מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

הפרעות נוירודגנרטיביות ובריאות הנפש נובעות משינויים בתקשורת הסינפטית. אירועים מולטיפקטוריאליים משנים את הקולטנים הסינפטיים בדרכים שאיננו מבינים לחלוטין. מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות מספקת תובנה לגבי שינויים אלה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא האפשרות לרשום את הפעילות של קולטני מוח מקומיים הפועלים במוח האנושי, ולכן, מייצגים את המחלות שאנו חוקרים. קולטנים סינפטיים הם מטרות עיקריות לרפואה המווסתת את הפעילות החשמלית של המוח, אך מתוך הבנה כיצד קולטנים אלה משתנים, ניתן לפתח טיפולים טובים יותר המשחזרים את הפונקציונליות שלהם. שיטה זו יושמה בהצלחה על מינים שונים, מחרקים, דגים, יונקים, אך ניתן ליישם אותה גם על קולטני ממברנה מחוץ למוח, למשל, שרירים וגידולים.

האפשרויות רחבות. קיצוץ מחטי הזרקה הוא מסובך. קטן מדי יכול למנוע הזרקת חלבון, ושניים גדולים יכולים להרוג את התא.

זה עוזר להשתמש במדידה עקבית, כמו קצה של סכין גילוח. התחילו בכך שתצלמו את הדגימות הנבחרות שהוכנו מאזור המוח האנושי שמעניין אותו שלוש פעמים באמבטיה עם קרח רטוב צף. השתמשו בחמישה מחזורי שניות בכל פעם, והמתינו דקה אחת על קרח רטוב בין המחזורים.

הניחו מיקרוליטר אחד של הדגימה על התרמופלסטיק, ובצעו כניסה על פני השטח, במידת הצורך, לפני מיקום הדגימה כדי למנוע את תנועת הדגימה. השתמש בידיות של המניפולטור המחזיק את הננו-גנרטור כדי למקם את המחט, והזיז אותה לעבר הדגימה למילוי. ברגע שקצה המחט נמצא בדגימה, לחצו לחיצה ממושכת על כפתור המילוי עד לקבלת דגימה מספקת.

כ 0.5 דגימת microliter נדרש עבור 10 ביציות. השתמש בידיות כדי להזיז את המחט של הננו-גנרטור בחזרה למיקום הגבוה ביותר. לחדור את הביצית ממש מתחת לפני השטח עם מחט, לא עמוק יותר, ולהשתמש בדוושת הרגל כדי להזריק את הדגימה.

המתן בערך שתיים-שלוש שניות. לאחר הזרקה מוצלחת, התא יתרחב. השתמש בידיות שעל המניפולטור כדי לצאת מהתא.

הזיזו את צלחת הפטרי כך שהביצית הבאה תהיה מיושרת עם המחט. חזור על התהליך עד שהוזרק מספר הביציות הרצוי בצלחת, ואז חזור על הננו-איניג'קטור למקומו המקורי והסר את המחט. ודא כי באר אחת של ביציות נשארת ללא הזרקה כדי לשמש כבקרה.

הפעל את כל הציוד המשמש להקלטת זרמי יונים, ולאחר מכן הפעל את המחשב השולחני והיכנס ל- WinEDR גרסה 3.9.1. ודא שהתוכנית פועלת ושהרשומה מוגדרת לדיסק. לאחר מכן, הגדר את משך ההקלטה, ונקה את האפשרות סימולטור.

עבור קטע אלקטרודות המתח, כבה את פיצוי הקיבולת השלילית. הגדר את מתג בורר הרווח ל- 10 עבור מקטע אלקטרודות האמבטיה, ולאחר מכן הגדר את מתג החלפת שלושת המיקום, שבוחר את מכפיל הרווח, ל- x1. נורות ה-LED יציינו את בחירת מכפיל הרווח.

כבה את בורר מצבי המהדק, הכנס את בקרת ההגברה של DC והגדר את בקרת ההשגה לכמחצית מהלולאה הפתוחה ברוחב הפס המלא. הגדר פקודות ל- 40 מיליבולטים, פקדי ההחזקה לשליליים ומכפיל קנה המידה ל- x2. עבור האלקטרודה הנוכחית, השתמש בהיסט VE כדי ליצור ייחוס אפס, לפני ההטלה של הביצית.

לאחר מכן, פתח את תוכנת WinEDR גרסה 3.9.1, עבור לתפריט העליון ובחר קובץ, ואחריו חדש. צור תיקיה משלך ושמור את הקובץ. בתפריט הראשי, בחר הקלטה, ואחריו הקלטה לדיסק.

מניחים את גשרי האגר בחורים העגולים המתאימים מאחורי תא ההקלטה, ומחברים את הבארות לאלקטרודות המשמשות כהפניה קרקעית בתא ההקלטה. הוסף את תמיסת העבודה של 1x Ringer לשסתום הזלוף המתאים. פתח את השסתום עד שתא ההקלטה יתמלא בתמיסת צלצול.

באמצעות המניפולטורים הימניים והשמאליים המחזיקים את האלקטרודות, מכוונים את מחטי האלקטרודות לתוך תא ההקלטה המלא בתמיסת רינגר. בדוק את ההתנגדות של כל אלקטרודה על ידי אפס ידיות היסט VM ו- VE, ולאחר מכן לחיצה על כפתורי בדיקת האלקטרודה. ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5 לשלושה מגה-אוהם.

