Name: במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למד שיטות לאנקפסולציה של F-actin בליפוזומים ענקיים חד-שכבתיים ליצירת מודל מינימלי של תא. טכניקה זו מאפשרת תפוקה גבוהה ויעילות אנקפסולציה לחלבוני שלד תא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים במימון ARO MURI W911NF-14-1-0403 ל- M.P.M., המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 1R01GM126256 ל- M.P.M., המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, אוניברסיטת מישיגן / Genentech, SUBK00016255 ותוכנית המדע של גבולות האדם (HFSP) מספר מענק RGY0073/2018 ל- M.P.M. כל דעה, ממצא, מסקנות או המלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים/ים ואינן משקפות בהכרח את דעותיהם של ה-ARO, NIH או HFSP. ס.צ. מכיר בדיונים פוריים עם ו' ידב, ג' מורסן וס' אמירי.

1. הכנת מאגרים ותמיסות חלבון
<ol><li>הכן את המאגר הפנימי המיימי למניעת פילמור (INP) בנפח כולל של 5 מ"ל על ידי ערבוב של 0.1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 320 mM סוכרוז ו-0.2 mM ATP.</li>
	<li>הכינו את תערובת החלבונים (PM) על ידי הוספת חלבונים למאגר INP בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם הריכוזים הבאים: 11.2 μM G-אקטין שאינו פלואורסצנטי, 2.8 μM עם תווית פלואורסצנטית של אקטין, ו-0.24 μM Arp2/3 (טבלת חומרים). כדי ליצור שכבת F-actin, הוסיפו 100 ננומטר ג'לסולין, 4 μM קופילין ו-2.2 μM VCA-His ל-PM. כניסוי בקרה, החלף את PM ב-100 מיקרוגרם/מ"ל בצבע פלואורסצנטי (טבלת חומרים).</li>
	<li>הכן את חיץ הפילמור הפנימי (IP) (מימי) בנפח כולל של 5 מ"ל על ידי ערבוב 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ו- 80 mM סוכרוז.</li>
	<li>הכן את המאגר הסופי (FB) על-ידי ערבוב מאגר INP (המכיל PM) ומאגר IP ביחס נפח של 1:1 כדי להפיק את התמיסה המימית הפנימית בנפח כולל של 30 μL שיהיה עטוף בתוך הליפוזום.</li>
	<li>הכן את המאגר החיצוני המיימי (OB) בנפח כולל של 150 μL על ידי ערבוב 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 212 mM גלוקוז, ו 0.1 מ"ג / מ"ל β קזאין. הערה: ניתן לכוונן את האוסמולריות של ה- OB עם גלוקוז כדי להבטיח שהלחץ האוסמוטי של ה- OB יהיה מעט גדול יותר מזה של ה- FB (20-60 mOsm). הצפיפות של FB צריך להיות מעט גבוה יותר מאשר OB.</li>
</ol>2. הכנת ליפוזומים על בסיס טכניקות תחליב הפוך
<ol><li>מכינים את תערובת שמן השומנים<ol><li>יש להוסיף 100 מיקרו-ליטר של 25 מ"ג/מ"ל L-α-פוספטידילכולין (Egg PC שאינו פלואורסצנטי, המכונה גם EPC, כולל 1% DHPE) לתוך בקבוקון זכוכית. מאדים כלורופורם בגז ארגון, ומשאירים שכבת שומנים מוצקה יבשה (2.5 מ"ג) בתחתית הבקבוקון.<ol><li>כדי ליצור שכבת F-actin, יש להוסיף 1,2-דיאולאויל-sn-glycero-3-{[n(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל) חומצה אימינודיאצטית] succinyl} מלח ניקל (DOGS-NTA-Ni) ביחס של 10:1 של EPC ל-DOGS-NTA-Ni ולערבב לפני אידוי הכלורופורם.</li>
		</ol></li>
		<li>הוסיפו 2 מ"ל של שמן מינרלי וסונו את תערובת שמן השומנים בטמפרטורת החדר באמבטיה למשך שעה אחת כדי להשעות מחדש את השומנים. הערה: ניתן לשמור את תערובת השומנים-שמן לאחר סוניקציה למשך שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מומלץ לבצע סוניקציה מחדש לפני השימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו חיץ סופי בתחליב שמן (FB/שמן) להכנת טיפות שומנים חד-שכבתיות המכילות את החלבון המעניין.<ol><li>ל-100 μL של תערובת שמן שומנים שנלקחה בצינור פלסטיק, הוסיפו 10 μL של FB. ודא כי FB הוא בטיפה אחת.</li>
