Name: במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למדו את שיטת מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט לחקר אנטרוקוליטיס נמקית במבחנה. שיטה זו מאפשרת גישה לפני השטח האפיקלי ובדיקת תרופות פומיות ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). אנו מודים למעבדה לביולוגיה מולקולרית ומחקר ציטומטריה ב- OUHSC על השימוש במתקן הליבה, שסיפק הדמיה קונפוקלית.

כל נהלי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה. דגימות נוחות המעי הדק מפרימט לא אנושי פג (NHP, 90% הריון, בבון זיתים, Papio anubis) התקבלו לאחר המתת חסד למחקר נפרד (פרוטוקול #101523-16-039-I).
1. הקמת מודל NEC-in-a-dish אנטרואידי apical-out
<ol><li>הכנת טיפולי מדיה ואנטרואיד הערה: לאחר ההכנה בהתאם לטכניקה אספטית סטנדרטית, ניתן לאחסן את המדיה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.<ol><li>הכן מדיה נטולת אנטיביוטיקה (AFM) על-ידי ערבוב של 50 מ"ל של מדיית גידול אורגנואידית אנושית עם 50 מ"ל של תוסף אורגנואידי (ראו טבלת חומרים). יש להכין 5 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראצית/1x מלח עם אגירת פוספט (EDTA/PBS) על-ידי הוספת 100 מיקרו-ליטר של 0.5 M EDTA ל-9,900 מיקרו-ליטר של PBS.</li>
		<li>תערובת הנשר הבינונית/מזינה של צ'יל דולבקו F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) ב-2-8 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הכן את פתרון המלאי של TNF-α על-ידי השעיית 100 מיקרוגרם של אבקת TNF-α ב-1 מ"ל של PBS אחד. דילול נוסף של מלאי TNF-α לריכוזים של 20 ננוגרם/מ"ל ו-50 ננוגרם/מ"ל באמצעות AFM כממס. הכן פתרון מלאי LPS על ידי השעיית 2 מ"ג של LPS ב 1 מ"ל של 1x PBS. דילול נוסף של מלאי LPS ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ו-200 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות AFM כממס.</li>
	</ol></li>
	<li>היפוך הקוטביות של אנטרוידים תלת-ממדיים הערה: ההליך הבא מיועד להיפוך של צלחת תרבית רקמה אחת בעלת תחתית שטוחה של 24 בארות לשני לוחות תרבית רקמה בעלי חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות. יש לחמם את צלחות תרבית הרקמה ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש. הנגזרת של אנטרואידים תלת-ממדיים בזולטרליים הושגה כפי שתואר קודם לכן על ידי קבוצות רבות35,36, עם שינויים קלים עבור מדיה (מפורט לעיל). הליך הנגזרת האנטרואידית הכללית אינו שונה מזה של בני אדם. בקצרה, רקמה נכרתת נשטפת, נחתכת לשברים קטנים, ודוגרת במאגר הפרעה לתאים. לאחר מכן, תמיסת התא עוברת דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר, והתוצאה היא קריפטות המצופות בצפיפות גבוהה.<ol><li>שאפו מדיה מכל באר של צלחת בת 24 בארות של אנטרוידים תלת-ממדיים מבוססים.</li>
		<li>הוסף 500 μL של 5 mM EDTA / PBS קר כקרח לכל באר של צלחת 24 באר ושיבש בעדינות מכנית את תמצית קרום המרתף / כיפת ECM על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה p200 מינימום של 5x-6x.</li>
		<li>העבירו את תכולתן של ארבע בארות לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסיפו 8 מ"ל של EDTA/PBS קרים כקרח לצינור החרוטי. להעביר את 20 הבארות הנותרות באותו אופן.</li>
		<li>דגירה של צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת על פלטפורמה מסתובבת או שייקר ב-330 סל"ד. לאחר הדגירה של שעה אחת, צנטריפוגה של צינורות חרוטיים ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להסיר ולהשליך את הסופר-נטנט מכל צינור.</li>
		<li>שלב ושטוף את כדורי התא עם 5 מ"ל של DMEM/F12 והפץ את תרחיף התא לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.</li>
		<li>גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופר-נאטנט והוסף 12 מ"ל של AFM לכל צינור, כדי להבטיח שכדורי התא יוחזרו לחיים.</li>
		<li>פיפטה 500 μL של ההשעיה האנטרואידית לתוך כל באר של שני לוחות חיבור נמוכים במיוחד 24 באר.</li>
		<li>לדגום את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 במשך2-5 ימים או עד אנטרוידים יש קוטביות הפוכה.</li>
		<li>כדי לבדוק היפוך אנטרואידי, קבעו תחילה את הכתם האימונופלואורסצנטי המאשר ואת הזמן הממוצע להיפוך (~3 ימים), ולאחר מכן אשרו את היפוך הקוטביות באמצעות הדמיה בסיסית של מיקרוסקופ אור. אנטרוידים אפיקליים-חיצוניים הם בעלי מראה תאי מאוד, בעוד שאנטרוידים בזולטרליים-חיצוניים נשלטים לעתים קרובות על-ידי נוכחות של לומן מרכזי גדול או ניצנים (ראו איור משלים 1). הערה: לאחר שההליך עבר סטנדרטיזציה, יחס ההמרה ל- apical-out עולה בדרך כלל על 95%. השימוש באנטרוואידים אפיקליים-חיצוניים נועד לשמש כניסוי סופני, אם כי באופן תיאורטי ניתן להעביר אנטרואידים אפיקליים-החוצה למספר קטן של אנטרואידים בזולטרליים-החוצה.</li>
