מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבחון כיצד C-elgans מגיבים לאגוניסט קולטן אצטילכולין Levamisole. שינוי ברגישות הלבאמיזול יכול להצביע על פגמים באיתות בצומת העצבי-שרירי או בתפקוד השרירים שלהם. יתרון גדול הוא שהשחייה הנמרצת של C-elgans בתמיסת Levamisole מאפשרת לחוקרים לבצע שיתוק כמותי של מאות תולעים תלויות זמן בשעה אחת בלבד.

ספירת מספר התולעים בכל באר כל חמש דקות יכולה להיות מכריעה. מספר הבארות שנבדקו, או נקודות זמן ניתן להתאים במידת הצורך. כדי להתחיל להכין מדיה צמיחה נמטודה על ידי שילוב של שלושה גרם של נתרן כלורי, 2.5 גרם של טון פפ, ו 17 גרם של אגר עם ליטר אחד של מים deionized בבקבוק עם בר לערבב.

לאחר autoclaving, לשים את התקשורת על צלחת חמה להגדיר 70 מעלות צלזיוס ומערבבים במהירות מתונה במשך שעה אחת. הוסיפו מיליליטר אחד של חמישה מיליגרם למיליליטר כולסטרול טיפה כדי למנוע משקעים. מיליליטר אחד של סידן כלורי טוחן אחד, מיליליטר אחד של מגנזיום סולפט טוחן אחד, ו-25 מיליליטר של חיץ אשלגן פוספט טוחן אחד pH 6.0 לתקשורת.

מעבירים שני מיליליטר של מדיית גידול נמטודה לכל באר של צלחת באר 24 עם פיפטה סרולוגית סטרילית. הניח לצלחות להתייבש על הספסל במשך יומיים לפני ישיבה עם חיידקים. בחרו מושבה אחת של אופ 50 למרק B והניחו את רעידת התרבות ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה.

באמצעות פיפטה סטרילית, השליכו 30 מיקרוליטרים של תרחיף OP50 על האגר באמצע כל באר. תנו לצלחות לשבת בטמפרטורת החדר לפחות יומיים לאחר הישיבה כדי לאפשר למדשאה חיידקית להיווצר. לגדל פרא מסוג unc-63 Lev10 ו- unc-49 C-elgan לבגרות על צלחות של שישה סנטימטרים, ולהכין לפחות שמונה צלחות לכל זן.

הכן תמיסת הלבנה מתחת למכסה המנוע ביום הסנכרון. מערבבים 10 מיליליטר של אקונומיקה, 2.5 מיליליטר של נתרן הידרוקסידי, ו-37.5 מיליליטר של מים שעברו דה-יוניזציה בצינור כרוניקה של 50 מיליליטר. באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק לשטוף תולעים בוגרות גרביט מארבע צלחות לפחות עם חיץ M9 ולהעביר אותם לתוך צינור כרוניקה של 15 מיליליטר.

סובבו את ה-716 G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסירו את ה-super natant באמצעות פיפטה להעברה. מוסיפים 10 מיליליטר של תמיסת הלבנה. יש לנער בעדינות את השפופרת במשך ארבע דקות עד שרוב, אך לא כל פגרי התולעים התמוססו.

סובב ב 716 גרם במשך דקה אחת. יוצקים את תמיסת האקונומיקה בתנועה אחת. כל עוד הצינור אינו מזועזע בשלב זה הביצים יידבקו לצד הצינור ב -15 מיליליטר של חיץ M9 והפוך.

סובבו ב-716 G למשך דקה אחת ושפכו את מאגר M9 בתנועה חלקה אחת. חזור על כביסה זו עם תמיסת חיץ שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 10 מיליליטר של M9 טרי והניחו על סיבוב למשך הלילה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס כדי לבודד אוכלוסייה מסונכרנת של חיות שלב הזחל הראשון המורעבות.

הדפס ל-24 לוחות באר והקצה זנים למקומות אקראיים. כ-24 שעות לאחר הכנת האקונומיקה, יש לסובב את תולעי L1 המורעבות שבקעו בעוצמה של 716 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסר כתשעה מיליליטר של חיץ M9 עם פיפטה להעברת פלסטיק, ולאחר מכן ערבב בעדינות את תולעי שלב הזחל הראשון המורעבות במאגר M9 הנותר.