		<li>באמצעות מזרק זכוכית, צייר את תערובת השומנים-שמן-FB ושאף בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לתחליב אותה; ציירו תחילה כמות קטנה של תערובת שומנים-שמן, ולאחר מכן את טיפת ה-FB על ידי הנחת קצה המזרק בשולי הטיפה כדי לפרק אותו לטיפות זעירות. חזור על השאיפה למעלה ולמטה עד שנוצר תחליב לבנבן ועכור.</li>
	</ol></li>
	<li>שים 30 μL של OB בצינור פלסטיק נפרד. מניחים 30 μL של תערובת שמן שומנים על גבי OB ולתת לו לשבת במשך ~ 10 דקות כדי לפתח מונולייר שומנים בממשק. הערה: אם השומנים טעונים או שהחלבון משולב, יש להאריך את משך שלב זה38.</li>
	<li>מכינים את הליפוזומים<ol><li>הוסיפו בזהירות 50 μL של תחליב FB/שמן (שלב 2.2) לשלב השמן העליון של הצינור משלב 2.3.</li>
		<li>צנטריפוגה צינור פלסטיק ב 100 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. זמן משתנה ומהירות צנטריפוגה כדי למטב להיווצרות ליפוזום. הערה: לאחר צנטריפוגה, שלב השמן העליון צריך להיות ברור, וה- OB התחתון (המכיל ליפוזומים) צריך להיות מעונן מעט.</li>
		<li>הסר בזהירות את שלב השמן על ידי פיפטה. שאפו אמצעי אחסון נוסף במידת הצורך. הקפידו לא לשים את קצה הפיפטה בצד הצינור כדי למנוע יצירת מניסקוס של שמן על גבי שלב הליפוזום.</li>
		<li>בעזרת פיפטה חדשה, הדביקו באיטיות את קצה הפיפטה לשלב התחתון שנותר ושאפו את הנפח המיימי לאיסוף ליפוזומים. הערה: עדיף לאבד נפח מאשר לשלב את השמן. הכללת השמן תגרום לקרע בליפוזומים, והרכיבים הפנימיים ישוחררו לתוך המאגר החיצוני. חותכים את קצה הפיפטה כדי להפחית את הגזירה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תצפית מיקרוסקופיה
<ol><li>יוצקים 100 μL של OB לתוך הבאר של תא דגירה (צלחת 4 באר המכילה 12 מ"מ כיסוי עגול). מפקידים בעדינות את הליפוזומים שנאספו (שלב 2.4.4) לתוך OB, ולאחר מכן מניחים כיסוי נוסף על גבי התא. הערה: ה- OB מכיל את ה- β קזאין כדי לעבור את משטח הזכוכית ולמזער את ההדבקה בין הליפוזומים20.</li>
	<li>התבונן בליפוזומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת טבילת שמן פי 63. השתמש בקווי לייזר של 488 ננומטר, 647 ננומטר ו-561 ננומטר כדי לצפות בליפידים המסומנים באופן פלואורסצנטי, בצבע פלואורסצנטי עטוף ובאקטין המסומן פלואורסצנטי, בהתאמה. צלם את המסגרות המעניינות ושמור את התמונות בפורמט TIFF.</li>
	<li>לעבד ולנתח תמונות ב- ImageJ/Fiji39. למשתמשים חדשים של ImageJ/Fiji, מדריך מקוון זמין (ראה טבלת חומרים).<ol><li>פתח את קובץ ה- TIFF באמצעות תוכנת ImageJ / פיג'י.</li>
		<li>עבור אל תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות. התאם את הבהירות והניגודיות של התמונה לקנה המידה הרצוי על-ידי התאמת ההגדרות 'מינימום ומקסימום' והמחוונים 'בהירות' ו'ניגודיות'. </li>
		<li>לחץ על הכלי בחירת מלבן בסרגל הכלים ובחר את אזור העניין (ROI). עבור אל חיתוך > תמונה כדי לחתוך את ההחזר על ההשקעה.</li>
		<li>עבור אל ניתוח קנה מידה > מוגדר. בחלון המוקפץ, הזינו 1.0 בשדה 'יחסי גודל של פיקסלים' והגדירו את μm כיחידת האורך. בשדה 'מרחק בפיקסלים', הזינו את רוחב התמונה בפיקסלים. בשדה 'מרחק ידוע', הזן את רוחב התמונה האמיתי במיקרונים.</li>
		<li>למדידת גודל הליפוזום, בעזרת הכלי בחירה אליפסה בסרגל הכלים, ציירו עיגול לאורך קצה הליפוזום. עבור אל נתח > מידה כדי למדוד את שטח המעגל, שממנו ניתן לחשב את קוטר הליפוזום.</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

