Name: מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למד מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לרישום תגובות קולטנים AMPA ו-GABA בביצי Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת חקר פעילות קולטנים מוחיים טבעיים הקשורים להפרעות נוירודגנרטיביות ונפשיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIA/NIH R01AG070255 ו-R01AG073133 ל-AL. אנו מודים גם למרכז לחקר מחלת האלצהיימר של אוניברסיטת קליפורניה אירווין (UCI-ADRC) על שסיפק את הרקמה האנושית המוצגת בכתב יד זה. UCI-ADRC ממומן על ידי מענק NIH / NIA P30 AG066519.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ניתוח של קומפלקסים חלבוניים מקומיים ממוחות אנושיים נחוץ כדי להבין תהליכים הומאוסטטיים ופתולוגיים בהפרעות מוחיות ולפתח אסטרטגיות טיפוליות למניעה או לטיפול במחלות. לפיכך, בנקי מוח המכילים דגימות קפואות הצמדה הם מקור שלא יסולא בפז לעושר גדול ובעיקר לא מנוצל של מידע פיזיולוגי29,30. דאגה ראשונית לשימוש ברקמה לאחר המוות היא האפשרות הברורה של mRNA או פירוק חלבונים שעלולים לבלבל את הפרשנות של נתונים. לדוגמה, ה- pH של המוח מראה באופן עקבי מתאם חיובי עם כימות של mRNA על יד...

הפרעות נוירודגנרטיביות משפיעות על אחוז גדול מהאוכלוסייה. למרות שתוצאותיהם ההרסניות ידועות היטב, הקשר בין השינויים התפקודיים של קולטני נוירוטרנסמיטר, שהם קריטיים לתפקוד המוח, והסימפטומטולוגיה שלהם עדיין לא מובן היטב. שונות בין-אישית, האופי הכרוני של המחלה והתפרצות חתרנית של תסמינים הם רק חלק מהסיבות שעיכבו את ההבנה של הפרעות המוח הרבות שבהן חוסר האיזון הכימי מתועד היטב 1,2. מודלים של בעלי חיים יצרו מידע שלא יסולא בפז והרחיבו את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה במערכות משומרות אבולוציוניות; עם זאת, מספר הבדלים בין-מיניים בין מכרסמים לבני אדם מונעים אקסטרפולציה ישירה של תפקוד הקולטנים ממודלים של בעלי חיים למוח האנושי3. לפיכך, המאמצים הראשוניים לחקור קולטנים אנושיים מקומיים פותחו על ידי מעבדתו של ריקרדו מילדי באמצעות רקמות שהוסרו בניתוח ודגימות קפואות. ניסויים ראשוניים אלה השתמשו בממברנות שלמות הכוללות קולטנים סינפטיים עצביים וסינפטיים נוספים, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר שאינם עצביים, ולמרות שהם מספקים מידע חשוב על מצבים חולים, קיים חשש שתמהיל הקולטנים מסבך את הפרשנות של נתונים 4,5,6,7. חשוב לציין, סינפסות הן המטרה העיקרית בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות 8,9; לכן, מבחנים לבדיקת התכונות התפקודיות של סינפסות מושפעות הם בסיסיים כדי לקבל מידע על שינויים רלוונטיים למחלה המשפיעים על התקשורת הסינפטית. כאן מתואר שינוי של השיטה המקורית: מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות (MSM), המתמקדת באפיון פיזיולוגי של תכשירי חלבונים סינפטיים מועשרים ויושמה בהצלחה בחקר חולדות וסינפטוסומים אנושיים 10,11,12,13,14,15 . בעזרת מתודולוגיה זו, ניתן להשתיל קולטנים סינפטיים שפעם עבדו במוח האנושי, משובצים בשומנים המקומיים שלהם ועם קבוצת חלבונים נלווים משלהם. יתר על כן, מכיוון שנתוני MSM הם כמותיים, ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להשתלב עם מערכי נתונים פרוטאומיים או רצף גדולים10.
חשוב לציין כי ניתוחים פרמקולוגיים וביופיזיים רבים של קולטנים סינפטיים נעשים על חלבונים רקומביננטיים16,17. בעוד שגישה זו מספקת תובנה טובה יותר לגבי יחסי מבנה-תפקוד של קולטנים, היא אינה יכולה לספק מידע על קומפלקסים מורכבים של קולטנים רב-מתכתיים המצויים בתאי עצב ועל השינויים שלהם במחלות. לכן, שילוב של חלבונים מקומיים ורקומביננטיים צריך לספק ניתוח מקיף יותר של קולטנים סינפטיים.
ישנן שיטות רבות להכנת סינפטוזומים 10,11,12,13,14,15 אשר ניתן להתאים לדרישות המעבדה. הפרוטוקול מתחיל בהנחה שתכשירים מועשרים סינפטוזומליים בודדו ומוכנים לעיבוד לניסויים במיקרו-טרנספלנטציה. במעבדה, נעשה שימוש בשיטת Syn-Per בהתאם להוראות היצרן. זה נעשה בגלל יכולת שכפול גבוהה בניסויים אלקטרופיזיולוגיים10,11. יש גם ספרות בשפע המסביר כיצד לבודד את ביציות קסנופוס 18,19, אשר ניתן לרכוש גם מוכן להזרקה20.

