ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

לכל האורגניזמים יש הפרעה בפרוטאום שלהם, המוערך עד 33% אזורים אלה ניתנים לצפייה על ידי ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום, אך רק בטווח הזמן של אלפיות השנייה. הפרוטוקול שלנו יראה לך כיצד לעשות זאת בהצלחה. זוהי טכניקה אנליטית אוטומטית לחלוטין.

אתה פשוט מגדיר הכל, מתכנת את מדידות הזמן הרצויות, מכה ללכת וללכת משם. טכניקה זו פותחת את ההזדמנות המרגשת של סינון לתרכובות המייצבות אישורים ספציפיים של חלבונים בעלי הפרעה פנימית כגון אלפא-סינוקלאין. כדי להתחיל בהכנת דגימה למיפוי פפטידים, קחו תחילה בקבוקון של מלאי חלבון אלפא-סינוקלאין מאוחסן מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

וברגע שהוא מופשר, סנן באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן מדוד את ספיגת התמיסה ב-218 ננומטר כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות חוק באר-למברט, ולדלל את החלבון עם חיץ שיווי משקל לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים. לאחר מכן, כדי להגדיר את הרובוט autosampler, להוסיף 50 microliters של תמיסת החלבון micromolar חמשת המיקרומולריים לבקבוקון התאוששות כולל, ולמקם את הבקבוקון במצב הדגימה בתא הימני של חילופי מימן /דאוטריום, או HDX, רובוטיקה בקנה אחד עם ספקטרומטר המסה.

לאחר מכן שים בקבוקון אחד של חיץ שיווי משקל ושני בקבוקונים של חיץ שטיפת פפסין למיקומי ריאגנטים אחד, ארבעה וחמישה מהתאים השמאליים ובקבוקון אחד של חיץ מרווה למיקום מגיב אחד בתא הימני HDX וקבע את הטמפרטורה על 20 מעלות צלזיוס באמצעות בקר הטמפרטורה Peltier. לאחר מכן הוסף מספר שווה של בקבוקוני התאוששות כוללים ובקבוקוני התאוששות מרביים באותן עמדות תגובה של התא השמאלי HDX והתא הימני HDX בהתאמה. לאחר מכן, הגדר רשימה לדוגמה עם שיטות LC ו- MS מתאימות בתוכנת התזמון והתחל את לוח הזמנים.

כדי לקבל את מפת הכיסוי הפפטידית הסופית, אצור באופן ידני את המשימות האיזוטופיות בתוכנת ניתוח הנתונים DynamX HDX. לאחר ניקוי מכשיר אב הטיפוס Fast HDX, פתח את ממשק המשתמש הגרפי של תוכנת HDX התואמת כדי לאתחל את המערכת. הזן 20 מעלות צלזיוס ו-0.5 מעלות צלזיוס כתא המדגם וטמפרטורות תא המרווה בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על סט כדי להחיל את הטמפרטורות החדשות.

כדי לנקות ולהכין את המכשיר, הגדירו את צינורות הצנטריפוגה עם מים ברמת LC/MS בכל הכניסות, ולאחר מכן בדקו את המזרקים השמאליים והימניים בלשונית אספקת הצנרת של הטיטרטור והמשיכו ללחוץ על פריים עד שכל בועות האוויר החבויות בצינורות נעלמו. כדי לסמן את כל התיבות עבור מזרקים, תחילה עבור אל הכרטיסייה macros ולחץ על מיקום הבית של מזרקי כיול, ולאחר מכן לחץ תחילה על לולאת טעינת מזרקי שטיפה, ולאחר מכן שטפו את כל אמצעי האחסון של לולאת הערבוב. אם יש בועה כלשהי במזרק חיץ, נתקו את המזרק ונטרלו אותו על ידי פליטה אנכית של הבועה.

לפני שתחזור למצב האפס, החלף את המזרק. להגדרת אב הטיפוס של מכשיר אב הטיפוס Fast HDX לניסויים ב-HDX, הכנס תחילה את צינור כניסת הטיטרציה השמאלי לתוך בקבוקון ההתאוששות הכולל. כדי למנוע אוליגומריזציה וצבירה הנגרמות על ידי טמפרטורה, הניחו את הצינור במקרר שולחני.