מספר שלבים מרכזיים קובעים את ההצלחה של תשואה גבוהה של ליפוזומים במהלך תהליך ההכנה. כדי להמיס לחלוטין את שכבת השומנים בשמן, יש לנתק את הדגימה עד ששכבת השומנים בתחתית בקבוקון הזכוכית תיעלם לחלוטין. לאחר הסוניקציה, יש לאחסן את תערובת שמן השומנים למשך הלילה בטמפרטורת החדר בתנאים חשוכים כדי שמולקולות השומנים יתפזרועוד 29. ניתן לאחסן את התערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. בעת הכנת תחליב FB/שמן עם טיפות שומנים חד-שכבתיות המכילות חלבון מעניין, יש לשאוב בעדינות את תערובת השומנים-שמן-FB הלוך ו...

שלד האקטין ממלא תפקיד בסיסי בבניית הארכיטקטורה התוך-תאית של התא על ידי תיאום התכווצות ברמה המולקולרית ויצירת כוח 1,2,3. כתוצאה מכך, הוא מתווך פעילויות תאיות חיוניות רבות, כולל עיוות תאים4,5, חלוקה6, נדידה 7,8 והידבקות9. שחזור מבחנה של רשתות אקטין זכה לתשומת לב עצומה בשנים האחרונות 10,11,12,13,14,15,16,17. מטרת השיקום היא לבנות מודל מינימלי של התא נטול הרגולציה הביוכימית המורכבת הקיימת בתוך תאים חיים. זה מציע סביבה ניתנת לשליטה כדי לחקור פעילויות תוך תאיות ספציפיות ומקל על זיהוי וניתוח של מרכיבים שונים של שלד אקטין18,19. יתר על כן, המעטפת של רשתות אקטין במבחנה בתוך שלפוחיות חד-עיניות ענקיות פוספוליפידיות (GUVs, ליפוזומים) מספקת מרחב מוגבל אך מעוות עם גבול חדיר למחצה. הוא מחקה את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית והמכנית של מנגנון האקטין בתוך התא 9,20,21,22.
בין שיטות שונות להכנת ליפוזומים, שיטת הידרציה סרט שומנים (הידוע גם בשם שיטת הנפיחות) היא אחת הטכניקות המוקדמות ביותר23. סרט השומנים היבש מתמזג עם תוספת של מאגרים, ויוצר בועות ממברניות שהופכות בסופו של דבר לשלפוחיות24. כדי לייצר שלפוחיות גדולות יותר עם תפוקה גבוהה יותר, שיטה משופרת המתקדמת משיטת הידרציה הסרט, המכונה שיטת האלקטרופורמציה25, מפעילה שדה חשמלי AC כדי לקדם ביעילות את תהליך ההידרציה26. המגבלות העיקריות של שיטות מבוססות הידרציה אלה לכמוסות אקטין הן שיש לו יעילות אנקפסולציה נמוכה של חלבונים מרוכזים מאוד, והוא תואם רק להרכבי שומנים ספציפיים24. לשיטת האמולסיה ההפוכה, לשם השוואה, יש פחות מגבלות על מרכיבי השומנים וריכוזי החלבון20,27,28,29. בשיטה זו, תערובת של חלבונים עבור אנקפסולציה מתווספת למאגר מימי פנימי, אשר מתחלב מאוחר יותר בתמיסת שמן מינרלי המכילה שומנים, ויוצרת טיפות שומנים חד-שכבתיים. טיפות השומנים החד-שכבתיות עוברות דרך ממשק אחר של שומנים/שמן-מים דרך צנטריפוגה ויוצרות שלפוחיות ליפידים דו-שכבתיות (ליפוזומים). טכניקה זו הוכיחה את עצמה כאחת האסטרטגיות המוצלחות ביותר לאנקפסולציהשל אקטין 24,30. בנפרד, ישנן כמה שיטות של התקנים מיקרופלואידיים, כולל סילון פועם31,32, פליטת ממברנה חולפת33, ושיטת cDICE 34. קווי הדמיון בין שיטת התחליב ההפוך לבין השיטה המיקרופלואידית הם ממס השומנים (שמן) המשמש והכנסת ממשק שומנים/שמן-מים ליצירת העלון החיצוני של הליפוזומים. לעומת זאת, יצירת ליפוזומים בשיטה המיקרופלואידית דורשת מערך של התקנים מיקרופלואידיים ומלווה בשמן הכלוא בין שני העלונים של הדו-שכבתי, מה שדורש צעד נוסף להסרת שמן35.
בכתב יד זה, השתמשנו בטכניקת האמולסיה ההפוכה כדי להכין ליפוזומים העוטפים רשת F-אקטין פולימרית כפי שהיה נהוג בעבר22. תערובת החלבונים לאנקפסולציה הוכנסה לראשונה למאגר עם תנאים נון-פולימריזציה כדי לשמור על אקטין בצורתו הגלובולרית (G). התהליך כולו בוצע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע פילמור מוקדם של אקטין, אשר הופעל מאוחר יותר על ידי מתן אפשרות לדגימה להתחמם לטמפרטורת החדר. ברגע שהוא מגיע לטמפרטורת החדר, האקטין מתפלמר לצורתו החוטית (F). ניתן להוסיף מגוון חלבונים קושרי אקטין לתמיסת המאגר המימית הפנימית כדי לחקור את הפונקציונליות והתכונות של חלבונים, ובכך לספק עוד תובנות לגבי האינטראקציה שלו עם רשת האקטין ופני הממברנה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על אנקפסולציה של חלבונים שונים בעלי עניין36 ואובייקטים גדולים (מיקרו-חלקיקים, מיקרו-סווימימרים בעלי הנעה עצמית וכו') הקרובים לגודל הליפוזומים הסופיים 28,37.