<table><tbody><tr><td><חזק>למיקרו-הזרקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 אינץ' נימי זכוכית</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>24 באר, תחתית שטוחה צלחת תרבית</td><td>רקמות Thermofisher</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער/חום</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת צלחת</td><td>Thermofisher</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Thermofisher</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Thermofisher</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון</td><td>רשת תעשייתית</td><td>WN0800</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>Thermofisher</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>אמבט ניקוי אולטרסאונד</td><td>Thermofisher</td><td>FS20D</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis צפרדעים</td><td>Xenopus 1</td><td>4217</td><td></td></tr><tr><td><חזק>לשני אלקטרודות מהדק מתח </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ס"מ באורך אש מלוטש בורוסיליקט זכוכית נימי סאטר</td><td></td><td>B200-116-15</td><td></td></tr><tr><td>כל מחשב מחשב או מחשב נייד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן בסל מעביר נמוך</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>תחנת עבודה מהדק מתח שתי אלקטרודות</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>TEV-700</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 בקר זלוף</td><td>אוטומציה מק</td><td>"ט מדעי:01-18</td><td></td></tr><tr><td>WInEDR תוכנה חופשית</td><td>אוניברסיטת סטרצ'קלייד גלזגו</td><td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td></tr><tr><td>X סדרה רב תכליתית DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6341</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן דיכלוריד</td><td>Thermofisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקת טטרה-הידרט</td><td>Thermofisher</td><td>C109</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית)Thermofisher</td><td></td> <td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>חומצה קאינית</td><td>Tocris</td><td>0222</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט</td><td>Thermofisher</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Thermofisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Thermofisher</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Thermofisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-0.1 ומיקרו; מסנן MC מ',</td> <td>אמיקון</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

קולטנים יונוטרופיים מעוררים ומעכבים הם השערים העיקריים של שטפי יונים הקובעים את פעילות הסינפסות במהלך תקשורת עצבית פיזיולוגית. לכן, שינויים בשפע, בתפקודם ובקשריהם עם אלמנטים סינפטיים אחרים נצפו כמתאם עיקרי של שינויים בתפקוד המוח ופגיעה קוגניטיבית במחלות נוירודגנרטיביות והפרעות נפשיות. הבנת האופן שבו הפונקציה של קולטנים סינפטיים מעוררים ומעכבים משתנה על ידי מחלה היא בעלת חשיבות קריטית לפיתוח טיפולים יעילים. כדי לקבל מידע רלוונטי למחלה, חשוב לתעד את הפעילות החשמלית של קולטני נוירוטרנסמיטר שנותרים מתפקדים במוח האנושי החולה. עד כה זוהי הגישה הקרובה ביותר להערכת שינויים פתולוגיים בתפקוד הקולטנים. בעבודה זו מוצגת מתודולוגיה לביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות, המורכבת מהפעלה מחדש של ממברנות סינפטיות מרקמת מוח אנושית קפואה המכילה קולטנים אנושיים, על ידי הזרקתה ואיחוי אחורי לתוך הממברנה של ביציות Xenopus laevis . הפרוטוקול מספק גם את האסטרטגיה המתודולוגית להשגת תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) וקולטני חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA), כמו גם שיטות מפורטות חדשניות המשמשות לנורמליזציה ולניתוח נתונים קפדני.

