Name: צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: חקור את מבני קולטני ספינגוזין 1-פוספט ומסלולי האיתות שלהם באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית וטיהור חלבונים. שיטה זו מסייעת לחוקרים לפתח תרופות מכוונות ל-S1PRs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הנתונים של קומפלקס S1PRs-Gi נקטפו במרכז Cryo-EM במערב סין באוניברסיטת סצ'ואן ובמרכז Cryo-EM באוניברסיטה הדרומית למדע וטכנולוגיה (SUSTech) ועובדו במרכז המחשוב בעל הביצועים הגבוהים Duyu באוניברסיטת סצ'ואן. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32100965 ללוס אנג'לס, 32100988 ל- W.Y., 31972916 ל- Z.S.) וקרן המחקר לפוסט-דוקטורט במשרה מלאה של אוניברסיטת סצ'ואן (2021SCU12003 עד L.C.)

<ol><li>Verstockt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+modulation+and+immune+cell+trafficking+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).</li>
<li>Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+its+receptors%3A+structure%2C+signaling%2C+and+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).</li>
<li>Cartier, A., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate%3A+Lipid+signaling+in+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy.</a> Science. 366 (6463), 5551(2019).</li>
<li>Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+sphingosine-1-phosphate+in+cardiovascular+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology.</a> Pharmacological Research. 156, 104793(2020).</li>
<li>Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptor+nomenclature+review%3A+IUPHAR+Review+8%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).</li>
<li>Bryan, A. M., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 20 (5), 12836(2018).</li>
<li>Pelletier, D., Hafler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fingolimod for multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).</li>
<li>Obinata, H., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and inflammation.</a> International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).</li>
<li>Pyne, N. J., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and cancer.</a> Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).</li>
<li>Abu-Farha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+metabolism+in+COVID-19+virus+infection+and+as+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544(2020).</li>
<li>Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod%3A+lessons+learned+and+new+opportunities+for+treating+Multiple+Sclerosis+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).</li>
<li>Murakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29+regulates+vascular+contraction+via+S1P3+receptor%3A+investigation+based+on+a+new+S1P3+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist.</a> Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siponimod for multiple sclerosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).</li>
<li>Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod%3A+a+review+in+secondary+progressive+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis.</a> CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).</li>
<li>Lamb, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Ozanimod: first approval.</a> Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).</li>
<li>Scott, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod+%28RPC1063%29+is+a+potent+sphingosine-1-phosphate+receptor-1+%28S1P1%29+and+receptor-5+%28S1P5%29+agonist+with+autoimmune+disease-modifying+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).</li>
<li>McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SphK-S1P-SIPR+pathway+as+a+potential+therapeutic+approach+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189(2020).</li>
<li>O'Sullivan, C., Dev, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+S1P1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the S1P1 receptor.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+GPCR-G+protein+complex+in+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).</li>
<li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
<li>Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+G+protein-coupled+receptors%3A+new+opportunities+from+XFELs+and+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM.</a> Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors%3A+structure-+and+function-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7(2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+signaling+complexes+of+lipid+receptors+S1PR1+and+S1PR5+reveal+mechanisms+of+activation+and+drug+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition.</a> Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+sphingosine-1-phosphate+recognition+and+ligand+selectivity+of+S1PR3-Gi+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes.</a> Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+sphingosine-1-phosphate+receptor+1+activation+and+biased+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism.</a> Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).</li>
<li>Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+cAMP+synthesis+by+Gi-coupled+receptors+upon+ablation+of+distinct+Galphai+protein+expression.+Gi+subtype+specificity+of+the+5-HT1A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).</li>
<li>Buccioni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+functional+cAMP+assay+for+studying+G+protein-coupled+receptors%3A+application+to+the+pharmacological+characterization+of+GPR17%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signalling%22%5BJournal%5D)">Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17.</a> Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).</li>
<li>Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase-based+GloSensor+cAMP+assay%3A+Temperature+optimization+and+application+to+cell-based+kinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies.</a> Methods. , (2021).</li>
<li>Audet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+approach+for+precrystallization+screening+in+GPCR+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).</li>
<li>Sgro, G. G., Costa, T. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+preparation+of+membrane+protein+samples+for+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74(2018).</li>
<li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+cryo-electron+microscopy%3A+from+sample+to+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).</li>
<li>Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+pre-processing+and+on-the-fly+analysis+of+data+for+high-resolution%2C+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).</li>
<li>Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+approach+to+single-particle+processing+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline approach to single-particle processing in RELION.</a> Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Brilot, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam-induced+motion+of+vitrified+specimen+on+holey+carbon+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film.</a> Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+selection+of+cryo-EM+particles+in+RELION-1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3.</a> Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+mechanisms+of+lipid+GPCRs+by+lysophosphatidic+acid+and+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate.</a> Nature Communications. 13 (1), 731(2022).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר צינור ראשי לקביעת המבנים של S1PRs על ידי cryo-EM ומדידת עוצמת ההפעלה של S1PRs על ידי בדיקת עיכוב cAMP בתיווך Gi. כמה צעדים חיוניים להצלחת הניסוי.
כדי לטהר את קומפלקס S1PRs-Gi, יש לשים לב יותר לאיכות הנגיף ולבריאותם של תאי sf9 . הביטוי של הקולטן מופחת באופן דרמטי בתאי sf9 עניים. בריאותם של תאי sf9 הוערכה על ידי מדידת הקוטר שלהם. לתא sf9 הבריא יש קוטר של כ-15 מיקרומטר. התפוקה של קומפלקס S1PRs-Gi מושפעת מיחס הנפח של נגיפי הקולטן, Gi ו-Gβγ אשר נ...

