Name: בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור התנהגות גרביטקסיס בזחלי Caenorhabditis elegans בשלב הדאואר באמצעות שיטת בדיקה בעלת תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מפורט של תחושת כוח הכבידה ומספק תובנות לגבי מערכת הווסטיבולרית ביונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות ל- JHR (#R01 5R01HD081266 ו- #R01GM141493). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). ברצוננו להודות לפראדיפ ג'ושי (UCSB) על תגובת המערכת שלו. ייעוץ סטטיסטי הניתן על ידי UCSB DATALAB.

הזנים המשמשים במחקר הנוכחי הם C. elegans (N2) ו - C. briggsae (AF16) (ראו טבלת חומרים). אוכלוסייה מעורבת של דאוארים שימשה לכל בדיקה.
1. הכנת הלשכה
<ol><li>עבודה במכסה אדים. הגדר את סביבת העבודה עם מבער Bunsen, 1-2 סכיני גילוח, צבת, פינצטה ומשטח חיתוך מפלסטיק (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>עבור כל תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל. הסר את תקע הכותנה מפיפטה אחת עם פינצטה. החזיקו סכין גילוח מעל מבער הבונזן עד שהוא חם בעזרת צבת. השתמשו בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד (איור 1A).</li>
	<li>בעבודה מהירה, מקרבים את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה, וממיסים אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה זה לזה, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים. אם רווחים כלשהם נראים לעין לאחר ההצטרפות, פרקו אותם זה מזה וחזרו על שלב זה (איור 1A,B).</li>
</ol>2. מילוי התאים באגר
<ol><li>הכינו NGM עם 4% אגר לפי נהלי התולעת הסטנדרטיים21. בזמן שהאגר עדיין מותך, מלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטור סרולוגי ושרטוט איטי של התמיסה. אטמו את הקצה עם סרט פרפין לפני הסרת התא מהפיפטור. הניחו את התא שטוח (במקביל לספסל) כדי להתקרר. הערה: כיסוי הבקבוקון בעטיפת דבק (ראו טבלת חומרים) לאחר אוטוקלאבינג מסייע במניעת היווצרות בועות בתמיסה18.<ol><li>כדי למזער את השינויים בעקביות האגר עקב קירור לא אחיד, החזיקו את הפיפטור (ראו טבלת חומרים) במקביל למשטח הספסל תוך כדי שרטוט האגר. הניחו את התאים שטוחים על הספסל ואפשרו לאגר להתקשות לפני המעבר. הערה: ניתן להתאים את אחוז האגר ותוכן המדיה לניסוי. 4% אגר נוקשה יותר מהריכוז של כ-2% המשמש למזיגת צלחות ומונע מתולעים להתחפר דרך המדיום שבידינו. עם זאת, נסיינים אחרים הבחינו בהתנהגות מחילה של תולעים בוגרות בשיעור של עד 9% אגר18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר הקירור, מחממים מקש הקסדצימלי בקוטר 3 מ"מ (או כלי מתכת אחר באותו גודל, ראו טבלת חומרים) מעל מבער בונזן. לחצו אותו בחוזקה לתוך הדופן של כל תא כ-5 מ"מ לצד אחד של קו האמצע, וצרו פתח קטן בפלסטיק (איור 1C). השתמש בלהב מחומם כדי להסיר את הכותנה ואת הקצוות המחודדים של התא ולאטום קצוות אלה עם סרט פרפין. הערה: לאחר ההכנה, יש להשתמש בכל תא תוך יום אחד או לשמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. כסו את כל הפתחים החשופים בסרט פרפין כדי למנוע מהאגר להתייבש.</li>
