Name: הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: למדו את פרוטוקול ההזרקה הדו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין בעכברים ליצירת מודל יציב של דה-מילינציה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני מחלות מיאלין כמו טרשת נפוצה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים: 82071380, 81873743).

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונג'י, אוניברסיטת הואז'ונג למדע וטכנולוגיה, סין. בוגרים C57BL/6 זכרים ונקבות עכברים (סוג בר, WT; 20-25 גרם; 8-10 שבועות) שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). עכברים שוכנו במתקן מסוים לבעלי חיים ללא פתוגנים (SPF) עם מים ומזון שסופקו עד ליביטום. הם נשמרו בתקופה מתחלפת של 12 שעות של מחזור אור וחושך בתנאים הסטנדרטיים של טמפרטורת 22 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 55%-60%.
1. הכנת תמיסת LPC
<ol><li>ממיסים 25 מ"ג אבקת LPC (ראו טבלת חומרים) בתמיסה מעורבת של 250 μL של כלורופורם ומתנול (1:1) כדי ליצור תמיסת LPC של 10% ולהעביר אותה לצינור צנטריפוגה של 500 μL. הערה: אם ה- LPC אינו מומס לחלוטין, מקם את שפופרת הצנטריפוגה בחומר ניקוי קולי ואולטרה-סוניקט ב- 40 קילוהרץ במשך כשעה אחת כדי לקבל פתרון אחיד.</li>
	<li>חלקו את התמיסה ל-3 μL/tube ואחסנו ב-−80°C. הערה: ניתן לאחסן את הפתרון למשך כשנתיים.</li>
	<li>לפני הניתוח, דיללו את התמיסה (שלב 1.2)ב-27 μL של תמיסת NaCl של 0.9%, ושמרו על התמיסה באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: הכן את הפתרון רגע לפני תחילת ההזרקה.</li>
</ol>2. הכנה כירורגית
<ol><li>השתמש במחט של 32 G, 2 כדי להתחבר למזרק של 5 μL (ראה טבלת חומרים). ודא שהמזרק המיקרוליטר אינו מופרע. למשוך 5 μL של תמיסת LPC להכנת ההזרקה.</li>
	<li>הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה המחובר לאידוי איזופלורן עם 3% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן בקצב של כ-0.3 ליטר לדקה.</li>
	<li>אשרו את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן בזמן שהנשימה חלקה.</li>
	<li>לגלח את ראש העכבר בין האוזניים באמצעות מכונת גילוח חשמלית. יש למרוח טיפות עיניים משמן כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך.</li>
	<li>לאחר מכן, מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) עם הצד הגבי למעלה, והאבטח את הראש באמצעות חרוט אף ומהדק שיניים. לשמור על הרדמה עם 1.2%-1.6% איזופלורן דרך האף. הערה: ניתן להתאים את ריכוז האיזופלוראן בהתאם למצב הנשימה של העכברים.</li>
</ol>3. הליך כירורגי
הערה: בעלי חיים מונחים על כרית חימום במהלך כל ההליכים.
<ol><li>תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם מוטות אוזניים דו-צדדיים. ודאו כי מוטות האוזניים מישוריים והראש אופקי ויציב.</li>
	<li>יש לחטא את העור שעל הראש על ידי ניגוב מספר פעמים עם יודופור ואחריו אלכוהול בתנועה מעגלית. לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתך קטן של כ 1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>נגבו את הגולגולת עם צמר גפן טבול במי חמצן של 1% עד שנחשפו הברגמא, למבדה והפונטנלה האחורית. הניחו את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי. הערה: השתמש במי חמצן בזהירות והימנע מלגעת ברקמות הסובבות אותה.</li>
	<li>הקפידו על מיקום אופקי של ראש החיה (מלפנים ומאחור ושמאל וימינה).<ol><li>התאם את ידית ציר ה- Z של המסגרת הסטריאוטקסית כך שקצה המחט והגולגולת פשוט יגעו ללא כיפוף, ולאחר מכן מדוד את קואורדינטת ציר ה- Z. בדוק את קואורדינטות Z של bregma ופונטנל אחורי.</li>
		<li>התאם את מוט האוזן כך שההפרש בין קואורדינטות Z של bregma לבין פונטנל אחורי הוא לא יותר מ- 0.02 מ"מ. לאחר מכן, בצע את אותה שיטה כדי למדוד את קואורדינטות Z של המיקומים המתאימים בצד שמאל וימני של קו האמצע. התאם את מוט האוזן כדי לוודא שהשמאל והימני נמצאים באותה רמה.</li>
	</ol></li>
	<li>אתר את הקורפוס קלוסום. הגדר את מקור ה- XYZ ל- bregma. הערה: אתר ההזרקה הראשון הוא 1.0 מ"מ רוחבי לברגמה, עומק 2.4 מ"מ ו-1.1 מ"מ קדמי. אתר ההזרקה השני הוא 1.0 מ"מ רוחבי לברגמה, עומק 2.1 מ"מ ו-0.6 מ"מ קדמי. לדוגמה, הקואורדינטות של הברגמה הן (0,0,0). מדוד את קואורדינטות Z של המיקום המתאים המסומן כ- (-1, 1.1, X) ו- (-1, 0.6, Y). ניתן לקבוע כי קואורדינטת אתר ההזרקה הראשונה של קורפוס קלוסום היא (-1, 1.1, −[X + 2.4]), ואתר ההזרקה השני הוא (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).</li>
	<li>לאחר קביעת אתר ההזרקה, יש להטביע חותם עם סמן סטרילי על הגולגולת ולרשום את הקואורדינטות.</li>
	<li>קודחים בעדינות את האתר המסומן באמצעות מקדחת גולגולת (ראו טבלת חומרים). הקפידו למנוע דימום.</li>