ספינגוזין-1-פוספט (S1P), תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, היא מולקולת איתות ליזופוספטידית הנמצאת בכל מקום ומערבת פעילויות ביולוגיות שונות, כולל סחר בלימפוציטים, התפתחות כלי דם, שלמות האנדותל וקצב לב 1,2,3. S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות חמישה תת-סוגים של קולטני S1P (S1PRs 1-5); S1PRs נמצאים במגוון רקמות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב את ייצור cAMP; S1PR2 ו-S1PR3 משולבים עם Gi, Gq ו-G12/13, ואות מתמר S1PR4 ו-S1PR5 דרך Gi ו-G12/136.
איתות S1P-S1PR הוא יעד טיפולי קריטי למחלות מרובות, כולל הפרעות אוטואימוניות7, דלקת8, סרטן9 ואפילו COVID-1910. בשנת 2010, פינגולימוד (FTY720) קיבל רישיון כתרופה ראשונה מסוגה המכוונת נגד S1PRs לטיפול בטרשת נפוצה חוזרת (MS)11. עם זאת, הוא מסוגל להיקשר לכל S1PRs למעט S1PR2, בעוד שקשירה לא ספציפית ל- S1PR3 גורמת לבצקת של קליפת המוח, כיווץ כלי הדם והסימפונות ודליפת אפיתל הריאה12. כאסטרטגיה חלופית להגברת הסלקטיביות הטיפולית, נוצרו ליגנדות ספציפיות לתת-סוג עבור הקולטן. סיפונימוד (BAF312) אושרה בשנת 2019 לטיפול בטרשת נפוצהחוזרת 13; הוא מכוון ביעילות ל-S1PR1 ול-S1PR5, בעוד שאין לו זיקה ל-S1PR3, מה שמפגין פחות תופעות לוואי בקליניקה14. בשנת 2020, מנהל המזון והתרופות האמריקאי אישר אוזנימוד לטיפול בטרשת נפוצה15. דווח כי אוזנימוד מחזיק בסלקטיביות גדולה פי 25 עבור S1PR1 מאשר עבור S1PR516. יש לציין כי בהקשר של מגפת COVID-19 הנוכחית, התגלה כי תרופות אגוניסטיות המכוונות ל- S1PRs עשויות לשמש לטיפול ב- COVID-19 על ידי שימוש בטכניקות טיפול אימונומודולטוריות17. בהשוואה לפינגולימוד, האוזנימוד הראה עליונות בהורדת הסימפטומים בחולי COVID-19 וכעת הוא עובר ניסויים קליניים10. הבנת הבסיס המבני והתפקוד של S1PRs מניחה בסיס משמעותי לפיתוח תרופה המכוונת באופן סלקטיבי ל- S1PRs18.
טכניקות רבות משמשות לחקר המידע המבני של ביו-מקרומולקולות, כולל קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). נכון למרץ 2022, ישנם יותר מ -180,000 מבנים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), ורובם נפתרו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, עם מבנה הרזולוציה הכמעט אטומית הראשונה של TPRV1 (רזולוציה 3.4 Å) שדווחה על ידי ייפאן צ'נג ודיוויד יוליוס בשנת 201319, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הפכה לטכניקה מרכזית עבור מבני חלבונים, והמספר הכולל של מבני EM PDB היה יותר מ -10,000. התחומים פורצי הדרך הקריטיים הם פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות מצלמות לגילוי אלקטרונים ישירים ואלגוריתמים חדשים לעיבוד תמונה. Cryo-EM חוללה מהפכה בביולוגיה של מבנים ובגילוי תרופות מבוססות מבנה בעשורה-20 האחרון. מכיוון שהבנת האופן שבו קומפלקסים מקרומולקולריים ממלאים את תפקידיהם המורכבים בתא החי היא נושא מרכזי במדעי הביולוגיה, לקריו-EM יש פוטנציאל לחשוף קונפורמציות של קומפלקסים מולקולריים דינמיים, במיוחד עבור חלבונים טרנס-ממברניים21. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת-העל הגדולה ביותר של חלבוני טרנס-ממברנה והמטרות של יותר מ-30% מהתרופות המשווקות כיום22. הפיתוח של cryo-EM תרם לפרץ של מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של חלבוני GPCR-G, המאפשרים קביעה מבנית של מטרות 'בלתי פתירות' שעדיין אינן נגישות לניתוח קריסטלוגרפי של קרני רנטגן בתכנון תרופות23. לפיכך, יישום cryo-EM מספק הזדמנות לקבוע את המבנה התלת-ממדי של GPCRs בתנאים כמעט מקומיים ברזולוציה אטומית קרובה לרזולוציה אטומית24. ההתקדמות ב- cryo-EM מאפשרת לדמיין יסודות מכניסטיים של גירוי או עיכוב GPCR, ותועלת נוספת בחשיפת אתרי הקשירה החדשים ליצירת תרופות ממוקדות GPCR25.
בהסתמך על הצעדים האדירים של טכנולוגיית cryo-EM, זיהינו מבנים של מתחמי איתות S1PR1-, S1PR3 ו-S1PR5-Gi מיוסרים לאחרונה26,27. בבני אדם, S1PRs נמצאים ברקמות שונות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב ייצור של 3′,5′-מחזורי של אדנוזין מונופוספט (cAMP). S1PR3 ו-S1PR5 מסוגלים גם לצימוד עם Gi 6,28. מכיוון שהפעלת קולטן מצומד Gi מפחיתה את הייצור של cAMP29, הוכנסה בדיקת cAMP לעיכוב Gi כדי למדוד את השפעות העיכוב של cAMP ללכידת שינויים פונקציונליים26,27. באמצעות גרסה מוטנטית של Photinus pyralis luciferase שבה הוכנס חלבון קושר cAMP, בדיקת cAMP זו מציעה שיטה פשוטה ואמינה לניטור פעילות GPCR באמצעות שינויים בריכוז cAMPתוך תאי 30. זוהי בדיקה תפקודית רגישה ולא רדיואקטיבית וניתן ליישם אותה כדי לנטר את האיתות בזמן אמת במורד הזרם של מגוון רחב של GPCRs למטרות גילוי תרופות31.