	</ol></li>
	<li>NEC-in-a-dish אפיקלי-אאוט הערה: לאחר שהאנטרוידים הפכו את הקוטביות, השתמש בתרביות בניסויים הבאים במהירות, מכיוון שאורך החיים שלהם בקונפורמציה אפיקלית לא אושר מעבר ל-3-4 ימים. עבור המודל הבא של NEC-in-a-dish, האנטרוידים טופלו במשך 24 שעות, ולאחר מכן נאספו מיד לאחר מכן ונשמרו לניסויים במורד הזרם.<ol><li>לאחר שהאנטרוידים הפכו חזותית את הקוטביות עם יעילות של 95% לפחות, הסר את הצלחות מהאינקובטור ואסוף שמונה בארות של צלחת 24 בארות לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. מכיוון שהאנטרואידים האפיקליים נמצאים בהשעיה, פשוט הדביקו את התמיסה האנטרואידית/מדיה. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחר שהתאים מופנים, הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את גלולת התא ב-4 מ"ל של AFM מעורבב עם הנפח הרצוי (10 μL כאן כדי להתאים לנפח הטיפול הגבוה ביותר שנוסף) של 1x PBS (בקרה).</li>
		<li>פיפטה 500 μL של מתלה enteroid / PBS / AFM לתוך שמונה בארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 24 באר ודגירה של הצלחת ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 24 שעות.</li>
		<li>חזור על שלבים 1.3.1.-1.3.3. לטיפולי TNF-α (20 ננוגרם/מ"ל ו-50 ננוגרם/מ"ל) ו-LPS (100 מיקרוגרם/מ"ל ו-200 מיקרוגרם/מ"ל) בנורמוקסיה. עבור כל טיפולי ההיפוקסיה, חזור על שלבים 1.3.1.-1.3.3., אך הנח את הצלחת באינקובטור נפרד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו- 1% O2 למשך 24 שעות. הערה: שלב 1.3.4. ניתן לעשות זאת בו זמנית עם שלבים 1.3.1.-1.3.3, אבל, למען הבהירות, ההליך לעיל הופרד על ידי טיפול על מנת להפחית את המורכבות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. צביעה אימונופלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>הכנת תמיסות צביעה<ol><li>הכן 0.1% טריטון X-100 על ידי ערבוב 7 μL של טריטון X-100 ב 1x PBS לנפח סופי של 7 מ"ל. הכן PBST (PBS-Tween) על-ידי הוספת 30 μL של Tween-20 ל- 1x PBS לנפח סופי של 30 מ"ל.</li>
		<li>הכינו 10% סרום חמור רגיל (NDS)/PBST על ידי הוספת 700 μL של NDS ל-6.3 מ"ל של PBST. הכן 1% NDS/PBST על-ידי הוספת 70 μL של NDS ל-PBST לנפח סופי של 7 מ"ל. הערה: סרום חמורים שימש כאן כדי לתאם עם הנוגדן המשני המארח. עם זאת, מיני הסרום החוסם צריכים להתאים למיני הנוגדנים המשניים על מנת לחסום כראוי קשירה לא ספציפית.</li>
	</ol></li>
	<li>מכתים (יום 1)<ol><li>העבר את התוכן של ארבע בארות של צלחת 24 באר לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. יש לחזור על הפעולה לכל הבארות/טיפולים הרצויים, כאשר כל טיפול נמצא בצינור נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר שהאנטרואידים הם כדוריות, להסיר את supernatant.</li>
		<li>השהה את כדורי התא ב-300 μL של 4% פורמלדהיד מקובע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדור עם 500 μL של סטרילי, RT 1x PBS.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסירו את הסופר-נטנט והוסיפו 500 מיקרון של 0.1% טריטון X-100, והניחו למשך שעה אחת ב-RT.</li>
		<li>לאחר שעה אחת, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. יש לשטוף עם 500 μL של 1x PBS ולהניח את הצינורות על מסובב או שייקר ב 200 סל"ד במשך 15 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס. חזור על זה בסך הכל 4x.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. יש להוסיף 500 μL של 10% NDS/PBST ולדגור ב-RT למשך 45 דקות. במהלך הדגירה, הכינו פתרונות נוגדנים ראשוניים על ידי שילוב של 20 μL של נוגדן רקומביננטי נגד ווילין, 10 μL של נוגדן E-cadherin, ו-1970 μL של 1% NDS/PBST עבור שמונה בארות של צלחת 24 בארות.</li>
		<li>לאחר הדגירה של 45 דקות, צנטריפוגה של הצינורות ב 300 x g במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות על קרח. הסר את supernatant והחלף עם 250 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית. לדגור את הצינורות בלילה ב 2-8 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>מכתים (יום 2)<ol><li>צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. מוסיפים 250-500 μL של PBST לכל צינור, בהתאם לגודל הכדור, ומניחים על המסובב או השייקר ב 200 סל"ד למשך שעה אחת ב 2-8 מעלות צלזיוס. חזור על שטיפת PBST 4x.</li>
