 15 דקות כדי להפסיק את הקישור הצולב. מגרדים את התאים מהצלחת עם מגרד תאים או שוטר גומי ומעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם פיפטה.

צנטריפוגה המתלה ב 1, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך את supernatant על ידי שאיפה. שטפו את הכדור פעם אחת עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח עם פוספט של דולבקו, או DPBS. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב לפני שתמשיך לקישור צולב DSG.

להצלבה עם DSG, יש להשעות את התאים הכדוריים ב-9.9 מיליליטר של DPBS. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של 300-millimolar DSG. מערבבים את הצינור על ידי היפוך ומקשרים את התאים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות על סיבוב.

לאחר קישור צולב, מוסיפים 1.925 מיליליטר של 2.5-טוחנות גליצין, הופכים לתערובת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב 2, 000 פעמים G במשך 15 דקות ולהשהות את הכדור במיליליטר אחד של 0.05% סרום בקר אלבומין DPBS לפני העברתו לצינור 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב 2, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.

הקפיא את הכדור בחנקן נוזלי לפני שתמשיך ללכידת אישור הכרומוזום. יש להשעות את אליקוט התאים הצולבים במיליליטר אחד של חיץ ליזיס קר כקרח המכיל 10 מיקרוליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאז ולהעביר להומוגנייזר של Dounce למשך 15 דקות של דגירה על קרח. הזיזו באיטיות את הדברה A למעלה ולמטה 30 פעמים כדי ליצור הומוגניזציה של התאים ולדגור במשך דקה אחת כדי לאפשר לתאים להתקרר לפני 30 משיכות נוספות.

לאחר השבץ האחרון, להעביר את ליזאט לצינור 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה המתלה lysed ב 2, 500 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נאטנט ותנופפו או מערבולת כדי להשהות את הכדור הרטוב.

הסר כמה שיותר מהסופרנטנט כדי להשיג חומר דמוי יוגורט עם מינימום גושים. יש להשעות את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של חיץ הגבלה קר כקרח לפני הצנטריפוגה. לאחר השטיפה השנייה, יש להשעות את הכדור ב-360 מיקרוליטרים של חיץ הגבלה על ידי פיפטינג לאחר הוספת כ-340 מיקרוליטר לנפח הנשיאה של הכדור, בהתאם לגודל התא.

מניחים בצד 18 מיקרוליטרים של ליזאט לבדיקת שלמות הכרומטין, או CI.To את הליזאט הנותר, מוסיפים 38 מיקרוליטרים של 1% נתרן דודציל סולפט לצינור Hi-C כדי ליצור נפח כולל של 380 מיקרוליטר ומערבבים בזהירות על ידי פיפטינג מבלי להכניס בועות. דגירה של הדגימות ב-65 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 10 דקות כדי לפתוח את הכרומטין. לאחר מכן, מיד להניח את הצינור על קרח.

לאחר הכנת תערובת העיכול עם Triton X-100, להוסיף 107 microliters של תערובת זו לצינור hi-C כדי ליצור נפח כולל של 487 microliters ולעכל את הכרומטין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב thermomixer עם רעידות מרווח. למחרת, העבירו את הדגימות ל-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את פעילות האנדונוקלאז שנותרה. לאחר הנחת הדגימה על קרח, להפריש 10 microliters של בקרת העיכול, או DC, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את העיבוי מהמכסה עם פיפטה או על ידי סיבוב. לאחר מכן, הוסיפו 58 מיקרוליטרים של תערובת מילוי ביוטין כדי ליצור נפח כולל של 535 מיקרוליטרים. פיפטה בעדינות מבלי ליצור בועות לפני הדגירה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בתרמומיקסר.

לאחר הדגירה, להוסיף 665 microliters של תערובת קשירה, מה שהופך את נפח המדגם 1, 200 microliters. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג ודוגרים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בתרמומיקסר. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פרוטאינאז-K בשני שברים לצינור הדגימה Hi-C ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עם רעידות מרווח.

לטיהור DNA, להוסיף 100% אתנול קר כקרח צנטריפוגה את הצינורות ב 18, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר את הסופרנאט לחלוטין מהצד שאינו כדורי ולייבש את הדגימה באוויר למשך 10 דקות או עד שהכדורים יבשים באופן נראה לעין. לאחר שהכדורים יבשים, יש לבודד אותם ב-450 מיקרוליטרים של Tris low-EDTA על ידי פיפטינג או מערבולת.

העבר את המתלה המסולסל ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 0.5 מילימטר, או CFU, עם ניתוק משקל מולקולרי של שלושה קילודלטון. צנטריפוגה של CFU במהירות מקסימלית למשך 10 דקות והשלכת הזרימה דרך. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 80 מיקרוליטרים של Tris low-EDTA לעמודה.

הפוך את העמוד לצינור איסוף חדש לשתי דקות של צנטריפוגה במהירות המרבית. לבסוף, טען את הדגימות על ג'ל אגרוז של 0.8%. ג'ל אגרוז עם תוצאות טיטרציה של PCR הראה שרוב הספריות דורשות חמישה עד שמונה מחזורים של הגברה סופית של PCR.

עיכול התאים של ספריית ה- PCR המוגברת הסופית, כפי שנצפה על ידי שברים קטנים יותר על ג'ל אגרוז, מאשר את נוכחותם של צמתי קשירה מתאימים ומשמש כבדיקת איכות לפני הרצף. לאחר הרצף, הנתונים הממופים הראו כי השילוב של DpnII ו- DdeI מגדיל באופן משמעותי את המגעים לטווח קצר, כמו הוספת DSG לקישור הצולב הקונבנציונלי של פורמלדהיד. ניתן היה לצפות באות משופר גם במרחקים ארוכים וקצרים ישירות ממטריצות אינטראקציה דו-ממדיות.

אותות התא הם קריספר במרחקים ארוכים ונקודות הנוצרות על ידי לולאות כרומטין בולטות יותר במרחקים קצרים. בנוסף לפורמלדהיד, קישור צולב עם DSG מקטין קשירת אקראיות, ומשפר את הכיסוי היחסי בציס. חשוב לא לאבד תאים במהלך ואחרי crosslinking.

כדורי התא יכולים להיות רופפים או בלתי נראים, ותאים יכולים להידבק לקצות פיפטה בחלק מהמאגרים.