כאן, מסופק סיכום של השיטות הקריטיות לפתרון מצבי ההפעלה וזיהוי התרופות של S1PRs, כולל בעיקר מניפולציות cryo-EM ובדיקת cAMP של עיכוב Gi. מאמר זה נועד לספק הדרכה ניסיונית מקיפה לחקירות נוספות של המבנים והתפקודים של GPCRs.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & מיקרו; מסנן M</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול # 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa רכז חתוך</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול # 88533</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>חתול# 43016</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>חתול# 3917</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>חתול# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>אפיראז</td><td>NEB</td><td>חתול# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה של Baculovirus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>להכנת P0 baculovirus</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al., 2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; מוכשר E.coli</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>חתול # EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-לוציפרין-אשלגן מלח</td><td>סיגמא- אולדריץ'</td><td>חתול # 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא- אולדריץ'</td><td>חתול # D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>חתול # S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 תרבית תאים מדיום</td><td>מערכות ביטוי</td><td>חתול#&nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 בינוני</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>שרף דגל</td><td>סיגמא- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>עמודת סינון ג'ל</td><td>GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor ערכת בדיקת cAMP Promega</td><td></td><td>Cat# E1291</td><td>ערכת בדיקת cAMP לעיכוב Gi</td></tr><tr><td>GloSensor פלסמיד פלסמיד</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>חיישן פלסמיד</td></tr><tr><td>גרייס' s בינוני</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Reagent</td><td>Polyplus Transfection</td><td>Cat# 114-15</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>Janamycin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td> <td>(Zheng et al., 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>n/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&גמא; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>להכנת פלסמידים ו-P0 baculovirus</td></tr><tr><td>Q5 ערכת מוטגנזה מכוונת אתר</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>להכנת פלסמידים</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448-RELION-3.1</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>(Zivanov et al., 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs</td><td>cDNA addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>מערכות ביטוי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כולאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>חתול# C1254</td><td></td></tr><tr><td>סינרגיה H1 קורא מיקרו-פלטות</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>דנ"א סינתטי T4L (רצף)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcccatcgacgaag cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcccacccaca aagagcccatcactcaaccctgccaagtga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatagatagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagcccgtgt<br/& gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgccctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcgctcc agcagaagcgctgggacgaggaccga atttggctaaatctcgctggtcaatcagacacc taaccgtgccaagcgtcgtcatcactaccttccg tactggaacttgggaccttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>חתול # 77720</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סולארביו</td><td>חתול# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