		<li>הכן תמיסת נוגדנים משנית על ידי הוספת 52 μL של חמור Cy3 נגד ארנב IgG (H + L) ל 50% גליצרול ו 5.2 μL של חמור נגד עכבר נוגדנים פלואורסצנטיים ירוקים 488 נוגדנים משניים ל 5142.8 μL של 1% NDS / PBST.</li>
		<li>לאחר שטיפת ה-PBST והצנטריפוגה האחרונה, הסר את הסופרנטנט מהצינורות. יש לחלק 200 μL של תמיסת נוגדנים משנית לכל צינור ולדגור בחושך למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבה של אנטרואידים אפיקליים מוכתמים (יום 1)<ol><li>יש להביא ל-RT חומר מבוסס גליצרול המכיל צבע גרעיני כחול למשך שעה אחת.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר 100 μL של supernatant ו resudate את התאים ב~ 100 μL הנותרים של supernatant. העבר את השעיית התא לצינורות 0.5 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים. הסר את הסופרנטנט והושיע מחדש את כדורי התא ב-100 μL של כתם חומצת גרעין אדומה רחוקה. דגירה של הצינורות ב- RT למשך 10 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים. הסר את הסופרנטנט ושלח מחדש את כדורי התא ב-100 μL של 1x PBS. יש לחזור על הפעולה לשטיפה שנייה.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך 20 שניות כדי לזרוק את התאים ולהסיר 70 μL של supernatant. יש להשעות את התאים בנפח הנותר של PBS ולהעביר את התוכן לכיסוי מסומן (24 מ"מ x 60 מ"מ).</li>
		<li>יש למרוח 75 μL של mountant ישירות על הדגימה ולהסיר את כל הבועות עם קצה פיפטה. אפשרו לכיסויים להירפא למשך הלילה (18-24 שעות) ב-RT בחושך.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבת אנטרואידים אפיקליים מוכתמים (יום 2)<ol><li>לאחר הריפוי למשך הלילה, יש למרוח שכבה דקה (~15 μL) של גליצרול על הכיסויים. הרכיבו את הכיסוי על מגלשת הזכוכית ולחצו בעדינות למקומו. הקש כדי להסיר בועות בין הכיסוי לשקופית.</li>
		<li>אפשרו לכיסוי להתקבע ב-RT בחושך למשך שעתיים לפחות, לפני ההדמיה בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. להדמיה מיקרוסקופית של אנטרוידים באמצעות שיטות רכישה קונפוקליות שונות, עיין Lallemant et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות אימונופלואורסצנטי הערה: שיטה זו קובעת את סך הפלואורסצנטיות המתוקנת על-ידי הסרת אות הרקע באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>פתחו את התמונות הקונפוקליות ב- ImageJ וקוו את האזור הרצוי בעזרת הכלי אזור עניין (ROI).</li>
		<li>הגדר פרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש על-ידי ניווט אל נתח > הגדר מדידות. בחר אזור > צפיפות משולבת > ערך אפור ממוצע תחת הכרטיסיה הגדרות.</li>
		<li>נווט כדי לנתח > למדוד. יופיע חלון נפתח הכולל את המידות. העתק והדבק מדידות אלה בגיליון אלקטרוני.</li>
		<li>להפחתת אות הרקע, בחרו אזור קטן שאינו פלואורסצנטי בתמונה. נווט אל נתח > מדידה עבור אזור זה. יופיע חלון נפתח הכולל את המידות. העתק והדבק את הפלט בגיליון אלקטרוני.</li>
		<li>הכפל את שטח התא שנבחר בפלואורסצנטיות הממוצעת של קריאות רקע, והפחת את הסכום מהצפיפות המשולבת כדי לחשב את סך הפלואורסצנטיות של התא המתוקן (CTCF). חזור על השלבים לעיל עבור כל התמונות המעניינות, תוך שמירה על רשומות בגיליון אלקטרוני או בחבילת תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
</ol>3. כדאיות תא NEC-in-a-צלחת Apical-out
<ol><li>טיפולים אנטרואידים<ol><li>צור מודל NEC-in-a-dish במשך 24 שעות, כמו בשלב 1.</li>
		<li>הפשרת ריאגנט בדיקת כדאיות התא למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. ביום הבדיקה, הביאו את המגיב ל-RT 30 דקות לפני השימוש. הפוך את המגיב כדי לערבב.</li>
		<li>לפני ביצוע הבדיקה, הסר 100 μL של מדיה מכל באר, והשאיר את 400 μL הנותרים. הוסף 400 μL של ריאגנט בדיקת כדאיות התא לכל באר.</li>
		<li>ערבבו היטב את התוכן על שייקר צלחת ב-RT למשך 5 דקות ב-200 סל"ד כדי לגרום לתזה של התאים. לאחר הטלטול, דגרו את הצלחת ב-RT למשך 25 דקות נוספות.</li>
		<li>לאחר דגירה של 25 דקות, מערבבים את התוכן של באר אחת באמצעות פיפטינג ומעבירים 200 μL של 800 μL לבאר אחת של 96 בארות, אטום, פוליסטירן, צלחת תחתית ברורה. חזור על 600 μL הנותרים, יצירת ארבעה שכפולים טכניים לכל באר. מעבירים את התכולה הנותרת של כל באר של צלחת 24 בארות לצלחת של 96 בארות באופן זה.</li>
		<li>באמצעות קורא צלחות המסוגל להזיז, רשום ערכים באינטגרציה של 0.25 אלפיות השנייה והשווה את הערכים היחסיים בין הטיפולים. לחלופין, יש להשוות את רמת הלומינסנציה של הטיפול לתקן אדנוזין טריפוספט (ATP).</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף ואין להם ניגודי עניינים.

