הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים
11 במאי 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.
המודל שלנו רלוונטי מאוד למחלות דה-מיאלינציה, במיוחד טרשת נפוצה. וזה יכול לתרום לקידום המחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. זהו פרוטוקול מפורט שעלול לגרום באופן ישיר לדה-מיאלינציה חמורה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי.
כשאתם מנסים את הטכניקה הזו בפעם הראשונה, היו סבלניים וודאו שהקואורדינטות מדויקות. התחל על ידי חיבור מחט 32 מד מזרק 5 microliter. למשוך 5 microliters של פתרון LPC להכנת ההזרקה.
לאחר מכן, לאשר את עומק ההרדמה של העכבר על ידי חוסר רפלקס צביטה הבוהן בעוד הנשימה חלקה. מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית כשהצד הגבי כלפי מעלה, והדק את הראש באמצעות חרוט אף ומהדק שיניים. תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם פסי אוזניים דו-צדדיים.
ודאו שפסי האוזניים ישרים והראש אופקי ויציב. לחטא את עור הראש על ידי ניגוב עם יודופור. לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתך קטן לכ -1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
נגבו את המיומנות עם צמר גפן טבול ב-1% מי חמצן עד שהברגמה, הלמבדה והפונטנל האחורי ייחשפו. מניחים את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי. ודא את המיקום האופקי של ראש החיה, ולאתר את קורפוס callosum.
לאחר קביעת אתר ההזרקה, להקליט את הקואורדינטות, ולעשות סימן עם סמן על הגולגולת. קדח בעדינות את האתר המסומן עם מקדחת גולגולת. היזהר כדי למנוע כל דימום.
הזיזו באיטיות את המחט לקואורדינטות הנתונות. כדי לגרום לדה-מיאלינציה של קורפוס קלוסום, הזריקו 2 מיקרוליטרים של תמיסת LPC בכל אתר הזרקה בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, לשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.
לבסוף, לתפור את העור עם תפר 4-0, ולחכות החיה להתעורר בתוך 10 דקות. התמונה המייצגת מראה את זיהוי לגיונות החומר הלבן באמצעות צביעה כחולה מהירה של לוקסול. מן התוצאות, demyelination יציב של קורפוס callosum ניתן לראות ב 10 ו 28 ימים לאחר ההזרקה.
הכימות של אזור הדה-מיאלינציה בנקודות זמן שונות מוצג כאן. באמצעות הכתמה אימונופלואורסצנטית של חלבון בסיסי מיאלין פגום, נצפתה עלייה יוצאת דופן של dMBP בקבוצה המוזרקת LPC ב-10 ימים לאחר ההזרקה, מה שמייצג אובדן מיאלין בקורפוס קלוסום. ניתוח כתמים מערביים של חלבון המיאלין הבסיסי, או MBP, ביטוי הראה אובדן משמעותי של MBP לאחר הזרקת LPC.
בטא-אקטין שימש כבקרת הטעינה למדידת הביטוי הבסיסי. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשרות את המבנה האולטרה-מיאלי בקורפוס קלוסום של קבוצת שאם וקבוצה מוזרקת LPC. GST-pi הוא הסמן של תא מבשר אוליגודנדרוציטים, או OPC, הבשלת התמיינות .
לאחר 10 ימים של הזרקת LPC, ה-GST-pi ירד בהשוואה לקבוצת ה-sham. יחד עם זאת, יכולת ההתרבות של אוליגודנדרוציטים יכולה לבוא לידי ביטוי על ידי היחס בין התפשטות האוליגודנדרוציטים לבין סך תאי השושלת של אוליגודנדרוציטים. היחס הגבוה יותר מייצג התפשטות רבה יותר של אוליגודנדרוציטים לאחר 10 ימים לאחר ההזרקה.
התמונות המייצגות מציגות את מסלול השחייה של העכברים בכל קבוצה, בנוכחות הפלטפורמה ולאחר הסרת הפלטפורמה. התוצאות מצביעות על כך שהזיכרון המרחבי של עכברים שעברו דה-מיאלינט נפגע באופן משמעותי במודל הזרקת LPC בעל שתי הנקודות. בעת ניסיון הליך זה, ודא כי קצב ההזרקה הוא מדויק, ולשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט הזרקה בשתי נקודות של lysophosphatidylcholine (LPC) באמצעות מסגרת סטריאוטקסית ליצירת מודל דמילינציה יציב בעכברים. הוא מספק שיטה רלוונטית לחקר מחלות דמילינציה, ובמיוחד טרשת נגעיים, ובכך מאפשר מחקר של המנגנונים וההשלכות של דמילינציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח (Neuroscience)
- מחקר דמילינציה (Demyelination)
- מודלים של מחלות בעכברים
רקע
- הבנת תהליך הדמיאלניזציה חיונית לפיתוח טיפולים למחלות כמו טרשת נגועה.
- הפרוצדורה המתוארת נועדה להשראת דמיאלניזציה מהירה וניתנת לשחזור בתנאי מעבדה.