ליזופוספוליפידים (LPLs) הם ליפידים ביו-אקטיביים הכוללים ספינגוזין 1-פוספט (S1P), חומצה ליזופוספטידית וכו '. S1P, תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, הוא אחד ה-LPLs המאופיינים בצורה הטובה ביותר המווסת מגוון תגובות פיזיולוגיות תאיות באמצעות מסלולי איתות המתווכים על ידי קולטני ספינגוזין 1-פוספט (S1PRs). זה רמז לכך שמערכת האיתות S1P-S1PRs היא מטרה טיפולית פוטנציאלית יוצאת דופן להפרעות, כולל טרשת נפוצה (MS), הפרעות אוטואימוניות, סרטן, דלקת ואפילו COVID-19. S1PRs, תת-קבוצה קטנה ממשפחת הקולטן המצומד לחלבון G מסוג A (GPCR), מורכבת מחמישה תתי-סוגים: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ו-S1PR5. עם זאת, היעדר מידע מבני מפורט מעכב את גילוי התרופה המכוון ל-S1PRs. כאן, יישמנו את שיטת המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית כדי לפתור את המבנה של קומפלקס S1P-S1PRs, והבהרנו את מנגנון ההפעלה, זיהוי תרופות סלקטיבי וצימוד חלבון G באמצעות מבחנים פונקציונליים מבוססי תאים. קולטני ליזופוספוליפידים אחרים (LPLR) ו- GPCRs יכולים גם הם להיחקר באמצעות אסטרטגיה זו.

