הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי

פרוטוקול זה מספק מידע על התקדמות מודל הגידול באופן לא הרסני. הוא גם נותן אינדיקציות לתגובה טיפולית באמצעות משטרי תרופות שלמים בתוך אגרגטים יחידים במקום להסתמך על דגימות התאמת גיל. שיטות קונבנציונליות להשגת צפיפות תאים וכדאיות בתוך אגרגטים דורשות קיבוע וחיתוך של דגימות, בעוד שלנו מספקת נתונים באופן לא הרסני.

לכן, ניתן לעקוב אחר שינויים בתוך צבירה אחת לאורך זמן. טכניקה זו צפויה לשפר את הבנתנו את התגובה לתרופות באזורים דיסקרטיים של מודלים מצטברים, עם השלכות על מידת ההשפעה של מודלים אלה על תגובות in vivo ויישומי סינון תרופות. כדי להתחיל, להכין 70 עד 90% תרביות תאים מפגש של קווי התא הרצויים בתנאים סטנדרטיים.

ניתק את חד-שכבתי התאים מבקבוקי התרבית שלהם בהתאם לשיטת הטריפסיניזציה הסטנדרטית והוסיף את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תרחיף התא להמוציטומטר וספרו באמצעות מיקרוסקופיה כדי לקבוע את מספר התאים בהשעיה. תאי גלולה באמצעות צנטריפוגה ותאי החייאה במדיה בריכוז הרצוי של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר.

עבור מתלים שהוכנו עם מטריצת קרום המרתף, הסירו את בקבוקון המטריצה מאחסון מינוס 20 מעלות צלזיוס והניחו במקרר כדי להפשיר למשך הלילה. מכינים מיכל עם מדיית גדילה ומכניסים למקרר למשך 10 דקות לקירור. שימוש בקצה פיפטה קפוא מוסיפים את המטריצה למדיה מצוננת כך שהריכוז הסופי של תמיסה זו הוא 5%הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיה זו לכל באר של צלחת תחתית עגולה, שאינה דבקה ב-96 בארות, כך שהריכוז הסופי של המטריצה בבארות אלה יהיה 2.5% לאחר הוספת תרחיף התא.

עבור מתלים שהוכנו ללא מטריצה, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיית גדילה רגילה לכל באר. מחלקים 50 מיקרוליטרים של תרחיף תאים לכל באר. צנטריפוגה של הלוחות ב-123 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר מיד לאחר הזריעה כדי להבטיח איסוף של כדור תא בתחתית כל באר.

השתמש במערכת OCT להדמיה מבנית. הגדר את קצב הסריקה של A ל- 5.5 קילוהרץ לאיסוף תמונות ברזולוציה גבוהה. הגדר את מדד השבירה ל- 1.33 עבור דגימות במדיום נוזלי.

בחלון הפרמטרים של התמונה בצד ימין של המסך, הגדר את שדה הראייה על-ידי הזנת ערכי X, Y ו- Z כך שהמדגם יכלול בתוך אזור עניין זה. לחץ על מצב רכישה בתלת-ממד ולאחר מכן לחץ על רשומה כדי לאסוף את סריקת אמצעי האחסון התלת-ממדית של המדגם. כדי ליצור שחזור נפח, פתחו את Imaris ונווטו לקובץ ה-TIF שהומר בתוך הזירה שלהם.

עבור לעריכה ולאחר מכן לחץ על מאפייני תמונה והזן את גודל הווקסל מתמונת OCT לתיבות XYZ המתאימות. לאחר מכן, לחץ על אישור. לחץ על הוסף משטחים חדשים מעל עץ האובייקטים. בתפריט שמתחת לעץ, לחץ על דלג על יצירה אוטומטית וערוך באופן ידני.