הפיתוח האחרון של מודלים אנטרואידיים הנגזרים מקריפטות אפיתל מעיים מאפשר רקמה חוץ-גופית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שבה ניתן לחקור פתוגנזה אנטרוקוליטיס נמקית. למרות הכללת כל סוגי התאים הממוינים העיקריים של אפיתל המעי, אנטרואידים תלת-ממדיים עדיין כפופים למספר מגבלות משמעותיות. האנטרוידים הקונבנציונליים, הבזולטרליים החוצה, תלויים בכיפות הידרוג'ל ECM תלת-ממדיות, שהרכבן וצפיפותן עשויות להגביל דיפוזיה נורמלית בסביבת תרבית הרקמה39. חשוב לציין כי אנטרוידים אלה מספקים גישה מוגבלת לפני השטח האפי...

דלקת המעי הגס (NEC), מחלה דלקתית חמורה של המעי הדק המתרחשת בעד 10% מהפגים, קשורה בדרך כלל לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2. שיעורי תמותה המתקרבים ל-50% בתינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (<1500 גרם), הדורשים התערבות כירורגית, אינם נדירים3. בעוד שהאטיולוגיה המדויקת של NEC אינה מובנת כיום, גורמי סיכון, כגון הזנת פורמולה, נחשבים למורכבים עם אנומליות פיזיולוגיות, כגון דיסביוזיס, אפיתל מעיים לא בשל, ומחסום מעיים לא מתפקד, בהתפתחות המחלה 2,4. למרות מאמץ משמעותי, התקדמות מועטה במניעה או בטיפול ב- NEC התרחשה בעשורהאחרון 5. שיטה חדשנית במבחנה לחקר NEC ותפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים נדרשת כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה של המחלה, כפי שממצאים ממודלים של בעלי חיים תרגמו עד כה בצורה גרועה למיטה6.
מספר מודלים של מבחנה שימשו כדי לחקור את המנגנונים הפועלים במהלך NEC. קו תאי האפיתל במעיים האנושיים, Caco-2, הוא בין המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במבחנה של NEC 7,8. תאי Caco-2 מחקים תכונות מורפולוגיות של גבול המברשת של המעי הדק, אך כקו תאים, אינם מתמיינים למגוון הרחב של סוגי תאי in vivo, כולל תאי גביע המייצרים ריר, הנדרשים למודל הניתן לתרגום גבוה. HT-29-MTX, תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי, כוללים פנוטיפ מעורב של אנטרוציטים ותאי גביע, אך עדיין חסרים סוגי תאים מבוססי קריפטה של אפיתל המעי9. IEC-6 ו-IEC-18 הם קווי תאים שאינם מותמרים עם מורפולוגיה לא בשלה דמוית קריפטה, אך אינם נגזרים מרקמה אנושית, מה שמגביל את יכולת התרגום שלהם. קווי תאי המעי FHs 74-Int ו-H4 מופקים מרקמת עובר אנושית ואינם יוצרים צמתים הדוקים או מונולרים מקוטבים10,11, ולכן הם לא בשלים בהשוואה אפילו לפגים ביותר הרגישים ל-NEC. בדרך כלל, מודלים של NEC במבחנה משתמשים בטיפולי ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), קולטן מרכזי הגורם לדלקת מעיים ב-NEC12. נזק המתווך באמצעות טיפול במיני חמצן תגובתי (ROS), בדרך כלל באמצעות מי חמצן, משמש לעתים קרובות כדי לגרום לנזק חמצוני דמוי NEC ואפופטוזיס13,14. כגורם העיקרי לדלקת מעיים, גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α), מרכיב במורד הזרם של איתות TLR4 דלקתי, משמש בדרך כלל גם במודלים אלה במבחנה כדי לחקות פתוגנזה in vivo 15.
אורגנואידים, המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs), צברו פופולריות כמודל חוץ גופי של המעי בשל יכולתם לשחזר את ארכיטקטורת ה-in vivo המורכבת ואת הרכב התאים של הרקמה שממנה הם נגזרים16,17. מערכת חוץ גופית קשורה, אנטרואידים, הם אורגנואידים שמקורם בקריפטות מעיים שנכרתו שקל יותר להקים ולתחזק מאשר אורגנואידים שמקורם ב-iPSC. אנטרוידים גדלים בדרך כלל במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (3D) (ECM) עם גישה ניסיונית המוגבלת לפני השטח של התא הבזולטרלי. שיטות כגון מיקרו-הזרקה18,19, פותחו כדי להתגבר על מחסום זה בפני השטח האפיקלי, אך הצטברות של פסולת תאית מרופטת וליחה בתוך הלומן הופכת את המיקרו-הזרקה לקשה מבחינה טכנית ולא עקבית. מכיוון שפלטפורמות מיקרו-הזרקה רובוטיות מותאמות אישית אינן נגישות באופן נרחב20, השתנות מעבדה למעבדה ביכולת הטכנית ובטכניקה הכללית הופכת למשתנים משמעותיים שיש להתגבר עליהם באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה. מונו-שכבות דו-ממדיות (2D) שמקורן באנטרוידים תלת-ממדיים מנותקים, שעדיין כוללים את כל סוגי התאים העיקריים של אפיתל המעי, מאפשרות גישה לפני השטח האפיקליים, אך באופן מסורתי היה קשה לתחזק אותן ללא שכבת הזנה של מיופיברובלסטים מזנכימליים21. בעוד שניתן להשתמש בתמיכות חדירות של תרביות תאים כדי לגשת הן לצד האפיקלי והן לצד הבזולטרלי של מונולרים אנטרואידים ללא שימוש במיופיברובלסטים בסיסיים, תוספות אלה דורשות כריתה והרכבה של הממברנה לפני השימוש בשיטות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, וכתוצאה מכך תהליך תובעני וקשה יותר מבחינה טכנית בעת שימוש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות22. NEC עוצב במבחנה באמצעות אנטרואידים תלת-ממדיים מסורתיים 23,24,25 ותומך חדירב-26,27, ודלקת מעיים שוכפלה לאחרונה עם מודלים של מעיים על שבב 28,29. בעוד שמודלים של בטן על שבב המשלבים מיקרופלואידיקה הם, ללא ספק, המודלים המתקדמים ביותר הניתנים לתרגום, טכנולוגיה זו יקרה, מורכבת ובלתי נגישה לרוב החוקרים30.