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} מלח ניקל (DOGS-NTA-Ni)&nbsp;</td><td>אוונטי פולאר ליפידים בע"מ</td><td>231615773</td><td>ניקל ליפיד</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo [2.2.2] אוקטן</td><td>Sigma</td><td>D27802-25G</td><td>DABCO</td></tr><tr><td>Actin חלבון (>99% טהור): שריר שלד ארנב</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AKL99-D</td> חלבון <td>אקטין G-actin לא פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>(רודמין): שריר שלד ארנב</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AR05</td><td>עם תווית פלואורסצנטית אקטין</td></tr><tr><td>אדנוזין 5&prime;-triphosphate דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא</td><td>A2383-10G</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 צבע</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>צבע פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Andor iQ3</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>תוכנת בקרה ורכישה למיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>Arp2/3 קומפלקס חלבונים: Porcine Brain</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>RP01P-A</td><td>Arp 2/3</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>10035048</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Chamlide Chambers (4 בארות לכיסוי עגול 12 מ"מ)</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>תא דגירה</td></tr><tr><td>חלבון קופילין: רקומביננטי אנושי</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>CF01-C</td><td>קופילין</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי (63 פעמים; מטרת טבילה בשמן)</td> <td>Andor Technologies</td><td>LEICA DMi8</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>גלוקוז</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>DOT מדעי&nbsp;</td>חלבון ג'לסולין <td>DSD11000-10</td><td>DTT</td></tr><tr><td>: שלד ציטולוגי רקומביננטי של הומו סאפיינס</td><td>, Inc</td><td>HPG6</td><td>ג'לסולין</td></tr><tr><td>המילטון 1750 מזרק אטום לגז, 500 ומיקרו; L, מחט מלט, 22 גרם, קצה חרוטי 2 אינץ'</td><td>מזרק זכוכית Cole-Parmer</td><td>UX-07940-53</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/tutorials/</td></tr> <tr><td>L-אלפא-פוספטידילכולין</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>97281442</td><td>EPC</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>7786303</td><td>MgCl<תת>2</תת></td></tr><tr><td>מינרלי, BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, שמן קל</td> שמן <td>מינרלי</td><td>סיגמא</td><td>8042475</td></tr><tr><td>N-WASP שבר WWA (aa400&ndash; 501, VCA-His)</td><td></td><td></td><td>VCA-His מטוהר באמצעות פרוטוקול מעבדה. ניתן לספק את הפרוטוקול על פי בקשות סבירות</td></tr><tr><td>אורגון גרין 488 1,2-דיהקסדקנויל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולמין (אורגון ירוק 488 DHPE)</td> <td>תרמו פישר</td><td>O12650</td><td>DHPE</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>7447407</td><td>KCl</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>57-50-1</td><td>סוכרוז</td></tr> <tr><td>ובטא;-קזאין מחלב בקר</td><td>סיגמא</td><td>C6905-250 מ"ג</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