תוך מספר שעות לאחר ההזרקה, הממברנות הסינפטיות, הנושאות את קולטני הנוירוטרנסמיטר ותעלות היונים שלהן, מתחילות להתמזג עם קרום פלזמת הביציות. איור 1 מראה הקלטות של קולטני AMPA ו-GABAA שהוזרמו במיקרו-טרנסנטים לביציות קסנופוס. במשך רוב הניתוח נמדדו התגובות של שתיים או שלוש ביציות לכל דגימה, באמצעות שתיים או שלוש קבוצות של ביציות מצפרדעים שונות, בסך הכל שש עד תשע ביציות לכל דגימה. זה נעשה עבור קבוצה גדולה של נבדקים אנושיים כדי לבחון הבדלים קבוצתיים. הניתוח פשוט ומודד משרעת של תג...

הפרוטוקול מדגים כי על ידי ביצוע מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לתוך ביציות קסנופוס לאוויס , ניתן לרשום תגובות עקביות ואמינות של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית וחומצה γ-אמינו-בוטירית.

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

הפרעות נוירודגנרטיביות ובריאות הנפש נובעות משינויים בתקשורת הסינפטית. אירועים מולטיפקטוריאליים משנים את הקולטנים הסינפטיים בדרכים שאיננו מבינים לחלוטין. מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות מספקת תובנה לגבי שינויים אלה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא האפשרות לרשום את הפעילות של קולטני מוח מקומיים הפועלים במוח האנושי, ולכן, מייצגים את המחלות שאנו חוקרים. קולטנים סינפטיים הם מטרות עיקריות לרפואה המווסתת את הפעילות החשמלית של המוח, אך מתוך הבנה כיצד קולטנים אלה משתנים, ניתן לפתח טיפולים טובים יותר המשחזרים את הפונקציונליות שלהם. שיטה זו יושמה בהצלחה על מינים שונים, מחרקים, דגים, יונקים, אך ניתן ליישם אותה גם על קולטני ממברנה מחוץ למוח, למשל, שרירים וגידולים.האפשרויות רחבות. קיצוץ מחטי הזרקה הוא מסובך. קטן מדי יכול למנוע הזרקת חלבון, ושניים גדולים יכולים להרוג את התא.זה עוזר להשתמש במדידה עקבית, כמו קצה של סכין גילוח. התחילו בכך שתצלמו את הדגימות הנבחרות שהוכנו מאזור המוח האנושי שמעניין אותו שלוש פעמים באמבטיה עם קרח רטוב צף. השתמשו בחמישה מחזורי שניות בכל פעם, והמתינו דקה אחת על קרח רטוב בין המחזורים.הניחו מיקרוליטר אחד של הדגימה על התרמופלסטיק, ובצעו כניסה על פני השטח, במידת הצורך, לפני מיקום הדגימה כדי למנוע את תנועת הדגימה. השתמש בידיות של המניפולטור המחזיק את הננו-גנרטור כדי למקם את המחט, והזיז אותה לעבר הדגימה למילוי. ברגע שקצה המחט נמצא בדגימה, לחצו לחיצה ממושכת על כפתור המילוי עד לקבלת דגימה מספקת.כ 0.5 דגימת microliter נדרש עבור 10 ביציות. השתמש בידיות כדי להזיז את המחט של הננו-גנרטור בחזרה למיקום הגבוה ביותר. לחדור את הביצית ממש מתחת לפני השטח עם מחט, לא עמוק יותר, ולהשתמש בדוושת הרגל כדי להזריק את הדגימה.המתן בערך שתיים-שלוש שניות. לאחר הזרקה מוצלחת, התא יתרחב. השתמש בידיות שעל המניפולטור כדי לצאת מהתא.הזיזו את צלחת הפטרי כך שהביצית הבאה תהיה מיושרת עם המחט. חזור על התהליך עד שהוזרק מספר הביציות הרצוי בצלחת, ואז חזור על הננו-איניג'קטור למקומו המקורי והסר את המחט. ודא כי באר אחת של ביציות נשארת ללא הזרקה כדי לשמש כבקרה.