</ol>3. בידוד זחלי דאואר
<ol><li>10-15 ימים לפני הניסוי, חתכו כל זן על 2-3 צלחות NGM גדולות עם חיידקי OP50 ועטפו בסרט פרפין. לאחר 10-15 ימים, כל צלחת חייבת להיות מורעבת לחלוטין עם אלפי זחלי דאואר שנמצאים על האגר, הקירות והמכסים. הערה: הכינו צלחות מראש באמצעות מתכון OP50 עבה לצפיפות מרבית (ראו טבלת חומרים). היווצרות דאואר יכולה להיות מושרית גם באמצעות שיטות אחרות, כולל תוספת של פרומונים או על ידי גידול בטמפרטורות גבוהות יותר22.</li>
	<li>אסוף תולעים על ידי שטיפת המכסים והצלחות עם מאגר M9 והזרמת התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו בעוצמה של 1,600 x גרם במשך 30-60 שניות בטמפרטורת החדר ושאפו את רוב מאגר M9 באמצעות פיפטה או שואב אבק.</li>
	<li>יש לבודד דאוארים על ידי טיפול עם 1% SDS ואחריו שיפוע ציפה של 30% סוכרוז בעקבות דו"ח20 שפורסם קודם לכן.<ol><li>יש להוסיף תמיסת SDS של 7 מ"ל 1% לכל כדור תולעת. השאירו את התולעים ב- SDS למשך 30 דקות; סובב את הצינורות ברציפות במהלך זמן זה כדי לאפשר אוורור. יש לשטוף 3-5x עם M9 כדי להסיר את חומר הניקוי.</li>
		<li>לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל M9 ואחריו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה ומסוננת 60%. מערבבים היטב, ולאחר מכן צנטריפוגה בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור שיפוע הפרדה.</li>
	</ol></li>
	<li>מלא צינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מ"ל עם 2 מ"ל של חיץ M9. מרסקים את קצוות הפיפטות של פסטר מזכוכית כדי להרחיב את הבור ומשתמשים בפיפטות אלה כדי להעביר את השכבה העליונה של התמיסה (המכילה דאוארים מבודדים) משיפוע הסוכרוז לצינורות החדשים. שטפו את הדאוארים 3-5x עם M9. הערה: בשלב זה יהיו אלפי דאוארים מבודדים בתמיסה. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי או לשמור על אוורור על ידי סיבוב ב-M9 של 5-7 מ"ל למשך הלילה.</li>
</ol>4. הוספת דאוארים לחדר
<ol><li>צנטריפוגות בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ושואפות את רוב תמיסת M9 עם פיפטה או שואב אבק. כדי להעריך את צפיפות התולעים, ספרו ידנית את מספר התולעים בשלוש טיפות נפרדות של 1 μL תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בממוצע של ספירות אלה כדי להעריך את מספר התולעים לכל μL. הערה: ייתכן שחלק מהפיפטורים בנפח קטן לא יוכלו להגיע לתחתית צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל; במקרה זה, טיפה מרוכזת של תולעים ניתן להעביר הראשון חתיכת סרט פרפין.</li>