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות אנטרואידיות אפיקליות אפשרה גישה קלה יותר למשטח האפיקלי של אנטרוידים תלת-ממדיים מבלי להסתכן בפגיעה בשלמות המבנית של האפיתל במבחנה 31,32,33. אנטרוידים Apical-out חולקים את הרכב סוג התא ואת תפקוד המחסום של אפיתל מעיים in vivo, אך בניגוד לאנטרוידים תלת-ממדיים טיפוסיים, המשטחים האפיקליים של תאים אלה פונים למדיום התרבית, מה שמאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית על ספיגת חומרים מזינים, זיהום מיקרוביאלי והפרשה לומינלית31. יתרון נוסף של אנטרואידים אפיקליים הוא היכולת להפיץ באופן הומוגני חומרים ניסיוניים לאנטרואידים. נפחי טיפול משתנים המבוססים על גודל אנטרואיד אינם נדרשים, כפי שהם עם מיקרו הזרקה, והיכולת לשמור על אנטרוידים אלה בתרבית השעיה שוללת כל הפרעה ECM על דיפוזיה של סוכן ניסיוני32.
דלקת אנטרוקוליטיס נמקית היא מחלה רב-גורמית המערבת מספר סוגי תאי אפיתל מעיים ומגוון גורמים סביבתיים ופתופיזיולוגיים34. הרכב התאים המגוון של אנטרואידים במעיים הוא שיפור ברור לעומת מונוקולטורים במידול מחלה מורכבת כגון NEC. באופן מעניין, בעוד שחשיפה דלקתית אחת מספיקה לעתים קרובות כדי לגרום נזק במונוקולטורות חוץ גופיות , נראה כי אנטרואידים, כמו במודלים של עכברים23, דורשים מינימום של שני מרכיבים דלקתיים כדי לגרום לנזק דמוי NEC6. כאן, אנו מציגים מודל NEC-in-a-dish apical-out, המשתמש באנטרוואידים אפיקליים בשילוב עם היפוקסיה (תכונה קלינית חשובה של NEC6) ו- LPS או TNF-α, כמודל משופר ורלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במבחנה כדי לחקור תגובות אפיתל לדלקת דמוית NEC, ואולי גם לזהות מטרות טיפוליות. אנו מתארים פרוטוקול להיפוך הקוטביות של אנטרואידים תלת-ממדיים במעי הדק, כמו גם פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה במחסום האפיתל ושינויים בביטוי חלבונים צומתיים. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר בדיקת כדאיות אנטרואידית פשוטה כדי לקבוע את ההשפעה של מודל ה-NEC-in-a-dish שלנו, בעל שתי הלהיטים והאפיקליות.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ' EDTA, pH 8.0</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים תלת מימדית</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר חיבור נמוך במיוחד 24 בארות מיקרו-פלטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 24 מ"מ x 60 מ"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב חמור, Cy3 מצומד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>תערובת בשר חזיר בינוני/מזין של Dulbecco F-12 (DMEM-F12) עם מאגר HEPES של 15 מ"מ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן E-cadherin (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 4%, חוצץ, pH 6.9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>פיג'י</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (אנושי)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מ-Escherichia coli O111:B4, מטוהר על ידי כרומטוגרפיה של סינון ג'ל</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Careated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט), 1x [-] סידן, מגנזיום, pH 7.4</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>תושבת אנטי-דהייה מזכוכית מאריכה עם NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן רקומביננטי נגד וילין [SP145]</td> <td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>TNF אנושי רקומביננטי אלפא; חלבון 100 ומיקרו; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td><td>מכשירים</td><td></td><td></td>מולקולריים</tr><tr><td>Thermo Forma Series II חממת תלת-גז עם מעטפת מים, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 יודיד (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות, 0.5 מ"ל, מכסה שטוח</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