	<li>הזיזו באיטיות את המחט לקואורדינטות הנתונות והתחילו את ההזרקה. כדי לגרום לקורפוס קלוסום דמילינציה, הזריקו 2 μL של תמיסת LPC (שלב 1.) בכל אתר הזרקה (שלב 3.5.) בקצב של 0.4 μL/min.</li>
	<li>לאחר ההזרקה, שמור את המחט בכל אתר למשך 10 דקות נוספות. הערה: ודא שהמרווח של שתי זריקות הוא לא יותר מ -20 דקות.</li>
	<li>לתפור את העור עם תפר 4-0 ולחכות שהחיה תתעורר תוך 10 דקות. ניהול משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם לתקנות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים. הערה: ניתן לקבוע את הזמן המומלץ להמתת חסד בהתאם למטרת הניסוי.</li>
</ol>4. מיצוי דגימה לדה-מילינציה מוקדית
הערה: לפרטים אודות שלב זה, עיין בדוח14 שפורסם בעבר.
<ol><li>ממיסים צבע אדום נייטרלי (ראו טבלת חומרים) בתמיסה של 1% בתמיסה של 1% בתמיסת מלח עם חציית פוספט (PBS).</li>
	<li>שעות לפני הקרבת העכברים (לפרטים, ראו הפניה קודמת10), הזריקו 500 μL של 1% צבע אדום נייטרלי ב-PBS על ידי הזרקה תוך-צפקית לכל עכבר.</li>
	<li>בצעו פרפוזיה לבבית12 עם 30 מ"ל של 0.1% PBS מצופה מראש ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>פורסים את המוח ל-1 מ"מ עם תבנית מוח (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>דמיינו את הנגע המוכתם באדום נייטרלי מתחת למיקרוסקופ ונתקו את הנגע. הערה: הסר כמה שיותר רקמות נורמליות מסביב כדי לשפר את הדיוק של הניתוח הבא. ניתן לבחון את רקמת הנגע באמצעות RT-PCR, מיקרוסקופיית אלקטרונים וניתוחי כתמים מערביים.</li>
</ol>5. צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנציה
<ol><li>עבור צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנציה12, לאחר זלוף לב (שלב 4.3.), להסיר את המוח10, לתקן 4% PFA לילה (ב 4 מעלות צלזיוס), ולהתייבש לחלוטין ב 30% סוכרוז.</li>
	<li>חותכים למקטעי מוח קורונליים בקוטר 20 מ"מ באמצעות פרוסה קפואה10 בטמפרטורה קבועה (−20 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>השתמשו בפרוסות עבור צביעת לוקסול בכחול מהיר (LFB), אימונופלואורסצנציה וכתם מערבי10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+mechanisms+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).</li>
<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
<li>Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+experimental+models+of+toxin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).</li>
<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
<li>Vorhees, C. V., Williams, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze%3A+Procedures+for+assessing+spatial+and+related+forms+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.</a> Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).</li>
<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality).</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
<li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model+for+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavica.+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).</li>
<li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model%3A+Dos+and+do+nots%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model: Dos and do nots.</a> Cells. 9 (4), 843(2020).</li>
<li>Torre-Fuentes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+%28Barcelona%2C+Spain%29%22%5BJournal%5D)">Experimental models of demyelination and remyelination.</a> Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).</li>
<li>Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+common+marmoset+reflects+the+immunopathology+of+pattern+II+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions.</a> Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).</li>
<li>Ucal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+cortical+demyelination+of+both+hemispheres+can+be+induced+by+injection+of+pro-inflammatory+cytokines+via+an+implanted+catheter+in+the+cortex+of+MOG-immunized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats.</a> Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טרשת נפוצה, מחלה כרונית של מערכת העצבים המרכזית, היא אחד הגורמים השכיחים ביותר לתפקוד נוירולוגי של מבוגרים צעירים בני20. מבחינה קלינית, כ-60%-80% מחולי הטרשת הנפוצה חווים את מעגל ההישנות וההפוגות לפני שהם מפתחים טרשת נפוצה משנית-מתקדמת21,22, ובסופו של דבר היא מובילה לליקויים בתנועה מצטברים ולליקויים קוגניטיביים לאורך זמן23. נכון לעכשיו, אין מודל ניסיוני אחד המכסה את כל מגוון המאפיינים הקליניים, הפתולוגיים או החיסוני...

איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן כולל תהליכים פיזיולוגיים מגוונים של כמעט כל מערכות האיברים1. במערכת העצבים המרכזית (CNS), איתות זה ממלא תפקיד קריטי בפתוגנים של מחלות נוירולוגיות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה (MS). טרשת נפוצה היא הפרעה כרונית בתיווך מערכת החיסון המאופיינת בדה-מיאלינציה פתולוגית ובתגובה דלקתית, הגורמת לתפקוד לקוי נוירולוגי ולפגיעה קוגניטיבית 2,3. לאחר הישנות מתמשכת והעברה במהלך המחלה המוקדמת, רוב החולים מתקדמים בסופו של דבר לשלב המשני-מתקדם, מה שעלול לגרום נזק בלתי הפיך למוח ולנכות 4 וכתוצאה מכך לנכות4. הוא האמין כי סימן ההיכר הפתולוגי של הקורס המשני-פרוגרסיבי הוא demyelinating פלאקים הנגרמים על ידי נגעים דלקתיים5. טיפולים קיימים בטרשת נפוצה יכולים להפחית באופן משמעותי את הסיכון להישנות המחלה. עם זאת, עדיין אין טיפול יעיל לנזקי דה-מילינליזציה ארוכי טווח הנגרמים על ידי טרשת נפוצה6 מתקדמת. לפיכך, נדרש מודל מבוסס ביציבות וניתן לשחזור בקלות כדי לחקור טיפולים פרה-קליניים המתמקדים בניוון החומר הלבן.
Demyelination ו remyelination הם שני תהליכים פתולוגיים עיקריים בפיתוח טרשת נפוצה. Demyelination הוא אובדן של נדן מיאלין סביב אקסונים המושרה על ידי מיקרוגליה עם פנוטיפים פרו דלקתיים7, וזה מוביל הולכה איטית של דחפים עצביים ומביא לאובדן נוירונים והפרעות נוירולוגיות. רמילינציה היא תגובת תיקון אנדוגנית המתווכת על ידי אוליגודנדרוציטים, שבה הפרעות עלולות להוביל לניוון עצבי ולפגיעה קוגניטיבית8. התגובה הדלקתית חיונית לכל התהליך, ומשפיעה הן על מידת הנזק למיאלין והן על התיקון.
לפיכך, מודל חייתי יציב של דה-מילינציה דלקתית מתמשכת הוא בעל משמעות להמשך חקירה של אסטרטגיות טיפוליות לטרשת נפוצה. בשל המורכבות של טרשת נפוצה, סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקות נגעים דה-מיאליננטים in vivo, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE), מודלים רעילים-דמילינה, קופריזון (CPZ) וליזופוספטידילכולין (LPC)9 . LPC הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים במיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. בהתבסס על דוחות קודמים ומחקר10,11, פרוטוקול מפורט של הזרקה דו-נקודתית עם כמה שינויים מסופק. באופן כללי, מודל ההזרקה הקלאסי של LPC בנקודה אחת מייצר רק דמילינציה מקומית באתר ההזרקה ומלווה לעתים קרובות ברמילינציה ספונטנית12,13. עם זאת, מודל ההזרקה הדו-נקודתית של LPC יכול להדגים כי ה-LPC יכול לגרום ישירות לדה-מילינציה בקורפוס קלוסום של העכבר ולגרום לדמילינציה עמידה יותר עם מעט התחדשות מיאלין.