	<li>חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 10, 20 או 200 μL כדי להרחיב את הבור. הגדר את המיקרופיפטה לנפח מעט גדול יותר מנפח השאיפה המיועד. שאפו כ-1-2 מיקרון של תמיסת התולעים המרוכזת (באופן אידיאלי בין 100-300 תולעים) ואפשרו לכמות קטנה של אוויר להיכנס לקצה. הערה: מספר גדול של תולעים (1,000+) בתא אחד עשוי להגדיל את טווח המרחקים שעברו עקב צפיפות9.</li>
	<li>דחפו בעדינות את קצה הפיפטה לתוך האגר תוך כדי דיכוי המיקרופיפטה. פעולה זו תיצור אתר הזרקה באגר מבלי לסתום את הקצה. משחררים את התולעים לתוך האגר. השתמשו בסרט פרפין כדי לאטום את הפתח.</li>
</ol>5. ריצה וניקוד הבדיקה
הערה: ניתן לבדוק גרביטקסיס בתנאים שונים שעשויים להשפיע על התנהגות9.
<ol><li>כדי למנוע כמה שיותר משתנים, מקמו את התאים בתוך כלוב פאראדיי חשוך (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תייג כל תא ותלה אותו אנכית בתוך כלוב פאראדיי (בצע זאת באמצעות סרט תיוג). בדוק בקרות אופקיות במקביל על ידי הנחת חלק מהתאים שטוחים באותם תנאים סביבתיים. בדוק את הזנים הניסיוניים נגד תולעי N2 בכיוון אנכי כבקרה חיובית. השתמש בתאים אופקיים המכילים דאוארים N2 כבקרה שלילית נוספת. הערה: יש לבצע בדיקות אופקיות ואנכיות באותה הגדרה בתוך המעבדה כדי למזער את השונות הסביבתית בין שני התנאים. ניתן להשתמש באינקובטור גדול כדי לשכן את שני כלובי פאראדיי.</li>
	<li>דאוארים מתחילים להתפזר מאתר ההתחלה לאחר מספר שעות ולוקח כמה שעות להגיע לשני קצות החדר. השאירו את התאים ללא הפרעה במהלך תקופה זו והבקיע תוך 12-24 שעות לאחר ההזרקה. הערה: אין להשתמש במשותק (כגון נתרן אזיד) כדי לשתק תולעים שהגיעו לקצות התאים. מכיוון שההתפלגות הכוללת של התולעים נמדדת במקום מדד העדפה (כמו בבדיקה של שתי אפשרויות), נתרן אזיד הוא מיותר ועלול לשנות את התוצאות.</li>
	<li>הסר והבקיע תאי גרביטקסיס בזה אחר זה. חפשו דאוארים חיים מתחת למיקרוסקופ מנתח וסמנו את מיקומם בדיו (איור 1C,D). אין לדרג תולעים בטווח של 2.5 ס"מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה, מכיוון שתולעים אלה אינן צפויות להפגין העדפה כיוונית.<ol><li>כמו כן, הימנעו מניקוד תולעים שנראות מתות או לכודות בנוזל. יש להשליך את כל התאים המכילים >50% תולעים מתות או תולעים שוחות. הערה: לאחר הסרת התא מאזור הבדיקה, יש לדרג אותו מיד לדיוק. דאוארים חייבים להיות גלויים רק בין פני השטח של האגר לבין קיר הפיפטה. אם נצפתה התנהגות מחילה, שקול להגדיל את ריכוז האגר במבחנים עתידיים.</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לכמת את התוצאות, השתמש בסמן כדי לחלק כל מחצית של התא לשבעה חלקים של 3.5 ס"מ החל ממרחק של 2.5 ס"מ ממקום ההזרקה (בחלק מהפיפטות, 3.5 ס"מ = 1 מ"ל נפח). השתמש במונה ידני (ראה טבלת חומרים) כדי לספור את מספר התולעים שנצפו בכל סעיף. הערה: צריכים להיות שבעה חלקים בכל צד של המקור, אשר ניתן למספר מ -7 (למטה) ל +7 (למעלה). מספרים אלה חייבים להתאים לאותם מיקומים יחסיים בהתבסס על האופן שבו נבנו התאים; אגר נמשך מהקצה -7 לקצה +7 בשלב 2.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