אנטרוקוליטיס נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית המשפיעה על פגים, המאופיינת בדלקת מעיים ונמק. אנטרואידים התגלו לאחרונה כמערכת מבטיחה למודל פתולוגיות במערכת העיכול. עם זאת, השיטות המשמשות כיום למניפולציה אנטרואידית חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של האפיתל (תלת-ממדי [3D]) או שהן גוזלות זמן ועתירות משאבים (מונולרים דו-ממדיים [2D]). שיטות אלה דורשות לעתים קרובות שלבים נוספים, כגון מיקרו-הזרקה, כדי שהמודל יהפוך לניתן לתרגום פיזיולוגי. כאן אנו מתארים פרוטוקול רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וזול לחקר NEC במבחנה על ידי היפוך קוטביות אנטרואידית, וכתוצאה מכך המשטח האפיקלי פונה כלפי חוץ (apical-out). כמו כן מסופק פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לבחינת שלמות מחסום אנטרואידי וביטוי חלבונים צומתי לאחר חשיפה לגורם נמק גידולי - אלפא (TNF-α) או ליפופוליסכריד (LPS) בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. כמו כן, נבדקת הכדאיות של אנטרוידים אפיקליים תלת-ממדיים החשופים ל-LPS נורמוקסי או היפוקסי או ל-TNF-α במשך 24 שעות. אנטרוידים שנחשפו ל-LPS או ל-TNF-α, בשילוב עם היפוקסיה, הפגינו הפרעה בארכיטקטורת האפיתל, אובדן ביטוי של חלבון צומת הדבקות וירידה בכדאיות התא. פרוטוקול זה מתאר מודל חדש של NEC-in-a-dish המציג פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית וחסכונית לזיהוי מטרות אפיתל פוטנציאליות לטיפולי NEC ולחקר תגובת המעיים המוקדמת לטיפולים.

