יישום ספקטרוסקופיית ראמן קוהרנטית נגד סטוקס (CARS) להדמיית מיאלינציה בפרוסות מוח
22 ביולי 2022
הדמיה של מיאלינציה היא מטרה חשובה עבור חוקרים רבים החוקרים את מערכת העצבים. CARS היא טכניקה התואמת את האימונופלואורסצנציה שיכולה לדמות באופן טבעי שומנים בתוך רקמות כגון המוח המאיר מבנים מיוחדים כגון מיאלין.
טכניקה זו יכולה לדמות מיאלין בקטעי רקמת המוח. מיאלינציה ממלאת תפקיד חשוב בהולכה של פוטנציאל פעולה והבנת המיאלין תעזור לנו להבין את תפקוד המוח. היתרון העיקרי של טכניקת CARS על פני, למשל, מיקרוסקופיית אלקטרונים הוא ש- CARS היא טכניקת מיקרוסקופיה קלה, וניתן לשלב אותה בקלות עם הדמיה פלואורסצנטית אחרת, כגון המשמשת באימונוהיסטוכימיה.
מספר מצבים רפואיים נובעים משינויים במיאלינציה, למשל, טרשת נפוצה, הזדקנות ואוטיזם. הבנת השינויים הללו תעזור לנו להבין את הבעיות הרפואיות הבסיסיות. במקרה זה, לייזר CARS מכוון לתמונה שומנים או, במיוחד, אג"ח CH2.
במוח, המקור הגדול ביותר של שומנים הוא המיאלין. לכן, זוהי טכניקה כדי לדמיין מיאלין ברקמת המוח. זה צריך להיות אפשרי להשתמש באותה שיטה עבור סוגים אחרים של רקמות כאשר הדמיה שומנים הוא עניין.
כוונון ויישור לייזר CARS דורש מומחיות משמעותית, והוא מבוצע בצורה הטובה ביותר על ידי מומחה לייזר או מיקרוסקופיה קלה. לאחר הכנת הרקמות כפי שמתואר בכתב היד, יש להכתים חתכים שצפים בחופשיות עבור משקעי ניסל ונוגדנים כדי לדמיין את גופי התאים, ולאחר מכן לדגור את החלקים על שייקר מעבדה סטנדרטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לפני הבאת הדגימות למיקרוסקופ, הפעל וחמם את לייזר ה- CARS למשך שעה אחת לפחות, ולאחר מכן יישר את לייזר ה- CARS על ידי חפיפה מרחבית של קרני הלייזר של המשאבה והסטוקס, וכוונן את ההשהיה בין שתי קרני הלייזר.
צבעו את אופטיקת המעבה ואת הסרעפת של המיקרוסקופ להדמיית CARS קדמית, ולאחר מכן התאימו את הפריסקופ החיצוני כך שירכז את שני הלייזרים החופפים מרחבית על מראות ראש הסריקה של המיקרוסקופ. לזיהוי הטוב ביותר של CARS קדימה ללא ייבוש. ודא שהמעבה מתפתה בצבע.
עבור אימונופלואורסצנציה, הדמיה קונפוקלית והדמיית מכוניות, התאימו את לייזר ה-CARS עם גלאים קדמיים ואפי-CARS שאינם מנוקבים על ידי שילוב מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים גלויים להדמיית פלואורסצנציה. כעת, הניחו את החלקים בצלחת תרבית עם תחתית מחליק כיסוי, ו- PBS כדי למנוע ייבוש הרקמה. כמו כן, השתמש במשקל זכוכית כדי לשמור על הרקמה ליד הכיסוי להחליק.
באמצעות ממשק המשתמש הגרפי, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה עבור מכוניות והדמיית פלואורסצנציה של טילים. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ, מקדו את הדגימה ותפסו את התמונות. טווח הספקטרום של CARS נע בין 640 ל-660 ננומטר, ונראה שאין חפיפה בספקטרום עם סמן אימונופלואורסצנטי המתויג על-ידי ניסל, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש באותות CARS עם אותות אימונופלואורסצנטיים.
ניסל שימשה להדמיה של גופי התאים של מוחות גרביל ועכברים מונגולים, וההדמיה של CARS שימשה להמחשת מעטפת המיאלין, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו על פני מינים שונים. שתי קבוצות התמונות מציגות מקטע של הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז בגזע המוח. הרזולוציה של CARS נמוכה יותר מאשר במיקרוסקופ אלקטרונים והיא בסדר גודל של כמה מאות ננומטרים.
ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית, כגון ImageJ כדי לכמת את הפרמטרים המעניינים, למשל, עובי או אורך המיאלין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן ב-CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), טכניקה המשמשת להדמיית מיאלינציה במחקר של מערכת העצבים. CARS מאפשרת הדמיה טבעית של ליפידים בתוך רקמת המוח, מה שהופך אותה לבעלת ערך להבנת מצבים רפואיים הקשורים למיאלין, כגון טרשת נפוצה ואוטיזם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח (Neuroscience)
- טכניקות דימות
- מחקרי מיאלינציה
רקע
- מיאלינציה חיונית להולכה של פוטנציאלי פעולה במערכת העצבים.