- טכניקה כירורגית מדויקת חשובה להצלחת הפרוצדורה.
- ניתוחים היסטולוגיים, כגון צביעת Luxol fast blue, משמשים להערכת המודל.
מטרת המחקר
- כדי לבסס מודל מהימן לחקר מנגנוני הדמיאלינציה.
- כדי להקל על מחקר של התערבויות טיפוליות פוטנציאליות למצבים הקשורים לדמיאלינציה.
- כדי לספק פרוטוקולים כירורגיים מפורטים המניבים תוצאות כמותיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המודל כולל גישה כירורגית סטריאוטקסיים להזרקות של LPC.
- עכברים מקבלים הזרקה של תמיסת LPC במיקומים אנטומיים מדויקים, תוך התמקדות ספציפית ב-corpus callosum.
- כל הזרקה כוללת 2 µL של LPC המועברים בקצב מבוקר.
- הערכות לאחר הניתוח ביומיים 10 ו-28 מספקות מדדי תוצאה מרכזיים.
- טכניקות היסטולוגיות כגון אימונופלורסנציה ו-Western blotting משמשות לניתוח אובדן המיאלין.
תוצאות עיקריות
- הושגה דמילינציה יציבה ב-corpus callosum, אשר נצפתה באמצעות צביעה היסטולוגית בנקודות זמן מרובות.
- עלייה במסמנים המעידים על אובדן מיאלין אוששה באמצעות ניתוחים שונים.
- הערכות התנהגותיות הצביעו על פגיעות משמעותיות בזיכרון מרחבי בעקבות הדמילינציה.
- התוצאות מרמזות על שינויים בשגשוג ובבידול של אוליגודנדרוציטים בתגובה לטיפול ב-LPC.
מסקנות
- מחקר זה ביסס בהצלחה מודל לבחינת הדינמיקה של דמיאלינציה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
- הממצאים מספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים העומדים בבסיס הדמיאלינציה ותפקידם של האוליגודנדרוციטים.
- מודל זה עשוי לקדם את ההבנה של טרשת נהירים ומצבים דומים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל הזרקת ה-LPC הדו-נקודתי, שהתבסס באופן יציב, מאפשר השראה מהירה וניתנת לשחזור של דמיאלינציה מוקדית בעכברים, ובכך תומך ישירות במחקר בשלבי הגילוי של מחלות דמיאלינציה, כגון טרשת נגועים. מודל זה מספק פלטפורמה חסונה להורדת סיכונים מכניסטיים, תיקוף מטרות והערכה כמותית של אובדן ותיקון המיאלין. יכולת השחזור שלו ותוצריו הכמותיים ממינnextNode אותו ככלי קריטי להערכה פרה-קלינית ולסינון תיקי פיתוח (portfolio triage) של תרופות למחלות נוירו-דלקתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני דמיאלינציה ומעורבות של מסלולים במערכות רלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות של אובדן מיאלין ותגובות של אוליגודנדרוციטים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבדיקת היפותזות טיפוליות למצבים של דלקת נוירולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת in vivo מתוקפת לסריקת תרכובות בשלבים מאוחרים המכוונות למיאלינציה מחדש או לנוירופרוטקציה.
- מייצר דמיאלינציה סטנדרטית הניתנת לשחזור, המתאימה לבדיקות היסטולוגיות והתנהגותיות כמותיות.
- מאפשר הערכה מהימנה של התערבויות מועמדות עם נקודות סיום מדידות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם פתולוגיה רלוונטית למחלה הנצפית בטרשת נמнестиה, ובכך תומך בפיתוח של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- מבטיח רציפות מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות טיפוליות.
- מפחית סיכון ביולוגי באמצעות מידול של דמילינציה חריפה וליקוי תפקודי in vivo.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מודל זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי במחלות דמיליניזציה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות ניתוח כמותי של דמילינציה ותאי אוליגודנדרוציטים.
- סריקה: מספק פלטים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות ומחקרי תגובה למינון.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של אובדן מילין, ביטוי חלבונים וליקויים התנהגותיים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ממדל נקודות סיום רלוונטיות למחלה לצורך התאמה של סמנים ביולוגיים ותיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת in vivo סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות מחקר מרובות בתחום הדלקות העצביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של דמיאלינציה.
- ערך תפעולי: מספק מידול in vivo סטנדרטי, הניתן לשחזור ובעל יכולת הרחבה לשימוש חוצה-תוכניות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות והקדמה של נכסי מחלות נוירו-דלקתיות בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקסי ובדיוק במיקוד אנטומי בעכברים.
- מחייב גישה לתשתיות של אנליזה היסטולוגית, אימונופלורסצנטית וניתוח התנהגותי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קואורדינטות ההזרקה וקצב ההזרקה לצורך הדירות (reproducibility).
- התאמה לאזורי מערכת העצבים המרכזית (CNS) אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- המודל משקף בעיקר דמיאלינציה חריפה; מחקרי דמיאלינציה כרונית או רמיאלינציה עשויים להזדקק לתיקוף נוסף.