לאחר מכן, הוסיפו 50 מיליליטרים של שיווי משקל, תיוג, מרווה ומחיצני שטיפה של פפסין לכניסות החיץ המתאימות בתאים הימניים והשמאליים של המכשיר, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיליליטרים של חיץ שטיפת עמודים לכניסת הכביסה של פפסין. להחדרת קווי שטיפת החלבון והעמודה, בדקו את המזרקים הימניים והשמאליים בכרטיסיית ההספקה של האינסטלציה של טיטרטור ולחצו על פריים פעם אחת. לאחר סימון כל התיבות לאיתור מזרקים כפי שהודגם קודם לכן, עבור לכרטיסיית זרימת המרווה הידנית כדי להזין את ההגדרות הנדרשות.

לניסוי במסלול זמן, השתמש בלחצן הנקודה הסמלית כדי להזין את הזמנים באלפיות השנייה. לאחר מכן הגדר את זמן ההשמנה לשלושה ואת ההמתנה ל- HPLC כדי ללכוד את הזמן בתוספת זמן ריצה בתוספת 1.5 דקות. אם ניסויים ריקים מופעלים בין ריצות לדוגמה, לחץ על התיבה הרצה הריקה לאחר שתוודא ערך בתוכנת הרכישה עבור הריצה הריקה לאחר כל הרצת דגימה.

לאחר שהרשימה לדוגמה מוכנה והערכים המתאימים הודגשו, התחל את הריצה על ידי לחיצה על הפעל ו- Fast HDX בתוכנה. לעיבוד נתונים, פתח את תפריט הקבצים של קובץ הפפטידים שהוקצו באופן ספקטרלי מניסויי מיפוי הפפטידים ולחץ על פתח בתוכנת DynamX, ולאחר מכן יבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת DynamX. לאחר פתיחת תפריט הנתונים, לחץ על קבצי MS.

כדי ליצור מצבים עבור כל מצב חלבון הנחקר, לחץ על מצב חדש. כדי להוסיף כל נקודת זמן של HDX, לחץ על חשיפה חדשה ולאחר מכן לחץ על raw חדש. כדי לייבא קבצים גולמיים, גרור כל קובץ למיקום הנכון ולחץ על אישור בסיום.

לאחר הקצאה אוטומטית של איזוטופים, אצור באופן ידני את ההקצאה האיזוטופית כדי להבטיח איכות נתונים גבוהה. ייצא את נתוני האשכול בקובץ csv עם סדר העמודות כמתואר בכתב היד. פתח את תפריט הנתונים בתוכנת מדידת ההמונים ולחץ על נתוני אשכול ייצוא.

לניתוח נתונים, תחילה טען את הנתונים המקובצים המקובצים המואשלים המיוצאים לתוכנת ניתוח HDX HDfleX. כדי להתאים את נתוני הניסוי עבור כל הניסויים והמצבים, בחר את שיטות תיקון חילופי הגב המתאימות כדי לקבל את קבועי הקצב הנצפים עבור תגובת HDX. לאחר מכן חשבו סף מובהקות גלובלי באמצעות שיטה מועדפת ב-HDfleX ובצעו בדיקות מובהקות היברידית כדי לקבוע את ההבדלים המשמעותיים בין המדינות בהשוואה.

ניסוי המיפוי על אלפא-סינוקלאין יצר מפת כיסוי פפטידית שכיסתה 100% מרצף החלבונים עם יתירות ממוצעת של 3.79. יתר על כן, פרוטוקול זה איפשר יצירת עקומות ספיגת דאוטריום עבור פפטידים שונים של אלפא-סינוקלאין, אשר לאחר מכן באו לידי ביטוי כגרפים מותאמים והחלפה אחורית מתוקנת. ניכר היה שרוב חילופי המימן/דאוטריום באלפא-סינוקלאין נעשו בשנייה אחת.

ההבדל הקונפורמי בין מצבים A ו-B של אלפא-סינוקלאין ניכר גם מספיגת הדאוטריום הגבוהה יותר על ידי מצב B הן ברמת הפפטיד והן ברמת חומצות האמינו. עבור טכניקה כה רגישה, חשוב להשתמש במבחני מובהקות סטטיסטית חזקים בעת השוואת נתונים. כאן, השתמשנו בתוכנה שלנו HDfleX.