שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

החיבור של יציאות כדי להזדווג למזרקים עם צינורות הוא קריטי מכיוון שכאשר זה נעשה נכון, אין דליפות, אין בועות בתא הזרימה, וניתן לבצע ניסויים שוב ושוב באמצעות אותו תא זרימה במשך תקופה של שנה עם שימוש זהיר. כאן, שתי שיטות פשוטות יוצגו כדי לחבר את המחברים לתאי זרימה. אלה קלים, הם ניתנים לשחזור, ומאפשרים לחוקר להתאים בקלות את תא הזרימה לצרכים שלו בלי יותר מדי בעיות.

השימוש בתאי זרימה אלה נעשה מתוך מחשבה על ניסויים במולקולה בודדת. בפרט, מה שאנו מכנים ביוכימיה חזותית, אך ניתן להשתמש בהם בכל מחקר שבו נדרשת מיקרופלואידיקה ובמצבים שבהם יש להשתמש בזרימת נוזל למינה. לכן, כדי להימנע מטעויות, במקום להשתמש בתאי זרימה יקרי ערך כדי לבסס את הטכניקות, הייתי מציע לתרגל תחילה על מגלשת זכוכית או על החלקת כיסוי.

זה יאפשר לקבל תחושה של הזכוכית או חומרי PDMS כדי לדעת איך לטפל בהם וכמה כוח להפעיל בעת הכנסת צינורות או הדבקת המחברים. פעולה זו תדרוש הקרבה של מחברים מסוימים, אך הם זולים בהרבה מתאי הזרימה. התחילו בהנחת תא הזרימה על משטח שטוח ונקי.

החזק את צינור ה- PTFE שלושה מילימטרים מהקצה החופשי עם מלקחיים ודחף את הצינורות לתוך היציאה. חזור על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות. חבר את יציאות הכניסה למשאבת המזרק ואת השקע לבקבוק פסולת.

מלאו כל מזרק זכוכית במיליליטר אחד של ספקטרו פוטומטרי, מתנול כיתה וחברו אותם לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לפסולת וטהר כל קו עם 50 מיקרוליטר של מתנול. החלף את מיקום היציאה לתא הזרימה ושאב 800 מיקרוליטר של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר לשעה כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.

למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 microliters של מים ultrapure. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש. אם יש להשתמש במחברי צינורות המתאימים ללחיצה, הסר בזהירות את סרט ההדבקה מצד אחד של המחבר והנח אותו מעל החור בשקופית המיקרוסקופ.

לחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. חזור על התהליך עבור המחברים הנותרים. לאחר מכן הניחו את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי.

החזק את צינור ה- PTFE שלושה מילימטרים מהקצה החופשי ודחף את הצינורות לתוך החור ביציאה. חזור על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות. חברו צינורות מהכניסות לשסתומי המיתוג.

מקם את הקובץ המצורף על משטח נקי ושטוח או על סעפת שנבנתה במיוחד כדי להחזיק את תא הזרימה והמחברים במקומם בזמן ההדבקה. מניחים את תא הזרימה על החלק השקוע של הסעפת ואז מניחים כמות קטנה של דבק זכוכית בתחתית המכלול ומכניסים את האטם. מקם את יציאת הננו מעל אחד מחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ.

יש לדחוף בעדינות כלפי מטה ולהחזיק במקומם ללא תזוזה לרוחב. חזור על התהליך עבור היציאות הנותרות. אפשר להתייבש או להדק במקומו בסעפת.

הסר בעדינות את תא הזרימה מהסעפת וודא שהמכלולים מתיישרים היטב עם יציאות הכניסה בתא הזרימה. הנח תא זרימה על במת המיקרוסקופ וחבר את הצינורות באמצעות מחברים הדוקים לאצבע. מלאו כל מזרק זכוכית במיליליטר אחד של מתנול בדרגה פוטומטרית ספקטרו.

חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לפסולת וטהר כל קו עם 50 מיקרוליטר של מתנול. החלף את מיקום היציאה לתא הזרימה ושאב 800 מיקרוליטר של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר לשעה.

למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 microliters של מים ultrapure. מדידת תפוקת הכוח מוצגת כאן. תפוקת ההספק מהלייזר נמדדת לפני התקנת ראש הלייזר בפריסה האופטית.

לאחר ביצוע יישור ההשמנה, עוצמת הקרן נמדדת לאחר המטרה של 100 x עבור כל מלכודת. התמונות מדגימות את הלכידה האופטית היציבה של חרוזי פלואורסצנט של מיקרומטר אחד. כאן F היא מלכודת קבועה, ו-M היא מלכודת ניידת.

כאשר המלכודת הניידת במצב סריקה נעה במעגל קטן או גדול ב-30 הרץ. זרימת הנוזלים בתוך תא הזרימה היא למינרית. הסכימה מראה את תא הזרימה מלמעלה כדי להדגים שהדיפוזיה הבין-ערוצית היא המקור העיקרי לערבוב בין זרמי הנוזלים הסמוכים.

חצים כחולים מציינים את כיוון הזרימה והזרמים הבודדים צבועים, לבן, אפור בהיר ולבן. האזורים המתרחבים של דיפוזיה רוחבית בין ערוצים מסומנים באדום. הכניסה מציגה תמונה פלואורסצנטית של זרמי הנוזלים הסמוכים בהגדלה של פי 10 עם קומפלקסים של חרוזי DNA המסומנים בפלואורסצנט בזרם התחתון ובופרים רק בזרם העליון.

הכתמים הלבנים בזרם העליון הם רעש נורה ממצלמת CCD. פרופיל הזרימה ותאי הזרימה הלמינרית הם פרבוליים. תא הזרימה מוצג מהצד וכיוון הזרימה מצוין מעל כל תא.

מהירות חרוז ליניארית מושפעת ממהירות המשאבה וריכוז סוכרוז. הכוח המנוגד על חרוז מושפע מצמיגות התמיסה. קוטר החרוזים משפיע על הכוח על החרוזים תחת זרימה.

כשאתם מנסים הליך זה, ודאו שהאזור בו אתם עובדים נקי ושניקיתם את משטחי הזכוכית במתנול או אצטון בדרגה ספקטרומטרית. בשלב זה, אתה אמור להיות תא זרימה כי הוא עשה את זה למשאבת המזרק שלך ואתה עכשיו מוכן להציג את הפתרונות שלך ולהתחיל ניסויים פינצטה אופטית. השימוש בתאי זרימה, שניתן להשתמש בהם לפרקי זמן ממושכים, אפשר לחוקרים לחקור מגוון תגובות של מולקולה בודדת שבהן נמדדים שני הכוחות, התגובות מוצגות על ידי פלואורסצנציה או שילוב של שניהם.