שלד האקטין (actin cytoskleton), המנגנון המכני העיקרי בתא, מתווך מספר רב של פעילויות פיזיות חיוניות, כולל דפורמציה של התא, חלוקה, נדידה והידבקות. עם זאת, חקר הדינמיקה והמבנה של רשת האקטין in vivo מסובך על ידי הרגולציה הביוכימית והגנטית בתוך תאים חיים. כדי לבנות מודל מינימלי נטול ויסות ביוכימי תוך-תאי, אקטין עטוף בתוך שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs, הנקראות גם ליפוזומים). הליפוזומים הביומימטיים הם בגודל של תאים ומאפשרים תובנה כמותית לגבי התכונות המכניות והדינמיות של רשת השלד הציטוסקולרי, מה שפותח נתיב בר קיימא לביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה. כדי ליצור ליפוזומים לאנקפסולציה, נעשה שימוש בשיטת האמולסיה ההפוכה (המכונה גם שיטת העברת האמולסיה), שהיא אחת הטכניקות המוצלחות ביותר לכמוסות תמיסות מורכבות לליפוזומים כדי להכין מערכות שונות המחקות תאים. בשיטה זו, תערובת של חלבונים מעניינים מתווספת למאגר הפנימי, אשר מתחלב מאוחר יותר בתמיסת שמן מינרלי המכילה פוספוליפידים ליצירת טיפות שומנים חד-שכבתיות. הליפוזומים הרצויים מופקים מטיפות ליפידים חד-שכבתיות החוצות ממשק שומנים/שמן-מים. שיטה זו מאפשרת עטיפה של פולימרי אקטין מרוכזים לתוך הליפוזומים עם מרכיבי השומנים הרצויים, ובכך סוללת את הדרך לשחזור במבחנה של רשת ציטוסקלטון ביומימיק.