<table><tbody><tr><td>L-&alpha;-Lysophosphatidylcholine מחלמון</td><td>ביצה Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32 מד מחט</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l מזרק</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>מקדחת גולגולת במהירות גבוהה</td><td>חזקה, קוריאה</td><td>חזקה 204</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Hager & Meisinger, גרמניה&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx Animal Aneathesia Ventilator</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי נייד לתגמול עכבר</td><td></td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>תגמול מזרק מיקרו</td><td></td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL מהיר bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>עובש מוח</td><td>פרס</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>מקבע מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>Servicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אדום ניטרלי (CI 50040), למיקרוסקופיה Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חלבון בסיסי אנטי-מיאלין&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 נוגדן חד שבטי (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; מדעי</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>בטא אקטין נוגדן חד שבטי</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-IG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חלבון בסיסי מיאלין נוגדן פוליקלונלי</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 נוגדן פוליקלונלי</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; אפיניפיור&nbsp; חמור נגד ארנב&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat Anti-Rat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>אלקסה פלואור 594&nbsp; AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>אבקלונלי</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP עז נגד עכבר IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>בוגר C57BL/6 עכברים זכרים ונקבות</td><td>הונאן SJA מעבדה בעלי חיים בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן תורם לפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות מגוונות, במיוחד טרשת נפוצה (MS). ליזופוספטידילכולין (LPC) הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים של המיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט להזרקת LPC סטריאוטקטית דו-נקודתית שעלולה לגרום ישירות לדה-מילינציה חמורה ולשכפל את הפגיעה הניסיונית בדה-מילינציה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי. לפיכך, מודל זה רלוונטי מאוד למחלות דמילינציה, במיוחד טרשת נפוצה, והוא יכול לתרום למחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. כמו כן, שיטות הכתם הכחולות המהירות של לוקסול ולוקסול שימשו לתיאור מהלך הזמן של דה-מילינציה בקורפוס קלוסום של עכברים שהוזרקו להם LPC. בנוסף, השיטה ההתנהגותית שימשה להערכת התפקוד הקוגניטיבי של עכברים לאחר מודלים. באופן כללי, הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית היא שיטה יציבה וניתנת לשחזור ליצירת מודל דה-מילינציה בעכברים לצורך מחקר נוסף.

הזרקה דו-נקודתית של ה-LPC הביאה לדה-מילינציה עמידה יותר LPC מוביל בעיקר לנזק מהיר עם רעילות למילין ומחשוף של שלמות האקסון15. יום ההזרקה נחשב ליום 0. העכברים הוחזקו לתקופה של 10-28 ימים (10 dpi ו-28 dpi). לוקסול צביעה כחולה מהירה (LFB)10 שימשה להערכת אזור הדמילינציה בעכברים בנקודות זמן אלה. במודל ההזרקה הדו-נקודתית, הייתה דמילינציה משמעותית ב-10 dpi בהשוואה לקבוצת ה-sham, מה שמראה כי הזרקה מקומית של LPC יכולה לנטרל בהצלחה את הקורפוס קלוסום. רמה גבוהה יחסי...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