השוואה עם שיטות קודמות שלא כמו כימוטקסיס, לא ניתן לצפות באופן מהימן בגרביטקסיס בקאנורהבדיטיס באמצעות תכנון ניסיוני מסורתי של צלחת אגר. קוטרה של צלחת פטרי סטנדרטית הוא 150 מ"מ, וכתוצאה מכך רק 75 מ"מ זמינים בשני הכיוונים עבור דאוארים כדי להדגים את העדפת הגרביטקסיס. למרות שניתן לבחון את העדפת האוריינטציה של C. elegans בתמיסה12, שיטה זו היא תפוקה נמוכה מכיוון שיש לנתח תולעים בזו אחר זו. בנוסף, העדפות והתנהגויות גרביטקטיות עשויות להיות שונות בין תולעים המרחפות במדי...

חישת כוח המשיכה של כדור הארץ חיונית להתמצאות, לתנועה, לקואורדינציה ולאיזון של אורגניזמים רבים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והנוירו-מעגלים של תחושת הכבידה אינם מובנים היטב בהשוואה לחושים אחרים. אצל בעלי חיים, תחושת הכבידה מתקשרת עם גירויים אחרים ויכולה להיות מוגברת על ידי גירויים אחרים כדי להשפיע על ההתנהגות. ניתן לשלב רמזים חזותיים, משוב פרופריוצפטיבי ומידע שיווי משקל כדי ליצור תחושה של מודעות לגוף ביחס לסביבתו של בעל החיים 1,2. לעומת זאת, ניתן לשנות את העדפת הכבידה בנוכחות גירויים אחרים 3,4,5. לכן, התנהגות כבידתית היא אידיאלית לחקר תחושת הכבידה ולהבנת האינטגרציה החושית המורכבת של מערכת העצבים וקבלת ההחלטות.
C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי במיוחד לחקר גרביטקסיס בגלל מחזור החיים הפוליפני שלו. כאשר הם נחשפים לגורמי עקה במהלך ההתפתחות, כולל חום, צפיפות או מחסור במזון, זחלי C. elegans מתפתחים לדאוארים, שהם עמידים מאוד ללחץ6. בתור דאוארים, תולעים מבצעות התנהגויות אופייניות, כגון ניקוטציה, שבה תולעים "עומדות" על זנבן ומנופפות בראשן, שעשויות להקל על פיזור לבתי גידול טובים יותר7. מבחני גרביטקסיס של C. elegans ו- C. japonica מצביעים על כך שזחלי דאואר הם בעלי כבידה שלילית, וכי התנהגות זו נצפית בקלות רבה יותר אצל דאוארים מאשר אצל מבוגרים 8,9. בדיקת גרביטקסיס בזנים אחרים של Caenorhabditis עשויה לגלות שונות טבעית בהתנהגות הכבידה.
מנגנונים לתחושת הכבידה אופיינו באוגלנה, דרוזופילה, סיונה ומינים שונים אחרים באמצעות מבחני גרביטקסיס 3,10,11. בינתיים, מחקרי גרביטקסיס ב- Caenorhabditis סיפקו בתחילה תוצאות מעורבות. מחקר על העדפת האוריינטציה של C. elegans מצא כי תולעים מכוונות עם ראשן למטה בתמיסה, מה שמרמז על העדפה גרביטקטית חיובית12. בינתיים, למרות ש-C. japonica dauers זוהו בשלב מוקדם כבעלי כבידה שלילית8, התנהגות זו תוארה רק לאחרונה ב-C. elegans9. מספר אתגרים מתעוררים בפיתוח בדיקת גרביטקסיס מייצגת בתולעים. זני Caenorhabditis נשמרים על צלחות אגר; מסיבה זו, מבחנים התנהגותיים משתמשים בדרך כלל בלוחות אגר כחלק מתכנון הניסוישלהם 13,14,15. בדיקת הכבידה המוקדמת ביותר שדווחה ב- Caenorhabditis בוצעה על ידי העמדת צלחת על צדה בזווית של 90° ללוח הבקרה האופקי8. עם זאת, התנהגות גרביטקסיס אינה תמיד חזקה בתנאים אלה. בעוד שניתן לבחון תולעים בוגרות להעדפה אוריינטלית בתמיסה12, העדפה כיוונית זו עשויה להיות גם תלוית הקשר, מה שמוביל להתנהגויות שונות אם התולעים זוחלות במקום לשחות. בנוסף, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל אור ושדות אלקטרומגנטיים16,17, אשר מפריעים לתגובותיהם לכוח הכבידה9. לכן, מבחן גרביטקסיס מעודכן המגן מפני משתנים סביבתיים אחרים חשוב לניתוח המנגנונים של תהליך חושי זה.
בפרוטוקול הנוכחי מתוארת בדיקה לתצפית על Caenorhabditis gravitaxis. המערך למחקר זה מבוסס בחלקו על שיטה שפותחה כדי לחקור שלמות נוירומוסקולרית18,19. זחלי דאואר מתורבתים ומבודדים באמצעות נהלים סטנדרטיים20. לאחר מכן הם מוזרקים לתאים העשויים משני פיפטות סרולוגיות של 5 מ"ל מלאות באגר. תאים אלה יכולים להיות מכוונים אנכית או אופקית וממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך למשך 12-24 שעות כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. מיקומה של כל תולעת בתאים נרשם ומושווה למוניות האנכיות של זן ייחוס כגון C. elegans N2.