בתוך חלון כוונון התצוגה, החליקו ידנית את החצים האדומים והשחורים כדי לשפר את הניגודיות בין הדגימה לרקע ולשפר את ההדמיה לדוגמה. התאם את מיקום הפרוסה לפרוסה בקצה אחד של הדגימה. השתמש במקש הבריחה כדי לשנות את העכבר ממצב הניווט למצב הבחירה ולאחר מכן לחץ על ציור.

עקוב באופן ידני אחר קווי המתאר של האזור המציג את האות. קדם את מיקום הפרוסה על-ידי הזנת המיקום הבא בתיבת הקלט. המיקום הבא צריך להיות פחות או שווה ל-100 פרוסות יותר לתוך המדגם מאשר הקודם.

עקוב באופן ידני אחר האזור המציג את האות. חזור על שלב זה דרך עובי הדגימה עד שיגיע לקצה הנגדי של הדגימה. לאחר מכן לחץ על צור משטח והשאר את התפריט כדי לתפור פרוסות אלה יחד.

לבסוף, לחץ על ערוך ולאחר מכן לחץ על בחירת מסיכה ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להשלים את שחזור אמצעי האחסון. כדי לקבל את צפיפות התא הכוללת של הדגימה, בחר הוסף נקודות חדשות. בתפריט הגדרות האלגוריתם, בטל את הבחירה בכל התיבות.

לחץ על החץ הכחול כדי לעבור למסך ערוץ המקור. מהתפריט הנפתח שמופיע, בחר את הערוץ במסכה. הזן את קוטר התא הממוצע עבור הדגימה בתיבה בקוטר XY.

ודא שחיסור הרקע נבדק. לחץ על החץ הכחול כדי לעבור למסך של נקודת הסיווג. בגרף שבתחתית התפריט, לחץ וגרור את הקצה השמאלי של הסף הצהוב לקצה השמאלי של הגרף כך שכל העצמים ייכללו בסף ההצללה הצהוב.

לאחר מכן לחץ על החץ הירוק כדי להשלים את יצירת הנקודה. השג את מספר האובייקטים שזוהו על ידי לחיצה על סטטיסטיקה. לאחר מכן לחץ על כללי ולבסוף לחץ על המספר הכולל של נקודות.

לחץ על המשטח שנוצר ונווט לכרטיסיית האיכות בסגנון משטחים. שנה את הבחירה ל-Center Point ושנה את רוחב הפיקסלים לפחות משווה ל-20 לקבלת התצוגה הטובה ביותר. נווט אל סטטיסטיקה.

לאחר מכן לחץ על מפורט, ואחריו מיקום והקלט את המיקום במיקום המרכזי. בחר הוסף מסגרת הפניה חדשה מהתפריט שמעל עץ האובייקטים. סמן את התיבות הגלויות והקבועות לצד X, Y בתפריט.

לחץ וגרור את מרכז סמל מסגרת ההפניה כך שהוא יתאים לנקודה המרכזית. בטל את הבחירה בתיבות XY גלויות ותקן ובחר אותן עבור XZ. שוב, לחץ וגרור את מרכז סמל מסגרת ההפניה כך שהוא יתאים לנקודה המרכזית. לבסוף, חזור על כך עבור מישור YZ, לסירוגין בין שלושת המישורים הקבועים הללו עד שמסגרת הייחוס תתיישר באופן מושלם עם הנקודה המרכזית.

לחץ פעמיים על מסגרת ההפניה בעץ האובייקטים ושנה את שמה למרכז או דומה. לחץ על הנקודות שנוצרו ונווט אל סטטיסטיקה. לאחר מכן לחץ על מפורט, ואחריו על מסגרת הפניה למיקום.

לחץ על מסגרת הייחוס של מיקום X עד שהיא תמיין מהערך הגבוה ביותר לערך הנמוך ביותר. רשום את הערך הגבוה ביותר כדי לקבל את רדיוס האגרגטים. בצע חישובים ידניים כדי לקבוע מיקומים נוספים של עניין.

