במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

מדד זה בונה מודל מינימלי של התא נטול תקנות ביוכימיות מורכבות. הטכניקה בה נעשה שימוש יכולה לייצר תפוקה גבוהה של ליפוזומים ובעלת נצילות אנקפסולציה גבוהה עבור חלבוני שלד ציטוסקולרי. אמצעי זה יכול להיות מיושם על אנקפסולציה של מגוון חלבונים וחפצים גדולים כגון מיקרו-חלקיקים ומיקרו-שחיינים המכינים את עצמם.

אדם נאבק להגדיל את תשואת הליפוזום עבור הניסיונות הראשונים. מומלץ לדון באופן קבוע בחלק של כתב היד לקבלת פרטים נוספים כדי להגדיל את התשואה. כדי להתחיל, הכינו את חיץ אי-הפילמור הפנימי מימי בנפח כולל של חמישה מיליליטר על ידי ערבוב 0.1 מילימולר CACL שניים, 10 מילימולאר HEPES, DTT מילימולרי אחד, 0.5 מילימולאר DAPCO, 320 מילימולאר סוכרוז ו-0.2 מילימולאר ATP.

הכינו את תערובת החלבונים על ידי הוספת חלבונים למאגר אי-הפילמור הפנימי בארבע מעלות צלזיוס. כדי ליצור שכבת אקטין, הוסיפו לתערובת החלבון 100 ננומולר גלקלין, ארבעה מיקרומולר קוקלין ו-2.2 מיקרומולר VCA HEZ. כניסוי בקרה, החלף את תערובת החלבון ב-100 מיקרוגרם למיליליטר צבע פלואורסצנטי.

הכן את חיץ הפילמור הפנימי מימי בנפח כולל של חמישה מיליליטר על ידי ערבוב 100 מילימולר אשלגן כלורי. ארבעה מילימולרים מגנזיום כלוריד, 10 מילימולר HEPES, DTT מילימולרי אחד, 0.5 מילימולאר DABCO, 10 מילימולאר ATP ו-80 מילימולאר סוכרוז. הכן את החיץ הסופי על ידי ערבוב חיץ אי-פילמור פנימי וחיץ פילמור פנימי ביחס נפח של אחד לאחד, כדי להניב את התמיסה המימית הפנימית בנפח כולל של 30 מיקרוליטרים שיכוסו בתוך הליפוזום.

הכן את החיץ החיצוני מימי בנפח כולל של 150 מיקרוליטר על ידי ערבוב 10 מילימולר HEPES, 50 מילימולר אשלגן כלורי, שני מילימולאר מגנזיום כלוריד, 0.2 מילימולר סידן כלורי, שני מילימולאר ATP, DTT מילימולרי אחד, 0.5 מילימולר DAPCO, 212 מילימולר גלוקוז ו 0.1 מיליגרם למעטפת בטא מיליליטר. כדי להכין את תערובת שמן השומנים, להתחיל על ידי הוספת 100 microliters של 25 מיליגרם למיליליטר EGGPC לתוך בקבוקון זכוכית. מאדים כלורופורם עם גז ארגון ומשאירים שכבת שומנים מוצקה יבשה בתחתית הבקבוקון.

כדי ליצור שכבת אקטין, מוסיפים ליפיד ניקל ביחס של 10 לאחד של EGGPC לליפיד ניקל ומערבבים, לפני אידוי הכלורופורם. מוסיפים שני מיליליטר של שמן מינרלי. מאדים את הכלורופורם ומסננים את תערובת שמן השומנים בטמפרטורת החדר באמבטיה למשך שעה, כדי להשעות את השומנים.

הכינו חיץ אחרון בתחליב שמן להכנת טיפות שומנים חד-שכבתיות המכילות את החלבון המעניין. התחילו בנטילת 100 מיקרוליטרים מתערובת שמן השומנים בצינור פלסטיק והוסיפו 10 מיקרוליטרים של חיץ סופי לתערובת שמן השומנים. ודא שהמאגר הסופי נמצא בטיפה אחת.

באמצעות מזרק זכוכית שואבים תחילה כמות קטנה של תערובת שמן שומנים ולאחר מכן את טיפת החיץ הסופית על ידי הנחת קצה המזרק בשולי הטיפה כדי לפרק אותו לטיפות זעירות. יש לשאוף בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים עד שנוצר תחליב מעונן. שים 30 מיקרוליטר של חיץ חיצוני בצינור פלסטיק נפרד.