- הפרעות במיאלינציה מעורבות במספר מצבים רפואיים.
- CARS מספקת יתרון משמעותי על פני מיקרוסקופיית אלקטרונים מסורתית.
מטרת המחקר
- לבחון את היישום של CARS לדימות מיאלין ברקמות מוח.
- להעמיק את ההבנה של תפקיד המיאלין בתפקוד המוח ובהפרעות קשורות.
- לפתח שיטות התואמות לטכניקות של אימונופלואורסצנציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימות CARS מיושם עבור חתכים של רקמת מוח.
- הוא עושה שימוש בנוגדנים ובצבעים כדי להדגים גופי תאים יחד עם מיאלין.
- פרמטרי רכישת תמונה סטנדרטיים נקבעים לפני לכידת התמונות.
- תשומת לב מיוחדת מוקדשת לתהליכי כוונון ויישור הלייזר.
תוצאות עיקריות
- CARS מאפשרת ויזואליזציה יעילה של מעטפת המיאלין וניתן לשלב אותה עם סמני אימונופלואורסצנציה.
- התמונות מראות מבני מיאלין מובחנים שניתן לנתח לצורך מדידת עובי ואורך.
- הרזולוציה אינה גבוהה כמו במיקרוסקופיה אלקטרונית, אך היא מספיקה לניתוחים ספציפיים.
מסקנות
- שיטת CARS מאפשרת דימוי מפורט של מיאלין, ובכך תורמת למחקר על מצבים נוירולוגיים.
- התקדמות זו מאפשרת הבנה טובה יותר של תהליך המיאלינציה במוח והשלכותיו על הבריאות והמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ספקטרוסקופיית רמן אנטי-סטוקס קוהורנטית (CARS) מאפשרת דימוי כמותי ללא סימון של מיאלינציה ברקמת מוח, ובכך תומכת ישירות בהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות התפתחותיות של מערכת העצבים. התאימות שלה לתהליכי עבודה של אימונופלואורסצנציה מאפשרת ניתוח מולטיפלקס של סמני מיאלין וסינפסות, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי גילוי מוקדמים ובמסלולי מחקר של נוירוסיינס תרגומי. יכולת זו רלוונטית אסטרטגית עבור צוותי ביו-פארמה המתעדפים מערכות מודל רלוונטיות למחלה ותיקוף יעדים חסון בתיקי פיתוח למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה וכמותיות ישירות של מיאלין, ובכך תומך בתיקוף תפקודי של מטרות במודלים של מחלות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מסייע בחקירת מנגנוני מיאלינציה המעורבים בטרשת נפוצה, הזדקנות והפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- תומך בוודאות חיזויית על ידי מתן אפשרות לסימון משותף עם סמנים סינפטיים ותאיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות מאומתות של רקמת מוח לסריקת תרכובות המשך המכוונת למסלולי מיאלינציה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות דימוי כמותי וניתן לשחזור של עובי ואורך המיאלין.
- תומך בשילוב עם אימונופלורסצנציה לקבלת תוצאות מרובות (multiplexed) בתהליכי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישם התאמה בין תוצרי דימוי לבין סממנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה, על מנת להבטיח רצף טרנסלציונלי במודלים של דמילינציה והפרעות נוירו-התפתחותיות.
- מסייע בקבלת החלטות לגבי קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות אספקת נתונים כמותיים על מיאלינציה בין מינים שונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף פרה-קליני של מועמדים לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
דימוי CARS משתלב ברצף שבין הגילוי המוקדם לשלב הפרה-קליני, ומאפשר בדיקת השערות, תיקוף מטרות והתאמת סמנים ביולוגיים תרגומיים במחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: מספקת הערכה כמותית וישירה של המיאלינציה ופיזור הליפידים ברקמת המוח.
- סריקה: מספקת תוצרי דימות רב-ערוציים (multiplexed) הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות במערכות רקמה מאושרות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של עובי ואורך המיאלין לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: תומכת בסנכרון של סמנים ביולוגיים ובהמשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמת דימות רב-פעמית הניתנת להתאמה לסוגי רקמות ומודלי מחלה שונים שבהם דימוי ליפידים הוא רלוונטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי עבודה של דימות סטנדרטיים וניתנים לשחזור, התואמים לניתוח מולטיפלקס (multiplexed analysis).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים כמותיים אמינים בשלבים מוקדמים של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות CNS המתמקדות במיאלינציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור לייזר ובמיקרוסקופיה של אור מתקדמת להגדרה ותפעול אופטימליים.
- נדרשת גישה לפלטפורמות של מיקרוסקופיה קונפוקלית המצוידות הן להדמיית CARS והן להדמיית אימונופלואורסצנציה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי ההדמיה ופרוטוקולי הניתוח לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למספר מינים וסוגי רקמות, אך הרזולוציה נמוכה מזו של מיקרוסקופיית אלקטרונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בהכשרה מקצועית ובתשתית להדמיית CARS.