מיד פיפטה שלושה מיקרוליטרים של התולעים ומאגר M9 על מיקרוסקופ להחליק ולקבוע את מספר L1 של. המספר הרצוי הוא 20 עד 30 L1 בשלושה מיקרוליטרים. מכניסים שלושה מיקרוליטרים של L1 לכל באר על פי מפת הלוחות המוכנה מראש, נותנים לתולעים לגדול לבגרות במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

הדפס את גיליון הנתונים הריק שישמש לתיעוד מספר התולעים הנעות בכל באר כל חמש דקות למשך שעה אחת. בדוק את התולעים ב 24 צלחות הבאר. באמצעות טוש, לעשות X על מכסה הצלחת מעל כל בארות שיש להם זיהום, יש רעב, או יש יותר מדי תולעים, אשר יקשה על הספירה.

צור תמיסת Levamisole של 0.4 מילימולר על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מלאי לבאמיזול של 100 מילימולר ל-50 מיליליטר של M9. הפעל טיימר ולאחר מכן באמצעות פיפטה העברה להוסיף מיליליטר אחד של 0.4 מילימולר של levamisole לשתי הבארות הראשונות, כך בעלי החיים שוחים בחופשיות. ממשיכים להוסיף את Levamisole לבארות הסמוכות, תוך שהם מקצרים את הזמן בהתאם למספר הבארות שיש לבחון. לאחר חמש דקות, התחל לספור ידנית רק את מספר התולעים הנעות בכל באר, החל מהבאר הראשונה, ורשום מספר זה בגיליון הנתונים.

המשיכו לספור את מספר התולעים הנעות בכל באר כל חמש דקות למשך שעה. בסוף הבדיקה או כאשר הזמן מאפשר, לרשום את המספר הכולל של תולעים בכל באר. השג את הצלחת, מפה ורשום איזה זן מתאים לכל באר.

הזן את הנתונים בגיליון אלקטרוני החל מהמספר הכולל של התולעים בכל באר, וארגון לפי גנוטיפ. שילוב נתונים מהבארות, קובע את מספר התולעים הנעות בכל נקודת זמן. השתמש באפשרות זו כדי לחשב את המספר המשתק בכל נקודת זמן.

צור טבלת נתונים כך שהעמודה השמאלית תציין זמן, והעמודות הבאות יכילו את הנתונים עבור כל זן. עבור כל חיה המשותקת בחמש הדקות הראשונות, צור שורה והזן אחת למשך חמש דקות. חזור על פעולה זו עבור כל נקודת זמן.

עבור כל בעלי החיים שאינם משותקים עד סוף הבדיקה, הזן אפס במשך 60 דקות. השתמש בנתונים אלה כדי ליצור עקומת הישרדות בתוכנה הסטטיסטית הספציפית המשמשת כאן כדי להציג באופן חזותי את השיתוק תלוי הזמן של האוכלוסייה. יש להזין את הנתונים עבור כל הזנים שנבדקו באותה טבלת נתונים, ולהשאיר רווחים לפי הצורך.

מוטציות בתת-יחידות של קולטן האצטילכולין Levamisol, כמו גם בגנים הדרושים להתקבצות של קולטני אצטילכולין רגישים לבאמיזול פוסט-סינפטיים, גורמות להתנגדות לשיתוק המושרה של Levamisole כפי שנצפה במוטציות unc-63 ו- Lev-10 בהתאמה. אובדן תעלת היונים המגודרת GABA unc-49 גרם לרגישות יתר של Levamisole עקב הפרעה באיזון הנכון של איתות כולינרגי ו- GABAergic. הכנה נכונה של 24 צלחות באר היא חיונית.

אם מדשאות חיידקים אינן יבשות לפני שהן מבחינות בתמיסת L1, תמיסת הלבאמיזול עלולה להיות עכורה במהלך הבדיקה, מה שמעכב את התצפית. על ידי שינוי 24 לוחות הבאר, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם RNAi הפיל בעלי חיים. זה מאפשר לחוקרים לחקור את הגנים של C-elgan, אשר מוטנטים אינם זמינים.