<table><tbody><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>נתרן דודציל סולפט 1%</td><td>מהמלאי 10% (w/v) SDS במי DI</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"מ מפתח</td><td></td><td></td> משושה ניתן <td>להשתמש בכלי מתכת אחרים בגודל דומה 4</td></tr><tr><td>% אגר במדיום גידול רגיל (NGM) - 1 ליטר</td><td></td><td></td><td>לפני חיטוי: 3 גרם NaCl, 40 גרם אגר, 2.5 גרם פפטון, 2 גרם דקסטרוז, 10 מ"ל אורציל (2 מ"ג/מ"ל), 500 &mu; L כולסטרול (10 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל CaCl2, 962 מ"ל DI מים; לאחר חיטוי: 24.5 מ"ל מאגר פוספט, 1 מ"ל 1 מ"ג SO4 (1 מ'), 1 מ"ל סטרפטומיצין (200 מ"ג/מ"ל)</td></tr> <tr><td>5 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>פישרברנד</td><td>S68228C</td><td>פוליסטירן, לא זכוכית בורוסיליקט</td></tr><tr><td>60% תמיסת</td><td></td><td></td> סוכרוז קרה <td>60% סוכרוז (w/v) במי DI; עיקור על ידי סינון (0.45 &mu; מסנן m). שמור על 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae או זן</td><td></td><td></td> ניסיוני אחר <td>זמין מ-CGC (המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis)</td></tr><tr><td>מבער</td><td></td><td></td><td></td>בונסן</tr><tr><td>עטיפה נצמדת</td><td>פישרברנד</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>קלינית</tr><tr><td>סכיני גילוח חד פעמיים</td><td>פישרברנד</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>ניתן לבנות כלוב פאראדיי</td><td>באמצעות קרטון ונייר אלומיניום; 30 אינץ' L x 6 אינץ' רוחב x 26 אינץ' H או סמני</td>דיו גדולים יותר Sharpie או מותג אחר לסימון על פלסטיק סרט תיוג Carolina 215620 M9 מאגר 22 מ"מ KH2PO4,<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 42 מ"מ Na2HPO4, 86 מ"מ NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans זן</td><td></td><td></td><td>זמין ב-CGC (המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis)</td></tr> <tr><td>NGM עם OP50</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) אגר ב-NGM (ראה תיאור: 4% אגר ב-NGM). זרע עם סרט פרפין OP50</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>קרש</td><td></td><td></td><td></td>חיתוך פלסטיק</tr><tr><td>צבת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבל אנכי מסתובב</td><td>BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>עם מוט צינור 22 x 15 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטור סרולוגי</td><td>קורנינג</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Tally counter</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>מדיה עבה של צלחת NGM/אגר - 1 ליטר</td><td></td><td></td><td>ראה 4% אגר במתכון NGM; החלף 40 גרם אגר ב-20 גרם</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td></tr> אגר</tbody></table>

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי caenorhabditis dauer

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

תחושת הכבידה היא תהליך חשוב ויחסית לא מובן מאליו. חישת כוח המשיכה מאפשרת לבעלי חיים לנווט בסביבתם ומקלה על התנועה. בנוסף, תחושת הכבידה, המתרחשת באוזן הפנימית של היונקים, קשורה קשר הדוק לשמיעה - ולכן, להבנת תהליך זה יש השלכות על מחקר שמיעתי ושיווי משקל. מבחני גרביטקסיס קיימים עבור כמה אורגניזמי מודל, כולל דרוזופילה. תולעים בודדות נבדקו בעבר על העדפת האוריינטציה שלהן כשהן שוקעות בתמיסה. עם זאת, בדיקה אמינה וחזקה עבור Caenorhabditis gravitaxis לא תואר. הפרוטוקול הנוכחי מתווה הליך לביצוע מבחני גרביטקסיס שניתן להשתמש בהם כדי לבחון מאות דאוארים של Caenorhabditis בכל פעם. בדיקה ארוכת טווח בקנה מידה גדול זו מאפשרת איסוף נתונים מפורט, וחושפת פנוטיפים שעלולים להתפספס בבדיקה סטנדרטית מבוססת צלחת. תנועת דאואר לאורך הציר האנכי מושווית לבקרות אופקיות כדי להבטיח שהטיית הכיוון נובעת מכוח הכבידה. לאחר מכן ניתן להשוות את העדפת הכבידה בין זנים או תנאי ניסוי. שיטה זו יכולה לקבוע דרישות מולקולריות, תאיות וסביבתיות עבור גרביטקסיס בתולעים.