לפני הקפאת הדגימה של קומפלקס S1PRs-Gi, יש להפריד את הדגימה המטוהרת על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ולנתח אותה באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל. איור 2 מציג את קומפלקס S1PR3-Gi כדוגמה. חלק השיא של קומפלקס החלבון ההומוגני GPCR-G היה ממוקם בדרך כלל ב~10.5 מ"ל של הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל (איור 2A). ניתוח עמודי SDS של קומפלקס S1PR3-Gi (איור 2B) חושף ארבע רצועות המתאימות לפסים התיאורטיים של S1PR3, Gαi, Gβ ו-scFv16...

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

התייחסנו למצבי הרוח של הפעלה וחישוב מחדש של תרופות של S1PRS על ידי צוות, מניפולציות EM ו- GI inhab state A M P A ובסיס פחות משמעותי לפיתוח תרופה שמכוונת באופן מוצק ל- S1PRS Advancements בכך שמאפשרת להפוך את האנדרדוגיות המגנטיות של גירוי או מגורים של GP ZR ויתרונות נוספים בחשיפת אתרי הקשירה הרגילים ליצירת תרופות ממוקדות T BCR. איכות המדגם היא הבסיס לכל דבר בניסוי EM הנכון. הגורמים החיוניים להכנה פשוטה כוללים מצב מוצר שונים של מכירת קו SF וריכוז N g המדגים את ההליך יהיה חלי וואנג סטודנט לתואר שני מהרמה שלי.עבור טיהור חלבון עומס זה אצבע סצנה קולטני פוספט אחד או S אחד P R S G חלבון מורכב פתרון לכרומטוגרפיה אי הכללת גודל או S E C ג'ל סינון עמודה מראש שיווי משקל עם מאגר S E C בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להשתמש בשברים שנאספו עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו, רכז אותם באמצעות רכז חיתוך של 100 קילודלטון ב-1, 300 XG בארבע מעלות צלזיוס. במהלך עיבוד נתונים לסיווג דו-ממדי בסיווג הראשוני של חלקיקים, בחר את פונקציית הסיווג הדו-ממדית בתוכנת Rely On ולחץ על דפדף מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO.לאחר מכן בחר את החלקיקים.כוכב. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות ל -100 ואת קוטר המסכה A ל -140. באפשרות המחשוב, הגדר את מספר החלקיקים המאוגדים ל-10 והזן את הספריה מכונן מקומי מהיר ומהיר בשדה ספריית ההעתקה לשדה ספריית הגירוד.לעיבוד מהיר יותר, בחר כן להאצת GPU בשימוש. לבחירת תת-ערכה של תוצאות דו-ממדיות טובות כתבניות, עבור אל האפשרות IO של פונקציית בחירת תת-ערכה ולחץ על דפדף מימין למחלקות נבחרות מ- model.star. לאחר מכן, בחר run_it025_model.כוכב כקלט ולחץ על הפעל בחלון הקופץ בדוק מיין תמונות במיון הפוך ומיון לאחור. לאחר מכן לחץ על תצוגה. לאחר בחירת תוצאות דו-ממדיות מייצגות טובות כהפניה להפניה לפונקציית הבחירה האוטומטית, לחץ לחיצה ימנית ובחר שמור מחלקות נבחרות.כדי להשתמש בתבנית עבור הסיבוב השני של בחירה אוטומטית, עבור אל אפשרות IO של פונקציית בחירה אוטומטית. לחץ על דפדף משמאל למיקרוגרפים של קלט לבחירה אוטומטית, ובחר micrographs.star. לאחר מכן לחץ על דפדף מימין להפניות דו-ממדיות ובחר class_averages.star.כמו כן, בחר לא עבור או השתמש leplossian ב של גאוס. לאחר מכן, בצע חילוץ חלקיקים באמצעות סיומת קו תחתון כבל תחתון auto pick.star. בצע סיווג דו-ממדי באמצעות חלקיקים.כוכב, ואחריו בחירת תת-קבוצה באמצעות קו תחתון ריצה זה אפס 20 five_optimizer. כוכב לחילוץ חלקיקים, לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ כוכב המיקרוגרף באפשרות IO, בחר מיקרוגרפים. כוכב ובחר כן עבור או לחלץ מחדש חלקיקים מזוקקים.לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ הכוכבים של החלקיקים המזוקקים, בחר חלקיקים. כוכב ליצירת מודל תלת-ממדי ראשוני ומפת ייחוס, לחץ על עיון במודל הראשוני התלת-ממדי מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO ובחר את החלקיקים הקודמים.star. לאחר מכן באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לאחת ואת קוטר המסכה A ל -140.לסיווג תלת מימדי ויצירת מפה תלת-ממדית ראשונית, לאחר בחירת חלקיקים. כוכב כפי שהודגם קודם לכן, לחץ על דפדף מימין למפת ההפניה ובחר קו תחתון ראשוני דגם נקודה MRC. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לארבע עד שש ואת קוטר המסכה A ל- 140.ליצירת מסיכות, לאחר בחירת מפה תלת-ממדית טובה כקלט באפשרות IO, הגדר את סף הבינאריזציה הראשוני ל- 0.05, ואת המפה הבינארית הרחבה לפיקסלים רבים אלה לשלושה. לאחר מכן, עבור אל אפשרות המסכה והגדר. הוסף קצה רך לפיקסלים רבים אלה לשמונה.לעיבוד הבא, פתח את תוכנת Trino Spark, צור סביבת עבודה חדשה ולחץ על בונה המשרות עבור העבודה הראשונה. לייבוא ערימת החלקיקים, הזינו את נתיב החלקיקים בשדה מטא-נתיב החלקיקים ואת נתיב הסרטים בשדה נתיב נתוני החלקיקים. לאחר מכן, יבא אמצעי אחסון תלת-ממדיים על-ידי הזנת הנתיב של אמצעי האחסון התלת-ממדי הטוב ביותר שנוצר בעבר בנתיב נתוני אמצעי האחסון, ובחירת מסיכה עבור סוג אמצעי האחסון המיובא.עבור עידון לא אחיד, גרור את חלקיקי הקו התחתון המיובאים שנוצרו קודם לכן כקלט של חלקיקי חידודים לא אחידים. נפח קו תחתון מיובא, קו תחתון אחד כקלט של נפח נפח חידודים לא אחידים ומסיכת קו תחתון מיובאת מדגישים אחד כקלט של מסיכת חידודים לא אחידה. מסכה. לאחר מכן, לחץ על Q כדי להתחיל בעיבוד ולחזור על ההליך כדי לקבל רזולוציה טובה.S1PRGI 3D מפה. לאחר בניית פלסמיד והכנה להעברה חולפת, הוסף שני מיקרוגרם של דנ"א מוכן לתוך 200 מיקרוליטרים של מאגר מגיב טרנספקציה. מערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות ומסובבים את התערובת לזמן קצר לפני השימוש.הוסף ארבעה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה וערבב אותו על ידי מערבולת וסיבוב כפי שהוכח קודם לכן. לאחר דגירה של הצינור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, יש לזרוק באיטיות 200 מיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה לתוך כל באר של צלחת שש בארות המכילה CHOK תא אחד ולנער בעדינות את הצלחת או ערבוב יסודי. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה, החלף את מדיום הטרנספקציה במדיום צמיחת התאים המורכב מ- F 12 בינוני ו- 10% fbs לפני החזרת הצלחת לאינקובטור.24 עד 48 שעות לאחר קצירת התאים, להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של חיץ SA עם מלח אשלגן לוציפריאן D. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, הוסף 90 מיקרוליטרים של מתלה התא לכל באר של צלחת 96 באר מעורבב בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לקביעת אות פלואורסצנטי, ראשית, הכינו תמיסות מלאי של 10 מילימולאר של סיפונימוד ב- D M S O.ואז בצעו דילול סדרתי במאגר H B S S המכיל 25 מיקרומולר פורסקלין ועוררו את התאים עם 10 מיקרוליטרים של ריכוזים שונים של תמיסה אגוניסטית זו למשך 30 דקות.לאחר מכן, לספור את אות luminescence בקורא microplate על ידי בחירת luminescence עבור שיטת זיהוי. נקודת קצה עבור סוג קריאה, וסיבי זוהר עבור סוג אופטיקה בתוכנה המשויכת. כמו כן, הגדר את רווח האופטיקה ל -255.לאחר מכן ייבא את ערכי האות הפלואורסצנטי המתקבלים לתוכנית גיליון אלקטרוני, ועבד את הנתונים באמצעות פונקציית התגובה של עקומת הרגרסיה הלא ליניארית המתאימה למנה. קומפלקס S1PRS GI יכול להיות מטוהר בהצלחה על ידי כרומטוגרפיה אי הכללת גודל, אשר אומת על ידי דף SDS. יתר על כן, פרוטוקול מיקרוסקופיית האלקטרונים שנערך במחקר זה היה יעיל בהבחנה בין חלקיקי S1PRSGI עם מחלקות דו-ממדיות ברורות ומוגדרות היטב וחלקיקים באיכות ירודה.יתר על כן, מפת מיקרוסקופיית אלקטרונים של S1PR3 GI עם רזולוציה טובה יכולה להיווצר על ידי קורלציה פרוותית יותר באמצעות עידון לא אחיד. לאחר ניתוח מבני, בדיקות פונקציונליות עבור S One P R שלוש נעשו על ידי טרנספקציה של C H O K תא אחד עם קולטן ופלסמידים חיישן, אשר גילה כי פלסמיד קולטן חיישן יחס פלסמיד של אחד לשלושה מייצר תוצאות אופטימליות. עם זאת, התוצאות היו פחות מציאותיות ב- heck 2 93 תאים בעיבוד זה, בחירת האלגוריתמים בסעיף החלקיקים והקטע של סיווג דו-ממדי ותלת-ממדי חשובה לפתרון קומפלקסי החלבון MPS G במיוחד עבור מידול הדליפות וה- ecfs.