השימוש באנטרוואידים כדי לדגום דלקת מעיים, אפילו בהקשר של דלקת אנטרוקוליטיס נמקית, נפוץ כיום. עם זאת, רוב השיטות המשמשות כיום חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של אנטרואידים, מה ששולל את הרלוונטיות הפיזיולוגית של תרכובות המיועדות לשימוש בסופו של דבר כטיפולים אוראליים, או שהן קשות מבחינה טכנית וגוזלות זמן, כמו עם מונולרים שמקורם באנטרואידים. כדי להגדיל את התועלת של מודלים אנטרואידיים במבחנה הנוכחיים של NEC, הפכנו את הקוטביות של אנטרואידים, ובשילוב עם היפוקסיה של 24 שעות ו- LPS או TNF-α, יצרנו מודל NEC-in-a-dish apica...

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

פרוטוקול זה מתאר את המודל הראשון של apical-out in-a-dish ומהווה שיפור קריטי לעומת מודלים אנטרואידיים רוחביים בסיסיים בצלחת בעת יצירת מודלים חוץ-גופיים של טיפולים פוטנציאליים המיועדים למתן אוראלי. שיטה זו מאפשרת גישה למשטח האפיקלי של אנטרואידים. ניתן להוסיף תרכובות למדיית התאים והתרכובות נקלטות באופן אפי כפי שהן היו נקלטות.חוקרים המעוניינים להקים מערכת חוץ-גופית של דלקת מעיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים דרך הפה עשויים למצוא טכניקה זו שימושית במיוחד. רקמות שמקורן בגילאים ומינים שונים עשויות לדרוש סטנדרטיזציה נוספת. כך שייתכן שיהיה צורך בחולים תוך קביעת זמני היפוך קוטביות.להיפוך הקוטביות של אנטרוידים תלת-ממדיים שואפים מדיה מכל באר של צלחת באר 24 של אנטרוידים בזולטרליים תלת-ממדיים מבוססים. הוסף 500 מיקרוליטרים של חמישה מילימולרים קרים כקרח, EDTA או PBS לכל באר של צלחת באר 24 ושבש בעדינות מכנית את תמצית קרום המרתף או כיפת המטריצה החוץ-תאית על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים עם פיפטה P 200. מעבירים את תכולת ארבע הבארות לצינור של 15 מיליליטר.לאחר מכן להוסיף שמונה מיליליטר של EDTA קר כקרח לחתוך PBS לצינור. להעביר את 20 הבארות הנותרות באותו אופן. דגירה של הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה על פלטפורמה מסתובבת או שייקר ב-330 סל"ד.לאחר הדגירה צנטריפוגה את הצינורות ולהשליך את supernatant מכל צינור. שלב ושטוף את הכדורים עם חמישה מיליליטר של DMEM F12. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים תלויים ולהסיר את supernatant לפני הוספת 12 מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה לצינור להבטיח כי כדורי התא הם resuspended.Pippet 500 microliters של ההשעיה enteroid לתוך כל באר של 24 לוח חיבור נמוך במיוחד היטב. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד חמישה ימים או עד האנטרוידים יש קוטביות הפוכה. ביום הראשון לנמנע, העבירו את תכולתן של ארבע בארות של צלחת באר 24 לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר.חזרו על הפעולה לכל הבארות הרצויות עם כל טיפול בצינור נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ולתלות את הכדור ב 300 microliters של 4% מ aldehyde fixative בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות לשטוף את הכדורים עם 500 microliters של PBS.הוסף 500 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100 לצינורות. לדגור את הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על סיבוב או שייקר ב 200 סל"ד במשך 15 דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה האחרונה, להוסיף 500 microliters של 10% NDS ב PBS T לדגור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. במהלך הדגירה, להכין פתרון נוגדנים ראשוני. למחרת מוסיפים 250 עד 500 מיקרוליטרים PBS T לצינורות בהתאם לגודל הכדור, ומניחים אותם על המסובב או השייקר ב 200 סל"ד למשך שעה אחת בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית ודוגרים את הצינורות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, המשך להרכבת אנטרואידים אפיקליים מוכתמים על ידי סיבוב הצינורות והסרת 100 מיקרוליטרים של סופרנטנט. יש להשעות את התאים ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של סופר-נאטנט ולהעביר את תרחיף התאים ל-500 צינורות מיקרוליטר.צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני למשך 20 שניות. הסר את supernatant ולתלות מחדש את הכדורים ב 100 microliters של טמפרטורת החדר כתם חומצת גרעין אדומה רחוקה. לאחר 20 דקות של דגירה, צנטריפוגה של התאים לתלות את הכדורים ב 100 microliters של PBS.לאחר השטיפה השנייה צנטריפוגה להסיר 70 microliters של supernatant ו resuse את הכדורים בנפח הנותר של PBS. לאחר מכן העבירו את מתלה התא לכיסוי מסומן בגודל 24 על 60 מילימטר. החל 75 microliters של mountant ישירות על הדגימה ולהסיר את כל בועות עם קצה פיפטה.לאחר ריפוי בן לילה בחושך, יש למרוח שכבה דקה של גליצרול על תלושי הכיסוי, ולאחר מכן להרכיב את מחליק הכיסוי על מגלשת הזכוכית וללחוץ אותה בעדינות למקומה. הקישו כדי להסיר בועות בין תלוש הכיסוי לשקופית. אפשרו לכיסוי להחליק בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעתיים לפני שתדמיינו את האנטרואידים בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.עבור טיפולים אנטרואידיים, להקים אנטרוקוליטיס נמקית אפיקלית במודל צלחת במשך 24 שעות כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני ביצוע הבדיקה, הסר 100 מיקרוליטרים של מדיה מכל באר והשאיר את 400 המיקרוליטרים הנותרים. הוסף 400 מיקרוליטרים של ריאגנט לבדיקת כדאיות התא לכל באר.ערבבו במרץ את התוכן על שייקר צלחת במשך חמש דקות במהירות של 200 סל"ד כדי לגרום לתזה של התאים. לאחר מכן, להעביר 200 microliters לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. חזור על 600 המיקרוליטרים הנותרים ויוצר ארבעה שכפולים טכניים לכל באר.באמצעות קורא לוחות המסוגל להאיר, רשום ערכים באינטגרציה של 0.25 אלפיות השנייה והשווה את הערכים היחסיים בין הטיפולים. הכתם האימונופלואורסצנטי הייצוגי של הבקרה אישר את לוקליזציה אפיקלית של גרעינים כלפי לומן ואת זיהוי הנבל בקצה החיצוני של האפיתל. בהשוואה לבקרה, חשיפה לליפו פוליסכריד, נמק גידולי אלפא, או היפוקסיה בלבד לא גרמה לשינויים גלויים במורפולוגיית התא הגולמי E-cadherin או לוקליזציה של נבל או עוצמת פלואורסצנטית.טיפול עם ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה שיבש את ארכיטקטורת האפיתל והדגים אובדן משמעותי של הצטלבות היצמדות וביטוי חלבון גבול המברשת שנחשף על ידי אובדן שמיעה ECA וכתם נבל. הכדאיות של התא האפיקלי נקבעה בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. בתנאים נורמוקסיים בהשוואה לבקרת ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא לא השפיעו באופן משמעותי על כדאיות התאים של אנטרואידים.עם זאת, ירידות משמעותיות בכדאיות נצפו בליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה בהשוואה להיפוקסיה בלבד. תוך כדי ביסוס מודל אפיקלי החוצה בתוך המנה. זכור לשמור על EDTA בהשעיית התא קר כקרח.זה ישפר את היפוך הקוטביות ויבטיח שכל ECM נוזלי כראוי והוסר. יישומים אחרים במורד הזרם כגון QPCR, RNA-seq, כתם מערבי או הערכות תפקודיות של חדירות מחסום יכולים להתבצע עוד יותר כדי לאפיין את התגובה לאיתות דלקתי בהיפוקסיה.