המודל שלנו רלוונטי מאוד למחלות דה-מיאלינציה, במיוחד טרשת נפוצה. וזה יכול לתרום לקידום המחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. זהו פרוטוקול מפורט שעלול לגרום באופן ישיר לדה-מיאלינציה חמורה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי.כשאתם מנסים את הטכניקה הזו בפעם הראשונה, היו סבלניים וודאו שהקואורדינטות מדויקות. התחל על ידי חיבור מחט 32 מד מזרק 5 microliter. למשוך 5 microliters של פתרון LPC להכנת ההזרקה.לאחר מכן, לאשר את עומק ההרדמה של העכבר על ידי חוסר רפלקס צביטה הבוהן בעוד הנשימה חלקה. מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית כשהצד הגבי כלפי מעלה, והדק את הראש באמצעות חרוט אף ומהדק שיניים. תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם פסי אוזניים דו-צדדיים.ודאו שפסי האוזניים ישרים והראש אופקי ויציב. לחטא את עור הראש על ידי ניגוב עם יודופור. לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתך קטן לכ -1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.נגבו את המיומנות עם צמר גפן טבול ב-1% מי חמצן עד שהברגמה, הלמבדה והפונטנל האחורי ייחשפו. מניחים את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי. ודא את המיקום האופקי של ראש החיה, ולאתר את קורפוס callosum.לאחר קביעת אתר ההזרקה, להקליט את הקואורדינטות, ולעשות סימן עם סמן על הגולגולת. קדח בעדינות את האתר המסומן עם מקדחת גולגולת. היזהר כדי למנוע כל דימום.הזיזו באיטיות את המחט לקואורדינטות הנתונות. כדי לגרום לדה-מיאלינציה של קורפוס קלוסום, הזריקו 2 מיקרוליטרים של תמיסת LPC בכל אתר הזרקה בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה. לאחר ההזרקה, לשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.לבסוף, לתפור את העור עם תפר 4-0, ולחכות החיה להתעורר בתוך 10 דקות. התמונה המייצגת מראה את זיהוי לגיונות החומר הלבן באמצעות צביעה כחולה מהירה של לוקסול. מן התוצאות, demyelination יציב של קורפוס callosum ניתן לראות ב 10 ו 28 ימים לאחר ההזרקה.הכימות של אזור הדה-מיאלינציה בנקודות זמן שונות מוצג כאן. באמצעות הכתמה אימונופלואורסצנטית של חלבון בסיסי מיאלין פגום, נצפתה עלייה יוצאת דופן של dMBP בקבוצה המוזרקת LPC ב-10 ימים לאחר ההזרקה, מה שמייצג אובדן מיאלין בקורפוס קלוסום. ניתוח כתמים מערביים של חלבון המיאלין הבסיסי, או MBP, ביטוי הראה אובדן משמעותי של MBP לאחר הזרקת LPC.בטא-אקטין שימש כבקרת הטעינה למדידת הביטוי הבסיסי. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשרות את המבנה האולטרה-מיאלי בקורפוס קלוסום של קבוצת שאם וקבוצה מוזרקת LPC. GST-pi הוא הסמן של תא מבשר אוליגודנדרוציטים, או OPC, הבשלת התמיינות .לאחר 10 ימים של הזרקת LPC, ה-GST-pi ירד בהשוואה לקבוצת ה-sham. יחד עם זאת, יכולת ההתרבות של אוליגודנדרוציטים יכולה לבוא לידי ביטוי על ידי היחס בין התפשטות האוליגודנדרוציטים לבין סך תאי השושלת של אוליגודנדרוציטים. היחס הגבוה יותר מייצג התפשטות רבה יותר של אוליגודנדרוציטים לאחר 10 ימים לאחר ההזרקה.התמונות המייצגות מציגות את מסלול השחייה של העכברים בכל קבוצה, בנוכחות הפלטפורמה ולאחר הסרת הפלטפורמה. התוצאות מצביעות על כך שהזיכרון המרחבי של עכברים שעברו דה-מיאלינט נפגע באופן משמעותי במודל הזרקת LPC בעל שתי הנקודות. בעת ניסיון הליך זה, ודא כי קצב ההזרקה הוא מדויק, ולשמור את המחט בכל אתר במשך 10 דקות נוספות.