לשם כך, הוסף 100 מיקרומטרים לערך מרכז X ולאחר מכן השתמש בערכי Y ו- Z של נקודת המרכז כדי להגדיר את המיקום הראשון לאורך ציר המרכז. בחר הוסף נקודות חדשות. לאחר מכן בחר דלג על עריכת יצירה אוטומטית באופן ידני.

החזק את לחצן Shift במקלדת ולחץ במקום כלשהו על המסך כדי למקם נקודה חדשה. הזן את ערכי המיקום של XYZ עבור המיקום הראשון שמעניין. לאחר מכן בחר הוסף מסגרת הפניה חדשה ויישר אותה מעל המקום.

הוסף 100 מיקרומטר לכל מיקום X רציף. מקם את מסגרת הייחוס האחרונה במרחק של פחות מ-50 מיקרומטרים מהרדיוס החיצוני של הדגימה. לחץ על הנקודות שנוצרו ונווט אל סטטיסטיקה.

בפינה השמאלית התחתונה של התפריט, לחץ על ייצוא כל הנתונים הסטטיסטיים כדי לקובץ ושמור נתונים בגיליון אלקטרוני. פתח את הגיליון האלקטרוני. נווט אל המרחק מכרטיסיית מסגרת הפניה של המקור.

השתמש בפונקציית mod כדי להקצות באופן מספרי כל מרחק למסגרת הייחוס המתאימה לו. סנן את הערכים בעמודה זו כדי לעבוד עם המרחקים בכל מסגרת הפניה. עבור כל אחת ממסגרות הייחוס, חשב את מספר האובייקטים בטווח של 50 מיקרומטר של המסגרת באמצעות הפונקציה COUNTIF.

הערך המתקבל מתאים למספר התאים בתקע אזורי זה. חלק ערך זה בנפח של תקע 100 מיקרומטר כדי לקבל את צפיפות התא. בדיקת T של התלמיד גילתה צפיפות תאים גבוהה משמעותית בליבת הספרואידים מאשר בשכבות המעבר והחיצוניות עבור מודלים ספרואידיים MDA-MB-231.

התוצאה מצביעה על דחיסה בליבה ספרואידית זו לאחר ארבעה ימים. הן במודלים המצטברים AU565 והן במודלים של MDA-MB-231, נראה כי הוספת המטריצה אינה משפיעה על הנפח או על ספירת התאים, ולכן נראה שיש לה השפעה זניחה על התפשטות התאים. במקום זאת, נראה כי הוספת מטריצה מתפצת מחדש את צפיפות התאים ומקדמת דחיסת ליבה משמעותית ומפחיתה את צפיפות התאים בשכבות החיצוניות.

ממצאים אלה מספקים תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים הפיזיקליים שבאמצעותם המטריצה מאפשרת צבירה של תאים בקווים שונים של תאי סרטן השד. בהסתכלות הבאה על גידולי AU565 ספרואידים שהוכנו עם מטריצה, אגרגטים בוגרים טופלו בטרסטוזומאב וצפיפות התאים האזורית הוערכה באמצעות משטר תרופות של חמישה ימים. התקעים הוצבו כל 100 מיקרומטר לאורך כל עובי האגרגטים.

תנודות קלות בצפיפות התא נצפו לאורך זמן בתוך 500 המיקרומטרים הפנימיים של כל צבירה, מה שמעיד על מוות תאי מינימלי. ההדמיה של מוות תאי כתגובה תרופתית מעידה בעיקר בשכבות החיצוניות של ספרואידים סרטניים עולה בקנה אחד עם בעיות חדירת סמים של טרסטוזומאב. כעת אנו יכולים למדוד באופן לא הרסני את הכדאיות של התאים באגרגטים מבלי להקריב את המבנה.

זה מאפשר הערכה של תגובת תרופות אורכיות באגרגטים של גידולים יחידים כדי לזהות תכונות טמפורליות וחדירה של תרופות אנטי-סרטניות מועמדות.