in-vitro-apical-out-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים את התפתחות מחלת דלקת המעי הנמקית במודל אנטרואיד יילודים שמקורו באדם המושרה על ידי טיפול בליפופוליסכרידים. מודל זה עוזר לחקור פתופיזיולוגיה של המעי.

אינדוקציה של דלקת מעיים נמקית במודל אנטרואיד אפיתל אנושי

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי...

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס וביצוע בדיקת פצע שריטה על מונולרים דו-ממדיים (דו-ממדיים) שמקורם באנטרוידים תלת-ממדיים (3D) שבודדו מאילאום של פרימטים שאינם בני אדם.

ההשפעה של חומצה היאלורונית 35 kDa על מודל in vitro של פגיעה מוקדמת במעי הדק וריפוי באמצעות מונולרים שמקורם באנטרואיד

פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה המשתמשת בצהוב לוציפר במודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט כדי לקבוע חדירות מעיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע חדירות paracellular ב enteroids כי מודל מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.

קביעת חדירות מעיים באמצעות לוציפר צהוב במודל אנטרואיד אפיקל-אאוט

Escherichia coli גורם אלח דם בילודים אשר בולעים את החיידקים סביב זמן הלידה. התהליך הכרוך ביכולתו של E. coli לנוע מהמערכת האנטרית לזרם הדם אינו מובן היטב. מודל זה במבחנה מעריך את יכולתם של זני E. coli לנוע דרך תאי אפיתל המעי.

הערכה של טרנסציטוזה מעיים של חיידקי חיידקי חיידקי Escherichia coli ילודים

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית (NEC) ובידוד לאחר מכן של תאי חיסון למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד.

מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

למדו את שיטת מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט לחקר אנטרוקוליטיס נמקית במבחנה. שיטה זו מאפשרת גישה לפני השטח האפיקלי ובדיקת תרופות פומיות ביעילות.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

גלה סרטונים נוספים