a-stably-established-two-point-injection-lysophosphatidylcholine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הסרטון מדגים השראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי על ידי הזרקת שילוב של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים מיאלין ושחפת מיקובקטריום בלתי פעילה. המודל מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני מחלה ולבחון התערבויות טיפוליות.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך של גישה כירורגית לעצב הראייה בחיה מורדמת ואספקה מדויקת של ליסולציטין כדי לגרום לדמיאלינציה מוקדית, יצירת תנאים נוירופתולוגיים למחקר נוסף.

גרימת דמיאלינציה מקומית בעצב הראייה באמצעות ליזולציטין

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

סרטון זה מדגים את היצירה של מודל עכבר דה-מיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקת ליזופוספטידילכולין דו-נקודתית (LPC). גולגולת של עכבר מורדם חשופה. קואורדינטות ההזרקה נקבעות, ונקדח חור כדי לאפשר הזרקות LPC באתרים ממוקדים. LPC גורם לדמיאלינציה מוקדית של נוירונים באמצעות דלקת, בעוד שהזרקה של שתי נקודות מבטיחה את קיימותו.

ביסוס מודל עכבר דמיאלינציה מוקדית באמצעות הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין

סרטון זה מדגים את השיטה להשראת דה-מיאלינציה בתאי עצב בחוט השדרה של עכברים באמצעות זריקות ליזולציטין, ואחריה רמיאלינציה באמצעות נדידה והתמיינות של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים. התהליך פוגע ואז משחזר בהדרגה את העברת האותות העצביים.

דה-מיאלינציה ורמיאלינציה של נוירונים בחוט השדרה של עכברים

מקור: Wang, X. et al., אספקת תרופות מבוססת משאבה אוסמוטית למחקר רמיאלינציה in vivo על מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה למתן תרופות נוירותרפיוטיות באמצעות משאבה אוסמוטית במודל עכבר דמיאליני. שחרור התרופה המבוקר מקדם רמיאלינציה על ידי הפעלת תאים מייצרי מיאלין בקורפוס קלוסום.

 אספקת תרופות נוירותרפיוטיות מבוססות משאבה אוסמוטית במודל עכבר דמיאליני

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

ניתן לעצב מחלות דמיאלינטיות בבעלי חיים על ידי יישום מוקדי של ליזולציטין במערכת העצבים המרכזית. זריקה אחת של ליזולציטין לחוט השדרה של העכבר מייצרת נגע שמתקן באופן ספונטני עם הזמן. המטרה היא לחקור גורמים המעורבים בדה-ורמיאלינציה, ולבדוק חומרים לשיפור התיקון.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר רבייה של חיקוי נרחב של חומר אפור של שתי ההמיספרות הקליפתיות בחולדות אגוטי אפלות זכריות בוגרות. השיטה כוללת השתלה תוך-מוחית של קטטר, חיסון תת-אקליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, והזרקה תוך-מוחית של תערובת ציטוקינים פרו-דלקתית דרך הצנתר המושתל.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

Demyelination מתרחשת במחלות מרובות של מערכת העצבים המרכזית. טכניקה אמינה של אספקת תרופות vivo נחוצה לבדיקות רמיאלין של תרופות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת משאבה אוסמוטית המאפשרת אספקת תרופות לטווח ארוך ישירות לתוך parenchyma המוח ומשפר את הזמינות הביולוגית של התרופה, עם יישום רחב במחקר רמיאלינציה.

משלוח תרופות מבוסס משאבה אוסמוטי למחקר רמיאלינציה In Vivo על מערכת העצבים המרכזית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

למדו את פרוטוקול ההזרקה הדו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין בעכברים ליצירת מודל יציב של דה-מילינציה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני מחלות מיאלין כמו טרשת נפוצה.

הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים

גלה סרטונים נוספים