אם ההתנגדות היא מחוץ לטווח, החלף אותה באמצעות מיקרו-אלקטרוניקה חדשה. לאחר מכן, מלאו את תא ההקלטות בפתרון טרי של רינגר. השתמש בפיפטה זכוכית כדי למקם ביצית שאינה מוזרקת או מיקרו מושתלת במרכז תא ההקלטה.

ודא שהביצית נראית בבירור מתחת למיקרוסקופ עם הצד החי למעלה. הנחה את האלקטרודה לתוך תמיסת הצלצול עד שהם נוגעים בקרום הביציות. חודרים בעדינות את קרום הביציות בצד החיה עם שתי האלקטרודות, ורושמים את פוטנציאל קרום המנוחה.

הפעל את זרימת הפתרון של הצלצול. באמצעות מגבר מהדק הביציות, שנה את המצב למהדק מתח איטי, והגדר את מתח ההחזקה ל-80 מיליוולטים. הזרם על הצג צריך להיות שלילי, בדרך כלל בין 0 ל 0.4 microamperes.

עבור אל קובץ, חדש ולאחר מכן שמור את ההקלטה בתוכנה כדי ליצור קובץ חדש ולשמור את ההקלטה. לחץ על תקליט ואחריו תקליט לדיסק כדי להתחיל את ההקלטה. הוסף מידע רלוונטי לקובץ באמצעות תיבת הדו-שיח 'תרשים סימון'.

יש ליישם אגוניסטים לגירוי כימי על ידי פתיחת השסתומים, והכנסתם לתא ההקלטה למשך 15 שניות. לאחר השלמת ההקלטה, כבה את מהדק המתח למצב כבוי, וכבה את שסתום הפתרון של הצלצול. הסר את הביצית, והשלך בהתאם למדיניות המוסדית של דגימות מוח אנושיות, ואז הפסק את ההקלטה ושמור את הקובץ.

שמור עותק של ההקלטות בכונן USB. משם, פתח את הקובץ הרצוי לניתוח. כדי למדוד את התגובה המרבית של AMPA, ואת תגובת השיא של GABA A, תחילה, קבע רמה או קו בסיס של 0 על-ידי מציאת הקו האדום, ולאחר מכן גרור אותו לזרם שנוצר על-ידי יישום רינגר או קו הבסיס.

לאחר קביעת רמת 0, קבע את מדידות התגובה על-ידי גרירת סמן הקריאה האנכי הירוק לחלק הרצוי של עוקב התרשימים. נרשמו זרמי יונים מהביציות שהוזרקו עם הממברנות מהקולטנים הסינפטיים האנושיים. קולטני AMPA הופעלו עם 100 קאינאט מיקרומולרי, וקולטני GABA A עם GABA מילימולרי אחד.

הזרקה משותפת של הממברנות המסוננות מהאיבר החשמלי של טורפדו, עשיר בקולטני אצטילכולין, וקידוד cDNA לקולטן שורת GABA 1 לתוך הקוטב החיה הפיקו בעיקר שתי קבוצות של ביציות, בהתבסס על תגובותיהן. לקבוצה אחת של ביציות היו תגובות גדולות לאצטילכולין, אך לא היו תגובות ל-GABA מיקרומולרי אחד. לביציות בקבוצה אחרת היו תגובות ריקות או נמוכות לאצטילכולין, אך תגובות גדולות ל-GABA.

התמונה הגרפית מציגה את שגיאת התקן הממוצע פלוס מינוס של ממוצע זרם השיא בקבוצה אחת ובקבוצה שתיים. לביצית אחת בקבוצה השנייה היו תגובות גדולות של GABA ואצטילכולין, מה שמרמז על קרע בגרעין. כתוצאה מכך, התפלגות התגובות הייתה מוטה לערכים נמוכים, כפי שצוין על ידי ההבדל בין הממוצע לבין החציון של התפלגות זרם הממברנה.

אחד הגורמים לביציות בתגובה נמוכה הוא שממברנות מוזרקות, ונלכדות בגרעין הביצית. תגובות GABA וקאיינט של ביציות שהוזרקו לתוך הקטבים של החיה או הצמחייה עם ממברנות לא מסוננות המתקבלות ממוח שאינו AD, ומוח AD מוצגים כאן. ביציות שהוזרקו ליד הקוטב החייתי מבלי להתמקד בגרעין נתנו תגובות גדולות יותר מאשר ביציות שהוזרקו לקוטב הצמחי, ובכך אפשרו לחקור דגימות רקמה עם מספר נמוך מאוד של קולטנים.

בעת ניסיון הליך זה, עקוב תמיד אחר רמת הצלצול שלך. זה תמיד במהלך ההקלטות החשובות שייגמרו לך, ואז הוא ישתמש בתוצאה שלך, ובמות של הביצית, ובאובדן של נתונים יקרי ערך מאוד. לאחר הליך זה, אנו יכולים לבצע עומסים מערביים כדי לאמת את נוכחותם של הקולטנים הסינפטיים, או חלבונים בעלי עניין.

הוא מאפשר למדוד עירור גלובלי לעכב יחסים סינפטיים באזורי מוח שונים, והפרעות מוחיות שונות, ומאפשר לבצע בדיקה ישירה על ניבוי תיאורטי על הגורמים למחלות.