הכנת ליפוזומים המבוססים על טכניקת האמולסיה ההפוכה מודגמת באופן גרפי וסכמטי באיור 1.
ראשית, הוכנו ליפוזומים ריקים (בקוטר ~5-50 מיקרומטר) שהורכבו מפוספוליפידים (EPC) ושומנים פלואורסצנטיים (DHPE). צבע פלואורסצנטי אדום בוהק נעטף בליפוזומים חשופים כניסוי בקרה. ניתן לקבוע אם מונולייר של שומנים נוצר בהצלחה בפריפריה של הטיפה על-ידי התבוננות בטיפות ליפידים חד-שכבתיות המשלבות צבע פלואורסצנטי בתחליב, כפי שניתן לראות באיור 2A. ניתן לאמת יצירת ליפ...

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

מדד זה בונה מודל מינימלי של התא נטול תקנות ביוכימיות מורכבות. הטכניקה בה נעשה שימוש יכולה לייצר תפוקה גבוהה של ליפוזומים ובעלת נצילות אנקפסולציה גבוהה עבור חלבוני שלד ציטוסקולרי. אמצעי זה יכול להיות מיושם על אנקפסולציה של מגוון חלבונים וחפצים גדולים כגון מיקרו-חלקיקים ומיקרו-שחיינים המכינים את עצמם.אדם נאבק להגדיל את תשואת הליפוזום עבור הניסיונות הראשונים. מומלץ לדון באופן קבוע בחלק של כתב היד לקבלת פרטים נוספים כדי להגדיל את התשואה. כדי להתחיל, הכינו את חיץ אי-הפילמור הפנימי מימי בנפח כולל של חמישה מיליליטר על ידי ערבוב 0.1 מילימולר CACL שניים, 10 מילימולאר HEPES, DTT מילימולרי אחד, 0.5 מילימולאר DAPCO, 320 מילימולאר סוכרוז ו-0.2 מילימולאר ATP.הכינו את תערובת החלבונים על ידי הוספת חלבונים למאגר אי-הפילמור הפנימי בארבע מעלות צלזיוס. כדי ליצור שכבת אקטין, הוסיפו לתערובת החלבון 100 ננומולר גלקלין, ארבעה מיקרומולר קוקלין ו-2.2 מיקרומולר VCA HEZ. כניסוי בקרה, החלף את תערובת החלבון ב-100 מיקרוגרם למיליליטר צבע פלואורסצנטי.הכן את חיץ הפילמור הפנימי מימי בנפח כולל של חמישה מיליליטר על ידי ערבוב 100 מילימולר אשלגן כלורי. ארבעה מילימולרים מגנזיום כלוריד, 10 מילימולר HEPES, DTT מילימולרי אחד, 0.5 מילימולאר DABCO, 10 מילימולאר ATP ו-80 מילימולאר סוכרוז. הכן את החיץ הסופי על ידי ערבוב חיץ אי-פ

in-vitro-reconstitution-actin-cytoskeleton-inside-giant-unilamellar

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מאמר זה מציג בנייה מחדש פשוטה של סיר אחד של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק מופרדות פאזה. ניתן להכליל את השיטה וליישם אותה על אנקפסולציה או כליאה של מגוון רחב של ביומולקולות.

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

למד שיטות לאנקפסולציה של F-actin בליפוזומים ענקיים חד-שכבתיים ליצירת מודל מינימלי של תא. טכניקה זו מאפשרת תפוקה גבוהה ויעילות אנקפסולציה לחלבוני שלד תא.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

גלה סרטונים נוספים