a-pipeline-to-investigate-structures-signaling-pathways-sphingosine-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.

הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

אנו מציגים שיטה חסכונית להערכת חדירות הממברנה הליפוזומלית עם רגישות ורזולוציה עדיפות על פני טכניקות קונבנציונליות. באמצעות תגובת החלפת ליגנד מכוסה חדשה, טכניקה זו מזהה שינויים המושרים על ידי פוספוליפאזA 2 בממברנות המודל. גישה נגישה זו, המשולבת בקלות עם ניתוחים סטנדרטיים, משפרת את הרזולוציה לחקר ביופיזיקה של ממברנות ואינטראקציות רעלים.

בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA2

אנו מציגים קווים מנחים לפיתוח 'מתמרים כימיים' סינתטיים שיכולים לגרום לתקשורת בין חלבונים שאינם קשורים באופן טבעי. בנוסף, מוצגים פרוטוקולים מפורטים לסינתזה ובדיקה של 'מתמר' ספציפי המאפשר לגורם גדילה להפעיל אנזים מנקה רעלים וכתוצאה מכך, לווסת את המחשוף של פרו-תרופה אנטי-סרטנית.

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

חקור את מבני קולטני ספינגוזין 1-פוספט ומסלולי האיתות שלהם באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית וטיהור חלבונים. שיטה זו מסייעת לחוקרים לפתח תרופות מכוונות ל-S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

גלה סרטונים נוספים