הניחו 30 מיקרוליטרים של תערובת שמן השומנים על גבי חיץ חיצוני ותנו לה לשבת כ-10 דקות כדי לפתח מונו-שכבה של שומנים בממשק. כדי להכין ליפוזומים, מוסיפים בזהירות 50 מיקרוליטרים של תחליב שמן המאגר הסופי, לשלב השמן העליון של הצינור. צנטריפוגה צינור פלסטיק ב 100 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

זמן משתנה ומהירות צנטריפוגה, כדי לייעל להיווצרות ליפוזום. הסר בזהירות את שלב השמן על ידי פיפטה לשאוף נפח נוסף במידת הצורך. הקפידו לא לשים את קצה הפיפטה בצד הצינור כדי למנוע יצירת מניסקוס של שמן על גבי שלב הליפוזום.

בעזרת פיפטה חדשה, חותכים את קצה הפיפטה. הדביקו באיטיות את הפיפטה לשלב התחתון שנותר ושאפו את הנפח המיימי לאיסוף ליפוזומים. יוצקים 100 מיקרוליטרים של חיץ חיצוני לתוך הבאר של תא הדגירה.

הפקידו בעדינות את הליפוזומים שנאספו לתוך החיץ החיצוני ולאחר מכן הניחו כיסוי נוסף על גבי התא. התבונן בליפוזומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת טבילה של 63 x שמן. השתמש בקווי לייזר של 488, 647 ו-561 ננומטר.

כדי לבחון שומנים המסומנים באופן פלואורסצנטי, צבע פלואורסצנטי עטוף ואקטין המסומן פלואורסצנטי בהתאמה. צלם את מסגרות העניין ושמור את התמונות בפורמט TIF. לעבד ולנתח תמונות בתמונה J.Start על ידי פתיחת קובץ TIF, באמצעות תוכנת תמונה J.

עברו אל התמונה ולחצו על 'התאם'. לאחר מכן ניגודיות בהירות, התאם את הבהירות והניגודיות של התמונה לקנה המידה הרצוי על ידי התאמת ההגדרות המינימליות והמקסימליות ומחווני הבהירות והניגודיות. לחץ על כלי בחירת המלבן בסרגל הכלים ובחר את אזור העניין.

עבור אל התמונה ולאחר מכן לחץ על חתוך כדי לחתוך את החזר ההשקעה. עבור אל ניתוח ולאחר מכן לחץ על קבע קנה מידה. בחלון המוקפץ, הזן 1.0 בשדה יחסי הגודל של הפיקסלים והגדר מיקרומטר כיחידת האורך.

בשדה 'מרחק בפיקסלים', הזינו את רוחב התמונה בפיקסלים. בשדה המרחק הידוע, הזן את רוחב התמונה האמיתי במיקרונים. כדי למדוד את גודל הליפוזום, בעזרת כלי הבחירה הסגלגל בסרגל הכלים, ציירו עיגול לאורך קצה הליפוזום.

עבור לנתח, ולאחר מכן לחץ על מדוד, כדי למדוד את שטח המעגל, שממנו ניתן לחשב את קוטר הליפוזום. יצירת ליפוזום מוצלחת מאומתת באמצעות הדמיה של הטבעת העגולה הדקה שהיא דו-שכבת השומנים הפלואורסצנטית הירוקה. תחת לייזר של 488 ננומטר המשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאשר אנקפסולציה של הצבע הפלואורסצנטי.

הסביבה הפנימית של הליפוזומים צריכה להיות פלואורסצנטית אחידה תחת לייזר של 647 ננומטר. ניתן היה לדמיין את היווצרות הליפוזומים על ידי הטבעות העגולות הירוקות הדקות. ההשפעה המשוחזרת ברשתות בתוך ליפוזומים היא הטרוגנית, ומתבטאת במבני רשת מסועפים של חוטי אקטין.

ארכיטקטורת הענף הופעלה על ידי הכנסת ARP שני שלושה מורכבים, אשר בו זמנית שולט על נוקלאציה והסתעפות של חוטי אקטין, יחד עם VCA HEZ. שכבת אקטין דקה, אך מסועפת בצפיפות, נוצרת בעלון הפנימי של הדו-שכבה של הליפוזומים, אשר ניתן לדמיין אותה כפלואורסצנטית. תערובת החיץ הסופי של השומנים חייבת להיות נשאבת בדרך כלל קדימה ואחורה דרך מזרק זכוכית, כדי למנוע החדרת בועות אוויר.

התערובת חייבת להיות לבנבן לאחר התהליך. טכניקה זו סללה את הדרך לבניית מודל מינימלי של התא, נטול תקנות ביוכימיות מורכבות. בעזרת מערכת חיקוי תאים זו חוקרים יכולים לחקור את התכונות המכניות והדינמיות של חלבוני ציטוסקלטון, נוקלאטור והמנוע המולקולרי.