הפעל את כל הציוד המשמש להקלטת זרמי יונים, ולאחר מכן הפעל את המחשב השולחני והיכנס ל- WinEDR גרסה 3.9.1. ודא שהתוכנית פועלת ושהרשומה מוגדרת לדיסק. לאחר מכן, הגדר את משך ההקלטה, ונקה את האפשרות סימולטור.עבור קטע אלקטרודות המתח, כבה את פיצוי הקיבולת השלילית. הגדר את מתג בורר הרווח ל- 10 עבור מקטע אלקטרודות האמבטיה, ולאחר מכן הגדר את מתג החלפת שלושת המיקום, שבוחר את מכפיל הרווח, ל- x1. נורות ה-LED יציינו את בחירת מכפיל הרווח.כבה את בורר מצבי המהדק, הכנס את בקרת ההגברה של DC והגדר את בקרת ההשגה לכמחצית מהלולאה הפתוחה ברוחב הפס המלא. הגדר פקודות ל- 40 מיליבולטים, פקדי ההחזקה לשליליים ומכפיל קנה המידה ל- x2. עבור האלקטרודה הנוכחית, השתמש בהיסט VE כדי ליצור ייחוס אפס, לפני ההטלה של הביצית.לאחר מכן, פתח את תוכנת WinEDR גרסה 3.9.1, עבור לתפריט העליון ובחר קובץ, ואחריו חדש. צור תיקיה משלך ושמור את הקובץ. בתפריט הראשי, בחר הקלטה, ואחריו הקלטה לדיסק.מניחים את גשרי האגר בחורים העגולים המתאימים מאחורי תא ההקלטה, ומחברים את הבארות לאלקטרודות המשמשות כהפניה קרקעית בתא ההקלטה. הוסף את תמיסת העבודה של 1x Ringer לשסתום הזלוף המתאים. פתח את השסתום עד שתא ההקלטה יתמלא בתמיסת צלצול.באמצעות המניפולטורים הימניים והשמאליים המחזיקים את האלקטרודות, מכוונים את מחטי האלקטרודות לתוך תא ההקלטה המלא בתמיסת רינגר. בדוק את ההתנגדות של כל אלקטרודה על ידי אפס ידיות היסט VM ו- VE, ולאחר מכן לחיצה על כפתורי בדיקת האלקטרודה. ההתנגדות צריכה להיות בין 0.5 לשלושה מגה-אוהם.אם ההתנגדות היא מחוץ לטווח, החלף אותה באמצעות מיקרו-אלקטרוניקה חדשה. לאחר מכן, מלאו את תא ההקלטות בפתרון טרי של רינגר. השתמש בפיפטה זכוכית כדי למקם ביצית שאינה מוזרקת או מיקרו מושתלת במרכז תא ההקלטה.ודא שהביצית נראית בבירור מתחת למיקרוסקופ עם הצד החי למעלה. הנחה את האלקטרודה לתוך תמיסת הצלצול עד שהם נוגעים בקרום הביציות. חודרים בעדינות את קרום הביציות בצד החיה עם שתי האלקטרודות, ורושמים את פוטנציאל קרום המנוחה.הפעל את זרימת הפתרון של הצלצול. באמצעות מגבר מהדק הביציות, שנה את המצב למהדק מתח איטי, והגדר את מתח ההחזקה ל-80 מיליוולטים. הזרם על הצג צריך להיות שלילי, בדרך כלל בין 0 ל 0.4 microamperes.עבור אל קובץ, חדש ולאחר מכן שמור את ההקלטה בתוכנה כדי ליצור קובץ חדש ולשמור את ההקלטה. לחץ על תקליט ואחריו תקליט לדיסק כדי להתחיל את ההקלטה. הוסף מידע רלוונטי לקובץ באמצעות תיבת הדו-שיח 'תרשים סימון'.יש ליישם אגוניסטים לגירוי כימי על ידי פתיחת השסתומים, והכנסתם לתא ההקלטה למשך 15 שניות. לאחר השלמת ההקלטה, כבה את מהדק המתח למצב כבוי, וכבה את שסתום הפתרון של הצלצול. הסר את הביצית, והשלך בהתאם למדיניות המוסדית של דגימות מוח אנושיות, ואז הפסק את ההקלטה ושמור את הקובץ.שמור עותק של ההקלטות בכונן USB. משם, פתח את הקובץ הרצוי לניתוח. כדי למדוד את התגובה המרבית של AMPA, ואת תגובת השיא של GABA A, תחילה, קבע רמה או קו בסיס של 0 על-ידי מציאת הקו האדום, ולאחר מכן גרור אותו לזרם שנוצר על-ידי יישום רינגר או קו הבסיס.