השוואת גרביטקסיס בין מינים שונים בעקבות ההליך המתואר לעיל, C. briggsae dauer gravitaxis ניתן להשוות עם C. elegans gravitaxis ובקרות אופקיות. ההתפלגות האנכית (maroon) של C . briggsae dauers מוטה לכיוון צמרות התאים, כאשר אחוז גדול של תולעים מגיע ל-+7 (איור 2A). בניגוד לבקרות אופקיות (אקווה), שבהן הדאוארים מפוזרים בעקומה בצורת פעמון בערך סביב מרכז התאים, מגמה זו מצביעה על התנהגות כבידתית שלילית. ניתן להשוות את הנתונים האלה עם C . elegans g...

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטות לביצוע בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול עם זחלי Caenorhabditis dauer. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי טוב יותר של התנהגות גרביטקסיס בהשוואה לבדיקה מבוססת צלחת.

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

ניתן להשתמש בבדיקת תפוקה גבוהה זו כדי לצפות בהתנהגות גרביטקטית חזקה בזחלי caenorhabditis dauer. התנהגות התולעים נצפית על פני מרחקים גדולים בהשוואה למבחנים המבוצעים על צלחת פטרי. זה משפר את הרגישות של הבדיקה ומאפשר ניתוח נתונים מפורט.חקר התנהגות גרביטקסיס יכול לספק תובנה לגבי האופן שבו תחושת הכבידה מתרחשת בקאנורהבדיטיס, שיש לה רלוונטיות להבנת מערכת שיווי המשקל של יונקים. יצירת תאי הבדיקה של גרביטקסיס, בידוד דאוארים והזרקת התולעים לתוך התאים דורשת תרגול. אתה יכול לחסוך זמן על ידי בידוד הדאוארים ויצירת התאים יום מראש.התחילו בהתקנת מבער בונזן, סכין גילוח אחד עד שניים, צבתות, פינצטה, משטח חיתוך מפלסטיק ומכסה אדים. כדי ליצור תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מיליליטר, ועם פינצטה, להסיר את תקע כותנה מפיפטה אחת. החזיקו סכין גילוח באמצעות צבת מעל מבער הבונזן עד לקבלת תערובת חמה.השתמש בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד. כעת, קרבו במהירות את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה והמיסו אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה עליהם, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים.אם רווחים כלשהם גלויים לאחר ההצטרפות, נתק אותם זה מזה וחזור על שלב זה. הכינו NGM עם 4% אגר על פי נהלי התולעת הסטנדרטיים ומלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטר סרולוגי בזמן ש

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

C. התנהגות הטלת ביצים של elegans יכולה לספק מידע חשוב במחקרים התפתחותיים, פוריותיים ואנטומיים. סרטון זה מציג את השלבים החשובים של בדיקת הטלת ביצים ומציג ניסוי לדוגמה שבו תרופה נבדקת לרעילות רבייה.

בדיקת הטלת ביצים: שיטה לכימות התנהגות הטלת הביצים של C. elegans

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

הדמיית התנהגות ופעילות עצבית לאורך זמן ארוך ללא קיבוע של החיה היא תנאי מוקדם להבנת התנהגות. ניתן להשתמש בהדמיית תאים מיקרופלואידיים של אגרוז (AMI) כדי לדמות פעילות עצבית והתנהגות עבור כל שלבי החיים של Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

כדי להשתמש ב- Caenorhabditis elegans (C. elegans) במחקר omics, יש צורך בשיטה כדי ליצור אוכלוסיות גדולות של תולעים שבהן ניתן למדוד מדגם יחיד על פני פלטפורמות לניתוחים השוואתיים. כאן מוצגת שיטה לתרבות C. elegans אוכלוסיות על לוחות תרבות בקנה מידה גדול (LSCPs) ולתעד את גידול האוכלוסייה.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

חקור התנהגות גרביטקסיס בזחלי Caenorhabditis elegans בשלב הדאואר באמצעות שיטת בדיקה בעלת תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מפורט של תחושת כוח הכבידה ומספק תובנות לגבי מערכת הווסטיבולרית ביונקים.

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

גלה סרטונים נוספים