לאחר קביעת רמת 0, קבע את מדידות התגובה על-ידי גרירת סמן הקריאה האנכי הירוק לחלק הרצוי של עוקב התרשימים. נרשמו זרמי יונים מהביציות שהוזרקו עם הממברנות מהקולטנים הסינפטיים האנושיים. קולטני AMPA הופעלו עם 100 קאינאט מיקרומולרי, וקולטני GABA A עם GABA מילימולרי אחד.הזרקה משותפת של הממברנות המסוננות מהאיבר החשמלי של טורפדו, עשיר בקולטני אצטילכולין, וקידוד cDNA לקולטן שורת GABA 1 לתוך הקוטב החיה הפיקו בעיקר שתי קבוצות של ביציות, בהתבסס על תגובותיהן. לקבוצה אחת של ביציות היו תגובות גדולות לאצטילכולין, אך לא היו תגובות ל-GABA מיקרומולרי אחד. לביציות בקבוצה אחרת היו תגובות ריקות או נמוכות לאצטילכולין, אך תגובות גדולות ל-GABA.התמונה הגרפית מציגה את שגיאת התקן הממוצע פלוס מינוס של ממוצע זרם השיא בקבוצה אחת ובקבוצה שתיים. לביצית אחת בקבוצה השנייה היו תגובות גדולות של GABA ואצטילכולין, מה שמרמז על קרע בגרעין. כתוצאה מכך, התפלגות התגובות הייתה מוטה לערכים נמוכים, כפי שצוין על ידי ההבדל בין הממוצע לבין החציון של התפלגות זרם הממברנה.אחד הגורמים לביציות בתגובה נמוכה הוא שממברנות מוזרקות, ונלכדות בגרעין הביצית. תגובות GABA וקאיינט של ביציות שהוזרקו לתוך הקטבים של החיה או הצמחייה עם ממברנות לא מסוננות המתקבלות ממוח שאינו AD, ומוח AD מוצגים כאן. ביציות שהוזרקו ליד הקוטב החייתי מבלי להתמקד בגרעין נתנו תגובות גדולות יותר מאשר ביציות שהוזרקו לקוטב הצמחי, ובכך אפשרו לחקור דגימות רקמה עם מספר נמוך מאוד של קולטנים.בעת ניסיון הליך זה, עקוב תמיד אחר רמת הצלצול שלך. זה תמיד במהלך ההקלטות החשובות שייגמרו לך, ואז הוא ישתמש בתוצאה שלך, ובמות של הביצית, ובאובדן של נתונים יקרי ערך מאוד. לאחר הליך זה, אנו יכולים לבצע עומסים מערביים כדי לאמת את נוכחותם של הקולטנים הסינפטיים, או חלבונים בעלי עניין.הוא מאפשר למדוד עירור גלובלי לעכב יחסים סינפטיים באזורי מוח שונים, והפרעות מוחיות שונות, ומאפשר לבצע בדיקה ישירה על ניבוי תיאורטי על הגורמים למחלות.

microtransplantation-synaptic-membranes-to-reactivate-human-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סינפסות Glutamatergic יכול לעבור ממצב פעיל למצב שקט. אנו מראים כי מצב פעילות presynaptic בתרבות ניתק של נוירונים מכרסם הוא מדמיין באמצעות טופס ניתן לתקן של צבע FM1-43 לדמיין סינפסות פעיל immunostaining עם נוגדן vGluT 1-לדמיין כל סינפסות הגלוטמט.

סינפסות שקט Presynaptically למד עם מיקרוסקופ אור

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור חוקרים צורת בגירוי הכימית של wholemount חולדה הרשתיות במבחנה עם גלוטמט עצבי. בגירוי כימי הוא אלטרנטיבה מבטיחה בגירוי חשמלי המקובלת של הנוירונים ברשתית לטיפול עיוורון בלתי הפיך הנגרם על ידי מחלות ניווניות קולט אור.

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.

השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

למד מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות לרישום תגובות קולטנים AMPA ו-GABA בביצי Xenopus laevis. שיטה זו מאפשרת חקר פעילות קולטנים מוחיים טבעיים הקשורים להפרעות נוירודגנרטיביות ונפשיות.

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

גלה סרטונים נוספים